Ett förfarande presenteras för att visualisera proteinkinas en verksamhet i huvud-fast, beter möss. En förbättrad A-Kinas aktivitet reporter, tAKARα, uttrycks i kortikala neuroner och göras tillgängliga för avbildning genom en kranial fönster. Två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi används för att visualisera PKA aktiviteter in vivo under påtvingad förflyttning.
Neuromodulation utövar kraftfull kontroll över hjärnans funktion. Dysfunktion av neuromodulatory system resulterar i neurologiska och psykiska störningar. Trots deras betydelse, teknik för att spåra neuromodulatory händelser med cellulära upplösning har precis börjat dyka upp. Neuromodulatorer, såsom dopamin, noradrenalin, acetylkolin, och serotonin, utlösa intracellulära signalering händelser via deras respektive G protein-kopplade receptorer att modulera neuronala retbarhet, synaptisk kommunikation, och andra neuronala och därmed reglera informations bearbetningen i neuronala nätverk. De ovan nämnda Neuromodulatorer konvergera på lägret/proteinkinas A (PKA) väg. Därför utvecklades in vivo PKA Imaging med encellig upplösning som en avläsning för neuromodulatory händelser på ett sätt som motsvarar kalcium avbildning för neuronala elektriska aktiviteter. Häri presenteras en metod för att visualisera PKA aktivitet på nivån för enskilda nervceller i cortex av huvud-fast beter möss. För att göra detta, en förbättrad A-Kinas Activity reporter (AKAR), kallas tAKARα, används, som är baserad på Förster resonans energiöverföring (FRET). Denna genetiskt kodade PKA-sensor introduceras i motoriska cortex via in utero elektroporation (Iue) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injektion av Adeno-associerat virus (AAV). FRET förändringar avbildas med hjälp av två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi (2pflim), som erbjuder fördelar jämfört med ratiometriska fret mätningar för kvantifiera FRET signal i ljus-spridning hjärnvävnad. För att studera PKA verksamhet under påtvingad förflyttning, är tAKARα avbildas genom en kronisk kraniala fönster ovanför cortex av vaken, Head-fast möss, som kör eller vila på en hastighetskontrollerade motordrivna löpband. Denna avbildning tillvägagångssätt kommer att tillämpas på många andra hjärnregioner för att studera motsvarande beteende-inducerad PKA verksamhet och andra FLIM-baserade sensorer för in vivo Imaging.
Neuromodulation, även känd som långsam synaptisk transmission, lägger stark kontroll över hjärnans funktion under olika beteendemässiga tillstånd, såsom stress, upphetsning, uppmärksamhet, och förflyttning1,2,3, 4. Trots sin betydelse, är studiet av när och var neuromodulatory händelser äger rum fortfarande i sin linda. Neuromodulatorer, inklusive acetylkolin, dopamin, noradrenalin, serotonin, och många neuropeptider, aktivera G protein-kopplade receptorer (GPCRs), som i sin tur utlösa intracellulära andra Messenger vägar med ett brett fönster av tidsskalor som sträcker sig från sekunder till timmar. Medan varje neuromodulator utlöser en distinkt uppsättning av signalering händelser, lägret/proteinkinas a (PKA) vägen är en vanlig nedströms väg för många Neuromodulatorer1,5. Lägret/PKA vägen reglerar neuronala retbarhet, synaptisk transmission, och plasticitet6,7,8,9, och därför, Tunes neuronala nätverkdynamiken. Eftersom olika nervceller eller neuronala typer uttrycker olika typer eller nivåer av neuromodulator receptorer10, de intracellulära effekterna av samma extracellulära neuromodulator kan vara heterogena mellan olika nervceller, och därmed, måste studerats med cellulär upplösning. Hittills är det fortfarande utmanande att övervaka neuromodulatory händelser i enskilda nervceller in vivo under beteende.
För att studera den spatiotemporal dynamiken i neuromodulering krävs en lämplig inspelnings modalitet. Mikrodialys och snabb-Scan cyklisk voltammetri används ofta för att studera frisättning av Neuromodulatorer, men de saknar den rumsliga upplösningen för att övervaka cellulära händelser11,12. Analogt med kalciumdynamik som används som en proxy för neuronala elektrisk aktivitet i population Imaging13, PKA Imaging kan användas för att läsa ut neuromodulatory händelser över en neuronala population vid cellulära upplösning. Det nuvarande protokollet beskriver användningen av en förbättrad A-Kinas Activity reporter (AKAR) för att övervaka PKA verksamhet in vivo under djurens beteende. Den metod som beskrivs här möjliggör samtidig avbildning av neuronala populationer vid subcellulära upplösning med en temporala upplösning som spårar fysiologiska neuromodulatory händelser.
Akars består av en donator och en acceptor fluorescerande proteiner kopplade av en PKA fosforylering substrat peptid och en forkhead-associerad (FHA) domän som binder till fosforylerade serin eller treonin av substratet14,15. Vid aktivering av PKA vägen, substrat peptid AKAR är fosforyleras. Som ett resultat, FHA domänen binder till fosforylerade substrat peptid, därmed föra de två fluorofotar i närheten, kallad stängda tillstånd AKAR. Det stängda påstår av fosforyleras Akar resulterar i ökande Förster resonans energiöverföring (FRET) mellan donatorn och acceptoren fluorophores. Eftersom andelen fosforylerade akars är relaterad till nivån för PKA-aktivitet16, kan mängden FRET i ett biologiskt prov användas för att kvantifiera nivån av PKA-aktivitet16,17,18, 19,20.
Tidiga versioner av AKARs var främst konstruerade för tvåfärgad ratiometrisk avbildning14. Vid avbildning djupare in i hjärnvävnaden, den ratiometriska metoden lider av signal förvrängning på grund av våglängd-beroende ljusspridning17,18,21. Som diskuteras nedan, fluorescens livstid Imaging mikroskopi (flim) eliminerar detta problem eftersom flim endast åtgärder fotoner som avges av givaren fluorophore18,21. Som ett resultat, FLIM kvantifiering av FRET påverkas inte av vävnaden djup17. Dessutom kan en “mörk” (dvs. låg Quantum Yield [QY]) variant av acceptorn fluorophore användas. Detta frigör en färgkanal för att underlätta multiplexade mätning av ortogonala neuronala egenskaper via samtidig avbildning av en andra sensor eller en morfologisk markör17,19,20.
FLIM Imaging kvantifierar den tid som en fluorophore tillbringar i upphetsad tillstånd, dvs fluorescensen livstid18. Returen av en fluorophore till det slipat påstår, således avslutar av det upphetsada statligt, ofta samråder med utsläppet av en Photon. Även om utsläppet av en Photon för en upphetsad individ molekyl är Stochastic, i en befolkning är den genomsnittliga fluorescenslivstiden ett kännetecken av det specifika fluorophore. När en ren population av fluoroforer är upphetsad samtidigt, kommer den resulterande fluorescensen följa en enda exponentiell sönderfall. Tidskonstant av detta exponentiellt förfall motsvarar den genomsnittliga fluorescenslivstiden, som vanligtvis sträcker sig från en till fyra nanosekunder för fluorescerande proteiner. Återlämnande av en upphetsad givare fluorophore till marken staten kan också inträffa genom FRET. I närvaro av FRET reduceras fluorescenslivstiden för donatorns fluorofore. Den unphosphorylated AKARs uppvisar en relativt längre givare fluorescens livstid. Vid fosforylering av PKA, uppvisar sensorn en kortare livstid eftersom givaren och acceptorn fluoroforer förs nära varandra och FRET ökas. Kvantifieringen av fluorescenslivstiden i en AKARs-population representerar därför nivån av PKA-aktivitet.
Tidiga versioner av AKARs har inte använts framgångsrikt för in vivo Imaging vid encells-upplösning. Detta är främst tack vare den låga signalamplituden av AKAR-sensorerna till fysiologiska aktiveringar17. Nyligen, genom att systematiskt jämföra tillgängliga Akar sensorer för två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi (2pflim), en sensor som kallas flim-Akar befanns överträffa alternativa sensorer. Dessutom, en serie av flim-Akar varianter kallas riktade akars (takars) utvecklades för att visualisera PKA aktivitet vid specifika subcellulära platser: mikrotubuli (takarα), Cytosol (takarβ), aktin (takarδ), trådformiga aktin (takarε), membran (takarγ), och postsynaptisk densitet (tAKARζ). Bland tAKARs, ökade tAKARα signalamplitud framkallas av noradrenalin av 2,7-faldigt. Detta är förenligt med den kunskap som majoriteten av PKA i nervceller är förankrade till mikrotubuli vid viloläge22,23. tAKARα var den bästa utföraren bland befintliga AKARs för 2pFLIM. Dessutom upptäckte tAKARα fysiologiskt relevant PKA-aktivitet som uppnåddes av multipla Neuromodulatorer, och uttrycket av tAKARα förändrade inte neuronala funktioner17.
Nyligen var tAKARα framgångsrikt används för att visualisera PKA aktiviteter i head-fast beter sig möss17. Det visades att påtvingad Locomotion utlöst PKA aktivitet i Soma av ytliga skikt nervceller (Layer 1 till 3, upp till ett djup av ~ 300 μm från Pia) i motorn, fat, och visuella cortices. Den motoriska utlöst PKA-aktiviteten var delvis beroende av signalering via β-adrenerga receptorer och D1 dopamin-receptorer, men påverkades inte av en dopamin receptor antagonist med D2. Detta arbete illustrerar förmågan hos takarer att spåra neuromodulering händelser in vivo med 2pflim.
I det aktuella protokollet beskrivs hela metoden för PKA-aktivitetsavbildning i head-fast vaken möss under ett påtvingat rörelse paradigm i sex steg. Först tillägg av 2pFLIM kapacitet till en konventionell två-Photon Mikroskop (figur 1). För det andra byggandet av ett motordrivet löpband (figur 2). För det tredje, uttrycket av takarα-sensorn i mus barken genom in utero elektroporation (Iue) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injektion av Adeno-associerat virus (AAV). Utmärkta protokoll för operationer för Iue24,25 och stereotaxic injektion av virala partiklar26 har tidigare publicerats. De nyckelparametrar som vi använde beskrivs nedan. Fram, installationen av en kranial fönster. Utmärkta protokoll har tidigare publicerats för kranial fönster kirurgi27,28. Flera steg som har ändrats från standardprotokollen beskrivs. Femte, utför in vivo 2pFLIM. För det sjätte, analyserna av 2pFLIM-bilder (figur 3 och figur 4). Detta tillvägagångssätt bör vara lätt tillämplig på många andra Head-fast beteendemässiga paradigm och områden hjärnan.
Detta protokoll visar användningen av FRET-FLIM sensor tAKARα att visualisera neuromodulation-utlöst PKA aktivitet i huvud-fast beter sig möss. Denna applikation är baserad på omfattande tester och karaktäriseringar av tAKARα in vitro och in vivo för att visa att den FLIM-signal som erhålls är relevant för fysiologiska neuromodulatoriska händelser17. Här, en in vivo ansökan, Locomotion-inducerad PKA aktivitet i motoriska cortex, används för att beskriva förfarandena för att leve…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar MS Tess J. Lameyer, MS Ruth Frank, och Dr Michael A. Muniak för redigeringar och kommentarer, och Dr Ryohei Yasuda på Max Planck Florida för 2pFLIM förvärv programvara. Detta arbete stöddes av två BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. och T.M.) och R01NS104944 (H.Z. och T.M.), en R01 Grant R01NS081071 (T.M.), och en R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alla utmärkelser är från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke, USA.
0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |