Se presenta un procedimiento para visualizar las actividades de proteína quinasa A en ratones que se fijan en la cabeza y se comportan. Un reportero mejorado de actividad de A-quinasa, tAKAR, se expresa en las neuronas corticales y se hace accesible para la toma de imágenes a través de una ventana craneal. La microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones se utiliza para visualizar las actividades de PKA in vivo durante la locomoción forzada.
La neuromodulación ejerce un poderoso control sobre la función cerebral. La disfunción de los sistemas neuromoduladores da lugar a trastornos neurológicos y psiquiátricos. A pesar de su importancia, las tecnologías para rastrear eventos neuromoduladores con resolución celular están empezando a surgir. Los neuromoduladores, como la dopamina, la noradrenalina, la acetilcolina y la serotonina, desencadenan eventos de señalización intracelular a través de sus respectivos receptores acoplados a proteínas G para modular la excitabilidad neuronal, las comunicaciones sinápticas y otras regulando así el procesamiento de la información en la red neuronal. Los neuromoduladores mencionados anteriormente convergen en la vía adentro/proteína quinasa A (PKA). Por lo tanto, la imagen de PKA in vivo con resolución de una sola célula se desarrolló como una lectura para eventos neuromoduladores de una manera análoga a las imágenes de calcio para actividades eléctricas neuronales. En este documento, se presenta un método para visualizar la actividad de PKA a nivel de neuronas individuales en la corteza de ratones que se comportan por la cabeza fija. Para ello, se utiliza un reportero mejorado de actividad De la A-quinasa (AKAR), llamado tAKAR, que se basa en la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET). Este sensor PKA genéticamente codificado se introduce en la corteza motora a través de la electroporación utero (IUE) de plásmidos de ADN, o inyección estereotaxcócica de virus asociado a adeno (AAV). Los cambios de FRET se utilizan mediante la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones (2pFLIM), que ofrece ventajas sobre las mediciones ratiométricas de FRET para cuantificar la señal FRET en el tejido cerebral de dispersión de luz. Para estudiar las actividades de PKA durante la locomoción forzada, el tAKAR se imagea a través de una ventana craneal crónica por encima de la corteza de ratones despiertos fijos en la cabeza, que corren o descansan en una cinta de correr motorizada con control de velocidad. Este enfoque de diagnóstico por imágenes será aplicable a muchas otras regiones cerebrales para estudiar las actividades de PKA inducidas por el comportamiento correspondientes y a otros sensores basados en FLIM para imágenes in vivo.
La neuromodulación, también conocida como transmisión sináptica lenta, impone un fuerte control sobre la función cerebral durante diferentes estados conductuales, como el estrés, la excitación, la atención y la locomoción1,2,3, 4. A pesar de su importancia, el estudio de cuándo y dónde tienen lugar los eventos neuromoduladores todavía está en su infancia. Neuromoduladores, incluyendo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, y muchos neuropéptidos, activar los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), que a su vez desencadenan las segundas vías mensajeras intracelulares con una amplia ventana de escalas de tiempo que van de segundos a horas. Mientras que cada neuromodulador desencadena un conjunto distinto de eventos de señalización, la vía de la quinasa de campo/proteína A (PKA) es una vía descendente común para muchos neuromoduladores1,5. La vía del campo/PKA regula la excitabilidad neuronal, latransmisión sináptica y la plasticidad 6,7,8,9y, por lo tanto, ajusta la dinámica de la red neuronal. Debido a que diferentes neuronas o tipos neuronales expresan diferentes tipos o niveles de receptores neuromoduladores10, los efectos intracelulares del mismo neuromodulador extracelular pueden ser heterogéneos a través de diferentes neuronas, y por lo tanto, tienen que ser estudiado con resolución celular. Hasta la fecha, sigue siendo difícil monitorear eventos neuromoduladores en neuronas individuales in vivo durante el comportamiento.
Para estudiar la dinámica espaciotemporal de la neuromodulación, se requiere una modalidad de grabación adecuada. La microdiálisis y la voltammetría cíclica de exploración rápida se utilizan con frecuencia para estudiar la liberación de neuromoduladores, pero carecen de la resolución espacial para monitorear los eventos celulares11,12. Análoga a la dinámica de calcio que se utiliza como un proxy para la actividad eléctrica neuronal en la población por imágenes13, la imagen PKA se puede utilizar para leer eventos neuromoduladores a través de una población neuronal a resolución celular. El presente protocolo describe el uso de un reportero mejorado de actividad A-quinasa (AKAR) para monitorear las actividades de PKA in vivo durante el comportamiento animal. El método descrito aquí permite la toma simultánea de imágenes de poblaciones neuronales a resolución subcelular con una resolución temporal que realiza un seguimiento de los eventos neuromoduladores fisiológicos.
Los AKARs están compuestos por un donante y un aceptador de proteínas fluorescentes vinculadas por un péptido de sustrato de fosforilación PKA y un dominio asociado a la cabeza de horquilla (FHA) que se une a la serina fosforilada o trionina del sustrato14,15. Tras la activación de la vía PKA, el péptido de sustrato de AKAR se fosforila. Como resultado, el dominio FHA se une al péptido de sustrato fosforilado, lo que acerca a los dos fluoróforos, denominado salente el estado cerrado de AKAR. El estado cerrado de un AKAR fosforilado da lugar a un aumento de la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) entre el donante y los fluoróforos del donante y del aceptador. Dado que la proporción de AKARs fosforilados está relacionada con el nivel de actividad de PKA16, la cantidad de FRET en una muestra biológica se puede utilizar para cuantificar el nivel de actividad de PKA16,17,18, 19,20.
Las primeras versiones de los AKARs se diseñaron principalmente para imágenes de dos colores ratiométricas14. Al obtener imágenes más profundas en el tejido cerebral, el método ratiométrico sufre de distorsión de la señal debido a la dispersión de luz dependiente de la longitud de onda17,18,21. Como se explica a continuación, la microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) elimina este problema porque FLIM solo mide los fotones emitidos por el fluoróforo18,21. Como resultado, la cuantificación FLIM de FRET no se ve afectada por la profundidad tisular17. Además, se puede utilizar una variante “oscura” (es decir, bajo rendimiento cuántico [QY]) del fluoróforo del aceptador. Esto libera un canal de color para facilitar la medición multiplexada de propiedades neuronales ortogonales a través de imágenes simultáneas de un segundo sensor o un marcador morfológico17,19,20.
Las imágenes FLIM cuantifican el tiempo que un fluoróforo pasa en el estado excitado, es decir, la vida útil de la fluorescencia18. El regreso de un fluoróforo al estado de tierra, por lo tanto el final del estado excitado, a menudo conconcomita con la emisión de un fotón. Aunque la emisión de un fotón para una molécula excitada individual es estocástica, en una población la vida media de fluorescencia es una característica de ese fluoróforo en particular. Cuando una población pura de fluoróforos se excita simultáneamente, la fluorescencia resultante seguirá una sola decadencia exponencial. La constante de tiempo de esta decaimiento exponencial corresponde a la vida útil media de la fluorescencia, que normalmente oscila entre uno y cuatro nanosegundos para las proteínas fluorescentes. El regreso de un fluoróforo de donante excitado al estado de tierra también puede ocurrir por FRET. En presencia de FRET, se reduce la vida útil de fluorescencia del fluoróforo del donante. Los AKARs sin fosforilar exhiben una vida útil de fluorescencia de donante relativamente más larga. Tras la fosforilación por PKA, el sensor exhibe una vida útil más corta porque los fluoróforos del donante y del aceptador se acercan entre sí y se incrementa el FRET. Por lo tanto, la cuantificación de la vida útil de la fluorescencia en una población de AKARs representa el nivel de actividad de PKA.
Las primeras versiones de los AKARs no se han utilizado con éxito para imágenes in vivo con resolución de una sola célula. Esto se debe principalmente a la baja amplitud de la señal de los sensores AKAR a las activaciones fisiológicas17. Recientemente, al comparar sistemáticamente los sensores AKAR disponibles para la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones (2pFLIM), se descubrió que un sensor llamado FLIM-AKAR supera a los sensores alternativos. Además, se desarrollaron una serie de variantes FLIM-AKAR llamadas AKARs (tAKARs) específicas para visualizar la actividad de PKA en ubicaciones subcelulares específicas: microtúbulos (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR), actina filamentosa (tAKAR), membrana (tAKAR), y la densidad postsináptica (tAKAR). Entre los tAKAR, el tAKAR aumentó la amplitud de la señal provocada por la noradrenalina en 2,7 veces. Esto es consistente con el conocimiento de que la mayoría de PKA en las neuronas están ancladas a microtúbulos en el estado de reposo22,23. tAKAR fue el mejor intérprete entre los AKAR existentes para 2pFLIM. Además, el tAKAR detectó actividad de PKA fisiológicamente relevante provocada por múltiples neuromoduladores, y la expresión de tAKAR no alteró las funciones neuronales17.
Recientemente, tAKAR se utilizó con éxito para visualizar las actividades de PKA en ratones de afeitar fijos17. Se demostró que la locomoción forzada desencadenó la actividad de PKA en el soma de las neuronas de capa superficial (capa 1 a 3, hasta una profundidad de 300 m de pia) en el motor, barril y cortices visuales. La actividad de PKA desencadenada por la locomoción dependía en parte de la señalización a través de receptores adrenérgicos y receptores de dopamina D1, pero no fue afectada por un antagonista del receptor de dopamina D2. Este trabajo ilustra la capacidad de los tAKARs para rastrear eventos de neuromodulación in vivo usando 2pFLIM.
En el protocolo actual, todo el método para la creación de imágenes de actividad PKA en ratones despiertos fijos durante un paradigma de locomoción forzado se describe en seis pasos. En primer lugar, la adición de capacidades 2pFLIM a un microscopio convencional de dos fotones (Figura1). En segundo lugar, la construcción de una cinta de correr motorizada (Figura2). En tercer lugar, la expresión del sensor tAKAR en la corteza del ratón por la electroporación utero (IUE) de los plásmidos de ADN, o la inyección estereotaxcócica del virus asociado al adeno (AAV). Se han publicado previamente excelentes protocolos para cirugías para IUE24,25 e inyección estereotaxia de partículas virales26. Los parámetros clave que utilizamos se describen a continuación. En adelante, la instalación de una ventana craneal. Excelentes protocolos han sido publicados previamente para la cirugía de ventana craneal27,28. Se describen varios pasos que se han modificado desde los protocolos estándar. Quinto, actuando in vivo 2pFLIM. En sexto lugar, los análisis de imágenes 2pFLIM (Figura3 y Figura 4). Este enfoque debe ser fácilmente aplicable a muchos otros paradigmas de comportamiento fijos en la cabeza y áreas cerebrales.
Este protocolo demuestra el uso del sensor FRET-FLIM tAKAR para visualizar la actividad PKA activada por neuromodulación en ratones que se comportan en la cabeza fija. Esta aplicación se basa en extensas pruebas y caracterizaciones de tAKAR in vitro e in vivo para demostrar que la señal FLIM obtenida es relevante para eventos neuromoduladores fisiológicos17. Aquí, una aplicación in vivo, la actividad de PKA inducida por la locomoción en la corteza motora, se utiliza para describir los proce…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Sra. Tess J. Lameyer, la Sra. Ruth Frank y el Dr. Michael A. Muniak por sus ediciones y comentarios, y al Dr. Ryohei Yasuda en Max Planck Florida por el software de adquisición 2pFLIM. Este trabajo fue apoyado por dos premios de la Iniciativa BRAIN U01NS094247 (H.Z. y T.M.) y R01NS104944 (H.Z. y T.M.), una concesión R01NS081071 (T.M.) y una concesión R21R2197856 (H.Z.). Todos los premios son del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Estados Unidos.
0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |