Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Эти протоколы были разработаны для анализа морфологии коры головного хрусталика, структурную целостность швами рыбы данио рерио в фиксированных и живых линз и для измерения положения ядра рыбы объектива данио, по передней задней оси.

Abstract

В данио рыба уникально подходит для генетических манипуляций и в естественных условиях визуализации, что делает его все более популярной моделью для обратного генетических исследований и для генерации transgenics для в естественных условиях визуализации. Эти уникальные возможности делают рыбу данио идеальной платформой для изучения развития и физиологии глазной линзы. Наши недавние выводы о том, что Аквапорин-0, Aqp0a, необходим для устойчивости шва переднего объектива, а также для смещения ядра объектива к центру объектива с возрастом привели нас к разработке инструментов, особенно подходящих для анализа свойств рыб-рыбок данио. Здесь мы очертить подробные методы рассечения объектива, которые могут быть применены как для личинок и взрослых линз, чтобы подготовить их для гистологического анализа, иммуногистохимии и визуализации. Мы фокусируемся на анализе целостности линз шва и морфологии клеток корковых и сравнить данные, полученные от расчлененных линз с данными, полученными в естественных условиях визуализации морфологии объектива стало возможным благодаря новой трансгенной рыбы-данио линии с генетически закодированный флуоресцентный маркер. Анализ расчлененных линз, перпендикулярных их оптической оси, позволяет количественно определять относительное положение ядра объектива вдоль передней-задней оси. Движение ядра объектива от начального переднего положения к центру необходимо для нормальной оптики объектива у взрослых рыб данио. Таким образом, количественная мера ядерной позиции объектива напрямую коррелирует с его оптическими свойствами.

Introduction

Рыба данио является отличной моделью для изучения развития и физиологии объектива из-за анатомического сходства с объективами млекопитающих, относительной легкости генетических и фармакологических манипуляций, скорости эмбрионального развития глаз, небольшого размера и прозрачности на ранних стадиях, позволяющий в естественных условиях визуализации. Методы, описанные здесь были разработаны для анализа морфологии рерио рыбы объектива в эмбриональных и взрослых этапах с акцентом на культурной целостности, корковых мембранных морфологии в пробирке и в естественныхусловиях, и местоположение объектива ядерной позиции вдоль передней задней оси ex естественныхусловиях. Эти методы служат отправной точкой для функциональных исследований развития и физиологии линз, а также обратных генетических экранов для фенотипов объектива в рыбе данио.

Морфология рыб изображения данио зебрая

Аквапорин 0 (AQP0) является наиболее распространенным белком мембранный объектив и имеет решающее значение для обоих, объектив развития и ясности, из-за нескольких основных функций у млекопитающих. У рыбы данио есть два Aqp0s (Aqp0a и Aqp0b), и мы разработали методы анализа потери их функций как в эмбриональных, так и взрослых объективах. Наши исследования показывают, чтоaqp0a-/-мутанты развивают переднюю полярную непрозрачность из-за нестабильности переднего шва, и aqp0a/b Двойные мутанты развивают ядерную непрозрачность1. AQP0 было показано, играть роли в водный транспорт2, адгезия3,4, цитоскелетная якорь5 и генерация градиента индекса преломления6, но эти исследования в значительной степени были выполнены в пробирке. Рыба данио дает уникальную возможность изучить, как потеря функции, или Возмущенные функции Aqp0a или Aqp0b повлияет на морфологию и функции в живых линз. Для оценки морфологии клеток объектива и культурной целостности во время разработки, мы модифицировали существующие в пробирке иммуногистхимических методов7 для использования в эмбриональных и взрослых линз, и генерируемые трансгенов, чтобы контролировать этот процесс в естественных условиях .

Иммуногистизухимический анализ структуры мембраны плазмы и культурной целостности был выполнен в цельных фиксированных эмбрионах и взрослых объективах. Линзы зебрая рыбы чрезвычайно малы (диаметр объектива ~ 100 мкм в зародыши и до 1 мм у взрослых) по сравнению со своими коллегами млекопитающих и имеют точешвы8, которые редко улавливаются в криометазах. Таким образом, целые линзы необходимы для анализа культурной целостности. Для в естественных условиях анализ формирования переднего шва, и визуализации точной архитектуры клеток объектива, мы генерируются transgenics выражая Mapple конкретно маркировки линз мембраны.

Преимущества живой визуализации transgenics мембраны объектива включают в себя: 1) избежать фиксации артефактов, 2) изучение динамических морфологических изменений в покадровой фильмов, и 3) позволяет продольных исследований, в которых ранее события могут быть коррелированы с более поздней Фенотипов. Пигментация радужки обычно предотвращает четкое изображение периферии объектива. Добавление 1-фенил 2-тиуреа (PTU) до Примордия-5 (прим-5) стадия9 предотвращает Меланогенез и пигментацию глаз до примерно 4 дней постоплодотворения (DPF). Однако, после 4 DPF, периферия объектива скрыта в естественныхусловиях, особенно на старших стадиях. Кроме того, плотность объектива сама затемняет изображения его заднего полюса. Поэтому, чтобы изучить морфологию периферии объектива, или задний шов, после 4 DPF, линзы должны быть иссечено и исправлено.

Трансгенные линии рыбы данио были использованы для анализа эмбриональных мембранные структуры объектива в естественныхусловиях10. Q01 трансгенных выражает голубого флуоресцентного белка сливается с мембраны таргетинга последовательности, Gap43, движимый EF1α промоутер и гексамера DF4 PAX6 усилитель элемента повсеместно в линзы волокна клетки11. Q01 имеет экстра-линзовидные выражения, в том числе амакрин клеток в сетчатке, которая добавляет фоновый сигнал, если основной интерес является объектив. Мы разработали новую трансгенную линию, которая выражает мембранно-привязку mApple специально в объективе, с целью избежать любого экстра-линзовидные сигнала.

Локализация ядра объектива

Мы обнаружили, что ядро объектива перемещается из первоначального переднего расположения в личиночной данио, к центральному расположению в передней-задней оси во взрослых линз. Этот сдвиг в положении ядра объектива преломления индекса, как полагают, является требованием для нормального развития рыбы-объектива зебрано-оптики1. Наши методы позволяют количественно определять ядерную централизацию объектива по отношению к радиусу объектива. Используя этот метод, мы показали, что Aqp0a требуется для объектива ядерная централизация1, и этот простой метод может быть применен к другим исследованиям развития и физиологии объектива и его оптических свойств в модели рыбы данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животных протоколов, используемых в этом исследовании придерживаются ARVO заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision исследований и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Калифорнийского университета в Ирвине.

1. зебрау рыбное животноводство и эвтаназия

  1. Поднимите и поддерживайте рыбу данио (штамм AB) в стандартных лабораторных условиях12. Повышение эмбрионов в среде эмбриона (EM)12. Добавить 0,003% PTU к EM от 20-24 h постоплодотворения (до чопорной-5 этап) для предотвращения образования пигмента в эмбрионов12 используется для визуализации на эмбриональных стадиях9. Поднимите личинки от 6-30 дней постоплодотворения (DPF) на диете живых роток до 14 DPF, и жить Артемия после 14 DPF12.
    Осторожно: PTU очень токсичен
  2. Анестезировать рыбу с помощью тричейна до неотзывчивого на ощупь.
    1. Подготовьте запас трикиаин путем комбинирования 400 мг 3-амино бенсодержащий аидефилестер, с 2,1 мл 1 м рис (рН 9), в 100 мл ddH2O. Отрегулируйте к pH 7,0 и храните при температуре-20 ° c.
      Осторожно: Тричейн токсичен.
    2. Развести 4,2 мл бульона Трикс в 100 мл цистерны воды для обезболивать личинок/взрослых или в EM для обезболивать эмбрионов (окончательная концентрация Трикс при 0,0165% w/v).

2. Фиксация эмбрионов и личинок

Примечание: Иммуногикохимические протоколы были адаптированы из ранее опубликованных материалов7.

  1. Исправить дехорионированных эмбрионов или личинок до 2 недель постоплодотворения в 4% (v/v) параформальдегид (ППФ) в фосфат буферизованные физиологический раствор (PBS) на ночь при температуре 4 ° с на рокер.
    Осторожно: Фа является горючим и канцерогенна.
  2. Вымойте эмбрионы три раза в течение 10 минут в PBS, и проникая в PBS с 10% Тритон и 1% ДДСО (PBS-T) на ночь при температуре 4 ° c.
    Осторожно: ДДСО токсичен, вреден при проглатывании или поглощении кожи, несет опасные материалы через кожу и является горючим. Тритон является токсичным, коррозионным и опасным для водной среды.

3. рассечение личинок и взрослых рыбы-линзы Зебраи

  1. Анестезировать рыбу из 6 личинок DPF в зрелом возрасте с трик, пока не реагирует на прикосновения, но все еще показывая сильное сердцебиение. Мера рыбы Стандартная длина в соответствии с Шиллинг (2002) для постановки13.
  2. Сразу же акцизные глаза, используя микро-вскрытие ножницы и поместить в рассечение блюдо в PBS (рис. 2 показан для взрослых глаз).
    1. Сделать пользовательский 35 mm блюдо, наполненное силикон для рассечений объектива. После того, как силиконовые установил, акцизного диота около 2-3 мм в диаметре и 0,5 мм глубиной для иммобилизации взрослых глаза/линзы во время рассечения.
  3. Рассечение контактных линз для взрослых в зебраи
    1. Место взрослого глаза в блюдо диот задняя сторона до заполнены PBS. Обездвижить глаз, вставив щипцы на < углом 45 ° через оптический диск. Будьте осторожны, чтобы не Ник или сжимать объектив. Сделать два или три радиальных разрезов через сетчатку и склеры от зрительного диска в ресничной зоне с вскрытий ножницы.
    2. Отцедите сетчатку и склеры, как лепестки цветка и инвертировать глаза, роговицы стороной вверх. Обездвижить объектив косвенно через манипуляции склеры и роговицы с плоской стороной ножницы, в то время как потянув за сетчатку и придает ткани с щипцами. Аккуратно отделим лишнюю ткань от объектива.
      Примечание: Очень важно, чтобы вскрыть тщательно, чтобы получить последовательно здоровых линз.
  4. Рассечение личиночные линзы данио зебрау
    1. Место личинок глаз задней стороной вверх на плоской части силиконового блюда заполнены PBS и использовать заостренные иглы вольфрама, чтобы сделать радиальных сокращений через сетчатку и склеры в то время как иммобилизации глаз с другой иглой вольфрама или щипцы.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить объектив.
      1. Резкость кончик 2 см длиной 0,1 мм вольфрама проволоки электролитически приостановления проволоки отзыв на 10% (Вт/в) NaOH и применения низкого напряжения переменного тока14. Закрепите иглу в пипетке Пастера путем плавления стеклянного конца с помощью горелки Bunsen.
        Примечание: Также можно использовать альтернативные инструменты тонкого рассечения.
        Осторожно: NaOH является коррозионной.
    2. Аккуратно зачерпнуть объектив от диссоциация глаза с тупой стороны иглы, и осторожно тянуть прочь прилагается ткани.

4. Фиксация расчлененных линз

  1. Сразу же зафиксировать расчлененные линзы в 1,5% (v/v) для ППД в PBS на 24 ч при комнатной температуре (RT). Мыть линзы три раза в PBS за 10 мин каждый.
  2. Проникающую линзы для анализа всей горы или криопротекции для криосекционирования (см. раздел 8).
    1. Проникая линзы в PBS-T ночь на 4 ° c.

5. иммуногистохимия объектива

  1. Маркировать мембраны фиксированных эмбрионов/личинок или взрослых линз путем инкубации в Фаллойдин-Alexa Fluor 546 (1:200 ) и клеточных ядер с Дапи (1:1000 из 5 мг/мл запаса) в PBS-T ночь при температуре 4 °c.
    Осторожно: DAPI является раздражитель кожи и глаз.
  2. Вымойте три раза с PBS-T в течение 10 мин каждый. Очистить ткани путем инкубации в 30%, 50% и 70% в PBS-T (v/v), по крайней мере 1 ч на RT каждый, или на ночь при температуре 4 ° c.
  3. Гора рыбы в 70%, что в PBS-T (v/v) на стеклянное дно 35 mm микролуночных блюда с глазами, как плоские и прямо против покрытия скольжения насколько это возможно. Для более молодых рыб небольшой передний боковой наклон может помочь сориентировать шов объектива на параллельную маскируют.

6. анализ рыбы данио рерио передняя объектива швы используя трансгенной линии в естественных условиях

  1. Генерируем тг (бонус «Крик»: Mяблоками) , используя Tol2 Kit15. Tol2-система с транссистемой15 позволяет стабильную интеграцию конструкции, где mapple управляется 300 BP человека, который является стимулятора- кристаллаин16 привязал к мембране по последовательности caax, что приводит к выражению особенно в мембране клеточных мембран волокна.
    Примечание: Эта конструкция (ID: 122451) доступна для покупки.
    1. На утро инъекции, подготовить инъекцию смеси и держать на льду. Для достижения конечного объема в 10 мкл содержащих Rrase-и Ндаэ-Free H2O, добавить: 1,5 мкл от Ху-Б1Крик: МАЯБЛС ДНК построить на 50 нг/мкл-[0.375-1.2 ПГ/окончательный инъекции], 1,5 мкл Tol2 Транспозазы мРНК на 300 нг/мкл (Tol2 kit)15 [15-30 ПГ/ Окончательный впрыск], и 1 мкл фенола красного индикатора при 1% w/v [1-4-5% (w/v)/окончательная инъекция].
    2. Впрыснуть 50-100 pL инъекционной смеси в 1-клеточной стадии эмбрионов12.
  2. Измерение эффективности трансгенеза в F0 инъекции эмбрионов путем измерения частоты эмбрионов с mApple положительных линз на 3 DPF.
    Примечание: Ожидайте иметь > 80% эффективность трансгенеза с помощью этого метода. F0 мозаики позволяют детальный анализ мембранной морфологии отдельных клеток. Различные уровни мозаицизма позволяет изображение морфологии отдельных или небольших групп клеток, в то время как более глобальное выражение объектива позволяет анализ многоклеточных структур, таких как линзы швов в естественныхусловиях.
  3. Outcross F0 мозаики рыбы для создания стабильных линий, которые маркировать все волокна клеточных мембран. F0 учредителей с трансгеном интегрированы в герминальных будет генерировать потомство с стабильной интеграции, которые могут быть сохранены как трансгенные линии.

7. анализ данио рыбы переднего объектива швы с помощью трансгенной линии в естественных условиях

  1. Обезболивать 3 DPF или взрослых мозаики или стабильной трансгенной рыбы и смонтировать в 1% низким расплав агарозы (LMA) с триксаин с глазом плоские против покрытия скольжения стекла нижней микролуночных блюд.
    1. Растворить 1 г LMA в 100 мл EM (без метиленового синего), чтобы сделать 1% LMA. Хранить в долгосрочной перспективе, как 15 мл запасов на 4 ° c. Микроволновая печь растворить шток и хранить на 42 °C до тех пор пока каждая пробка не использовать.
  2. Накройте рыбу до 6 DPF с EM с триккаин, или с бак воды с триккаин для взрослых, когда LMA установлен.
    1. Смешайте 5 мл EM без метиленовой голубой или резервуар с водой с 250 МКН акций трикикаин и 7 мкл PTU, если обработка изображений PTU обработила рыбу.

8. объектив Криосекционирование и иммуногистохимия

  1. Криотротэст фиксированные эмбрионы или взрослые линзы путем размещения в 10% сахарозы в PBS (w/v), 20% сахарозы для 1 ч на RT каждый (или на ночь при температуре 4 ° c) и ночь в 30% сахарозы при 4 ° c.
  2. Вставлять ткань в Окт в базовых формах, а затем заморозить на патроны с октября Криоция на 12-14 мкм и собирать на суперпрост/Plus Микроскоп слайды. Теплые разделы на слайд в течение 10 минут на слайде теплее предварительно разогреться до ~ 35 ° c.
  3. Мыть разделы три раза с PBS за 10 мин каждый. Маркировать разделы с Phаллоидин-Алексой мукой 546 (1:200) с DAPI (1:1000) или WGA-Alexa мука 594 (1:200), затем 3 PBS моет. Гора с анти-исчезать монтажа среды, и уплотнение покрывало с лаком для ногтей.

9. Визуализация

  1. Приобретаем изображения с помощью конфокального микроскопа. Приобретите z-стеков или оптических ломтиков с помощью 60x N/A 1,2 воды погружения цели, или аналогичный, в конкретных регионах от передней к задней полюса объектива. Используйте следующие настройки приобретения: 1,2 Воздушный диск с использованием лазера 561 Нм, Техасского красного фильтра для Фаллоидин-Alexa муки 546 или mApple, или лазер 405 с УФ-фильтром для DAPI.
  2. Правильная мощность лазерной энергии z для противодействия потере сигнала с глубиной в объектив. Это позволяет для сильного сигнала на заднем полюсе фиксированной и жить 3 DPF эмбрионов, и сильный сигнал в экваториальных оптических ломтиков у взрослых рыб линз.
  3. Компилируйте и просматривать изображения с помощью программного обеспечения обработки изображений.

10. Измерение локализации ядра объектива в передней-задней оси

  1. Ориент свежевырезанных линз аксиально в PBS в 35 mm блюдо с покрытым стеклом снизу, с полюсами и швов, ориентированных параллельно плоскости фокуса. Ищите разницу в индексе преломления, который обычно происходит в интерфейсе коры объектива и ядра объектива для идентификации ядра объектива.
    Примечание: Здоровые линзы дикого типа для взрослых чрезвычайно прозрачны, что затрудняет видеть швы и ядро объектива или определять ориентацию объектива. В этом случае, небольшой Ник с щипцами для объектива капсула вызывает незначительные повреждения, что делает швы и ядро объектива очевидной примерно в 10 минут помогает ориентироваться объектив для этого измерения. Тем не менее, линзы становятся непригодными для использования в нисходящих приложениях, поскольку они теперь повреждены.
  2. Возьмите изображения линз с ядром объектива в фокусе под ярким освещением поля с или без дич оптики с помощью рассечения микроскопа с камерой прилагается. Изображение микрометра под тем же увеличением для калибровки.
    1. Нажмите на кнопку "живая", отрегулируйте настройки экспозиции, чтобы визуализировать периферию ядра и объектива, и Возьмите изображение, нажав кнопку Snap Shot. Сохранить в качестве МФТ файла.
    2. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для калибровки изображений приобретенных линз. Выберите прямой линии инструмента и нарисовать линию известной длины на микрометра изображения, нажмите проанализировать | установить масштаб. Введите известное расстояние, единицы и выберите «глобальную» калибровку и щелкните OK.
  3. Измерение расстояния центра ядра объектива до переднего полюса (a-r).
    1. Используйте прямую линию инструмента в программном обеспечении обработки изображений, чтобы нарисовать линию через отображаемого центра объектива ядра в осевой ориентации. Возьмите центр этой линии как центр ядра объектива.
    2. Нарисуйте другую линию от этой точки до переднего полюса объектива и выберите ' измерение ' в меню ' анализировать ', чтобы измерить расстояние (a-r), где радиус объектива и r -расстояние от центра объектива до центра Ядра.
    3. Нарисуйте другую линию от передней к задним полюсам и измерьте это расстояние как диаметр объектива (2A). Скопируйте эти длины из окна "результатов" и переведите их в электронную таблицу или программу статистики.
      Примечание: Это легче точно измерить от центра ядра до переднего полюса, чем измерение от центра ядра объектива до центра объектива. Это измерение преобразуется формулой в шаге 10.3.5 для того чтобы сообщить Расстояние центра ядра объектива к центру объектива. Всегда используйте взрослое ядро для измерений, даже если эмбриональное ядро очевидно.
    4. Разделите диаметр на 2, чтобы вычислить радиус объектива, a.
    5. Расчет r/a, как Equation 1 , нормализованная локализация ядра объектива по отношению к радиусу объектива.
      Примечание: для ядра, помещено ближе к передней полюсу, r/a будет > 0.0, в то время как центральное локализованное ядро будет иметь r/a 0,0.
  4. Граф журнала нормализованных осевых измерение ядра в качестве функции стандартной длины, чтобы определить изменения в локализации ядра объектива в процессе развития рыбы данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анатомия взрослой рыбы в глазном зебрае очень напоминает млекопитающих (рис. 1a). Несмотря на некоторые различия между рыбами данио и млекопитающихся глаз, таких, как с ресеплярной зоны вместо ресницах тела17, различия в оптических свойств18, и различия в морфогенез во время эмбрионального развития19, глазной рыбий глаз является отличной моделью для изучения развития глаз и понимания офтальмологических заболеваний20,21,22. Простой эпителий линии переднего полюса объектива, который на экваторе проходит длительный процесс распространения, удлинение, и дифференциация в волокна клеток, составляющих основную часть объектива. Зрелые волокна (рис. 1B, светло-голубой), сначала дифференцируются в зародыше, лишены органелл и никогда не заменяются. Дифференцируя концы волокна клетки встречают на полюсах для того чтобы сформировать передние и задние швы. Эти клетки после этого интернализированные нов продифференцированными клетками волокна. Так же, как и все позвоночный объектив, у рыбы-объектива зебрано есть градиент развития с самыми старыми клетками, расположенными в центре ядра объектива. Рерио рыбы объектив плаценты формы на 16 ч постоплодотворение (HPF), который удлиняет сформировать первичный волокна линзы на 18 HPF, и вторичные волокна образуют переходную зону на 28-36 HPF. Задний шов виден на 48 HPF, который до того, как передний шов становится видимым10.

Точное развитие и поддержание регулярной архитектуры объектива имеет важное значение для его оптики. Здесь мы описываем методы для анализа морфологии клеточной клеточки объектива в пробирке и в естественныхусловиях, в том числе как преимущества и ограничения, которые мы разработали для анализа фенотипов в результате потери функции мутанты двух рыб данио Aqp0s, Aqp0a и Aqp0b1. Для оценки взрослой морфологии объектива в пробирке, линзы были расчленены (рис. 2) и немедленно исправлены. Эмбриональные оценки проводились в целом фиксированных эмбрионов (рис. 3) и по сравнению с живыми трансгенными эмбрионами (рис. 4). Расчлененные и фиксированные линзы для взрослых (рис. 5) сравнивали с генетически трансгенных взрослых линз, отображаемые вживую (рис. 6). Обобщены различия в обнаружении и визуализации конкретных участков объектива с использованием этих методов (Таблица 1).

Фаллоидин был найден, чтобы быть выше для маркировки линзы волокна клеточных мембран в рыбе данио, по сравнению с зародыши агнмагин пшеницы (WGA). WGA является Лектин, который связывается с N-ацетил-D-глюкозамина и сиаловым кислоты, и WGA сопрягается с флюорофоры, как правило, используется для обозначения мембран клеточных волокон мембраны в человеческом23, бычий24, баранину25, мышь26, крыса27 и Данио рерио28,29. Здесь мы используем Фаллоидин на целые рыбные линзы данио (рис. 3, рис. 5).

Эмбриональные и личиночные рыбы-зебраи личинок до 7 DPF являются небольшими и проницаемыми достаточно, чтобы позволить проникновение Фаллоидин в объектив внешней коры. По 3 DPF ядро объектива компактно и лишено органелл, передних швов образуют на передней полюсе (рис. 3 а,б), и Фаллоидин исключается из ядра объектива в экваториальной плоскости оптического (Рисунок 3a,D). Флелоидин, скорее всего, исключен из ядра из-за высокого уплотнения мембран клеточных волокон, в соответствии с предыдущими исследованиями28. Однако, Внешняя кора визуализируется в мельчайших деталях с этим окрашивание (Рисунок 3C-F). В попересекции, волокна клетки берут на плоской шестиугольной формы, с более широкими сторонами, и короткие узкие стороны. Phаллоидин сильно этикетки и узкие и широкие мембраны клеточных волокон (Рисунок 3E-F), подчеркнув уплотнения корковых клеток волокна между широкими сторонами. Эта организация в значительной степени не влияет на aqp0a/b двойных мутантов (рис. 3b, D, F и H).

Мозаика выражение трансгена (mApple привязал к клеточной мембране по CAAX мотив обусловлен 300 BP промоутер области человеческого бонус кристаллин промоутер) сильно выражает в линзы, начиная с 2 DPF. Трансген случайным образом интегрирован в геном, что приводит к гетерогенному выражению mApple. Мы показываем примеры 3 DPF объектива с сильным выражением в коре (Рисунок 4) и выражение в частях ядра (рис. 4d). Маркер мембраны не ограничен проницаемостью, как фломидин, таким образом, он обозначает ядро объектива. Мозаика (рис. 4), генерируемые ИНЪЕКЦИЯМИ ДНК, которые выражены только в небольшом подмножестве клеток, полезны для анализа индивидуальных клеточных морфологии по сравнению с устойчивыми линиями, которые маркируются каждой ячейкой, выражающая Вb1 кристаллин (рис. 6). В ТГ (бонус "Крик: Маяблес") мозаика морфология переднего шва может быть визуализирована в z-проекции, принятые на передней полюс (рис. 4A,B). Отметим, что морфология клеточных мембран отличается от фиксированных линз, маркированных фаллидин (Рисунок 3a,B), и наличие поддоменов в широких клеточных мембране (рис. 4A' белые стрелы), ранее выявленных в объективах из других вид30 виден. Тем не менее, слабее маркировки узкой мембраны клеточных мембран приводит к неспособности увидеть поразительное сближение клеток на передней шов (рис. 4A,B стрелка) видели в фиксированных линз помечены phаллоидин (Рисунок 3a,b стрелки).

Интересно, что оптические ломтики, принятые на объективе экватора также выявить различные маркировки, с очевидными нарушениями объема ячейки в aqp0a/b двойных мутантов по сравнению с Вт (Рисунок 4c-F). Это, вероятно, потому, что трансгенные этикетки широкого волокна клеточных мембран более эффективно, чем phаллоидин. Мы смогли получить z-проекции через задний полюс для анализа целостности заднего шва с использованием Z-коррекции, который увеличил мощность лазера с глубиной в ткань. Четкий анализ заднего шва (Рисунок 4G,H) в неповрежденной рыбе был ограничен первыми 5 ДПФ, и после этого объектив был слишком плотным, что приводило к потере сигнала в задней части объектива.

Фиксированные расчлененные линзы для взрослых с маркированными Фаллоидин выявили поразительную деталь в высоко упорядоченные архитектура рядов волокна ячейки сходящихся в форме передних швов (Рисунок 5A, стрелка) и морфологии коры головного мозга (Рисунок 5a-H), из-за очень сильного маркировки узких мембран клеточных волокон на Фаллоидин. Максимальная Z-проекции переднего полюса выявили потерю жесткой передней шов в aqp0a/b двойной мутант линзы (Рисунок 5b, стрелка), по сравнению с Вт (Рисунок 5b, стрелка), который проявляется как масса мембран и клеточных ядер в оптических ломтики 30 мкм от переднего полюса (Рисунок 5D). В более глубоких оптических ломтиков, Фаллоидин маркировки был исключен из более глубокого коры объектива и ядра (Рисунок 5E,F). Общая организация строк волокна ячейки в наружной коры была несколько пострадавших от отсутствия жесткой передней шов в aqp0a/b двойной мутант линзы, что делает невозможным положение линзы точно перпендикулярно плоскости изображения (Рисунок 5F ) по сравнению с линзами Вт (Рисунок 5e). Тем не менее, изображения высокой мощности волокна ячейки строк, принятых в экваториальной плоскости показало, что клетки в наружной коре все еще формируется упорядоченных строк, видимых из-за сильного узкие волокна ячейки маркировки (Рисунок 5G,H). Невозможно различить отдельные мембраны клеточных волокон из-за сочетания их плотного уплотнения и слабого сигнала. Так как эти линзы были расчленены, они могут быть установлены с задней стороной, стоящей перед целью, что позволяет z-проекции задних швов, которые не показали никаких различий между генотипами, как задние кончики волокна клетки сформировали жесткие швы (Рисунок 5I,J стрелки).

Z-проекции линз живого наркотизированного взрослого стабильного тг (бонус-Крик: mAppleCAAX) рыбы выявляют морфологию мембраны коры головного мозга в передней коре (Рисунок 6a,a '), а также степень сходимости клеток на передней полюсе ( Рисунок 6B). Это было труднее смонтировать рыбу с линзами швов, перпендикулярно к плоскости изображения, по сравнению с фиксированной рассеченные линзы. Стабильные линии, несущие трансген Экспресс mApple в ядре объектива (Рисунок 6C,D). Оптические ломтики на экваторе выявили сильный сигнал, указывающий на обширное уплотнение ядра при такой же мощности лазера, как и передняя кора (Рисунок 6C). Интересно, что нет клеточного разрешения внешней коры было видно у взрослых, в отличие от эмбрионов. Это, вероятно, связано с радужной оболочкой, блокирующей четкий сигнал с периферии объектива. Это может быть возможным, чтобы получить более сильный корковый сигнал объектива расширением зрачка до визуализации. При уменьшенном мощности лазера, можно было различить некоторые клеточные слои в ядре объектива (Рисунок 6D). Рыба-объектив взрослого данио очень плотная, и невозможно было получить сигнал от заднего полюса в естественныхусловиях.

Мы показали, что ядро рыбий линзы данио перемещается в оптической оси от начального переднего положения в личиночные линзы в центральное положение у взрослых1. Эти движения выделяются в осевых разделах объектива, так как Фаллоидин и WGA исключены из ядра объектива (Рисунок 7A-C). Мы показали, что Aqp0a требуется для этого централизацией процесса1, но этот механизм, вероятно, будет затронут другими белками. Локализация центра ядра объектива по отношению к его положению вдоль передней-задней оси была измерена путем размещения расчлененных целых линз в их осевой ориентации и визуализации под дич иллюминацией, таким образом выделяя незначительные различия в рефрактивных свойств (рис. 7E). Швы обычно имеют различный Индекс преломления чем окружающая кора, поэтому могут быть использованы в качестве ориентира для ориентации. Молодые личиночные линзы имеют более очевидные швы (задние швы в очень молодых объективах), а ядра линз, которые имеют различный Индекс преломления, очевидно асимметричны, что облегчает ориентирование линз на этих этапах. Относительное расстояние центра ядра объектива от центра объектива (r) нормализуется до радиуса объектива (a). Это после этого графировал с отношением к развитию рыбы данио, для которого стандартное измерение длины использовано13. В ДВ, ядро объектива начинается ближе к полюсу Equation 2 переднего объектива, а затем централизует Equation 3 в зрелом возрасте (Рисунок 7F).

Figure 1
Рисунок 1 : Рыба Зебраи Взрослый глаз и объектив диаграммы. Передняя берется, как, где свет попадает в глаз, который в рыбе данио на самом деле боковой. (A) линза рыбы данио вместе с роговицей фокусировать свет на сетчатке. В водных животных, роговица играет незначительную роль в преломление света, но вместо этого, объектив имеет более высокий индекс преломления18. Объектив отделяет переднюю камеру, наполненную насмешливым юмором и задней камерой, заполненной стекловидным юмором. (B) линза рыбы данио является более сферической, чем объективы млекопитающих. Волокна ячейки советы встречаются в точке или пуповинного швов8 на передних и задних полюсов. Дифференцируя волокна клетки в объективе коры имеют ядра и органеллы, в то время как зрелые волокна клеток в ядре объектива (светло-голубой) лишены органелл и ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.    

Figure 2
Рисунок 2 : Рерио рыбы объектив рассечение. (A) глаза расчленены из наркотизированной рыбы и помещены задняя сторона вверх (B). (C) глаза иммобилизованным щипцами через оптический диск (OD) и от двух до трех радиальных разрезов производятся в сетчатке и склеры от зрительного диска к зонтам. (D) сложите щитки наружу, чтобы раскрыть объектив. (E) поверните глаз к лицу роговицы вверх, обездвиживать объектив косвенно через роговицу и тянуть прочь склеры-сетчатки. (F) Отрежьте оставшуюся сетчатку и ресллярные зоны/Зонты из объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Эмбриональные линзы морфологии в пробирке. Фиксированные и проникающие эмбрионы, маркированные Фаллоидин (красным) и ядрами клеток с DAPI (синим цветом), выявляют морфологию мембраны и целостность швов на полюсах. Z-прогнозы показывают, что вес и aqp0/b двойной мутант линзы выставку очень регулярные волокна ячейки договоренности, которые отвечают на очень плотный передний шов (стрелки) на 3 DPF (a, b). Оптические ломтики, принятые на экваторе, выявляют жесткие ряды гексагональных волокон, упакованных в внешнюю кору обоих генотипов (C-F). Обе, узкие и широкие стороны мембран клеточных оболочек помечены как показано в (E). Задние швы (стрелки) образуются и плотно прилегаются по обоим генотипам (G, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Эмбриональные линзы морфологии в естественныхусловиях. Живые изображения анестезированного 3 DPF мозаика F0 вводили тг (бонус Крик: Маяблекаакс) линзы выявить передние швы (стрелки) в z-проекции (A, B). (a ') Мембранные поддомены проявляются как пункта (белые стрелы) в мембране широких клеточных мембран. Узкие мембраны клеточных волокон также очевидны (черные стрелки). Линзы ЗТ показывают плотно упакованный объектив корковых волокон клеток (C, E), по сравнению с нарушенной коры aqp0a/b двойных мутантов- с очевидными опухшие клетки (D, F). Фокусировка на задних (g, h) шовности (стрелками) не раскрывает разницы между генотипами (g, h). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Для взрослых объектив морфологии в пробирке. Иссеченные, фиксированные и проникающие линзы из рыбы более 23 мм стандартной длины были помечены Фаллоидин (красный) и DAPI (синий). 150 мкм Z-проекция на передней шесте раскрывает строгое расположение подсказок клеточную клетчатку, сходящихся при тугой шов (стрелка) в ЗТ (а), но не aqp0a/b двойных мутантов (стрелка), которые вместо этого имеют массу мембран и ядер (б). Оптический срез взят 42 мкм от переднего полюса выявить упорядочивающиеся ячейки сходящихся в центре в ДВ (C), но масса ядер, где шов должен быть в мутантных линз (D). Оптические ломтики через экватор объектива, при 130 мкм от переднего полюса обнаруживают плотно упакованные ряды волокон клеток в ЗТ (е, г) и мутантах (F, H). Задние швы (стрелки) образуются и плотно в обоих генотипов (I, J). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 Для взрослых объектив морфологии в естественныхусловиях. Живая съемка наркотизированного взрослого стабильного тг (бонус-Крик: Маяблекакс) , линзы. Z-проекции в передней коре показывают корковые морфологию (а, а '), и передний шов (стрелка), с клетками, сходящихся к точке в одном оптический срез (B, стрелка). Кора может быть визуализирована при более высокой мощности лазера в оптический срез через экватор (C), по сравнению с более сильным сигналом форме ядра объектива (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Рерио Фиш ядро централизация объектива. Фиксированные и криопротекционные эмбрионы (A) и линзы(B, C) были аксиально-секционные и маркированные с Фаллоидин-546 (красный в a, b), DAPI (синий в a, b) или WGA-594 (красный в C). Ядро объектива лишено ядер клеток, и помещается ближе к передней (a) объектив на 3 DPF (а), и в 1 месяц старые линзы (B), по сравнению с централизованно помещается в взрослых линз (C). Расчлененные линзы от 1 месячной рыбы данио 4,1 мм стандартной длины были ориентированы уравнительно (D) или аксиально (E). Относительная локализация ядра объектива в оси была рассчитана с использованием следующей стратегии: (E) Расстояние центра (*) ядра объектива (белая пунктирная линия) было измерено к передней полюсу, так как это более практично, чем измерение Расстояние (r) до центра объектива (плюс). Это было нормализовалось до радиуса объектива (a), который был первоначально измерен как осевой (Ant.-POS.) диаметр объектива. Журнал нормированного осевого ядра локализации был графировал как функция развития рыб данио, измеряемый стандартной длиной (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Функция Эмбрион IHC ТГ эмбриона Весь объектив взрослого IHC ТГ Взрослый
Жить N Y N Y
Передний шов Y Несколько Y Несколько
Задний шов Y Y Y N
Корковая клеточная деталь Несколько Y Y Передняя несколько
Деталь ядра объектива N Y (стабильный) N Y (стабильный)
Вторичная метка Y-антитела Жить только с ТГ Y-антитела Жить только с ТГ
Широкая/узкая этикетка волокна Как Широкий В основном узкие Широкий

Таблица 1: Сводка сравнения в естественных условиях против в пробирке методы для анализа морфологии объектива в данио рерио. Y = да, N = нет

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ морфологии линзы данио рерио является начальным шагом в понимании фенотипов в мутантах, или эффекты фармакологических вмешательств, направленных на изучение биологии глазной линзы. Мы обрисовать методы для анализа швов объектива, корковых морфологии клеток волокна и аспекты объектива ядра. Эти подходы представляют собой комбинацию в пробирке и в естественных условиях (по сравнению в таблице 1). В пробирке методы позволяют более подробно внешней морфологии клеток коры, а также доступ к задний шов в взрослых линз.

В естественных условиях анализ возможен с использованием трансгенных маркеров. Трансген мы вводим здесь объектива мембраны конкретных, по сравнению с существующими Q01 рерио рыбы линии, которая при маркировке объектива мембраны также этикетки других типов клеток в глаза, в том числе амакрин клетки, усложняя интерпретации11 . В естественных условиях сигнала ограничивается пигментного эпителия глаза, который формируется во второй день эмбриогенеза, так что эмбрионы должны быть PTU лечение для анализа на этом и последующих стадиях. У взрослых, радужная оболочка скрывает четкий анализ коры объектива, но позволяет в естественных условиях анализ передней коры объектива. Живая съемка рыбных линз позволяет продольное изучение морфологии линз в одном и том же животном. Это может быть чрезвычайно полезным инструментом для изучения влияния на динамические процессы, такие как разрушение объема клеток в ответ на осмотические или фармакологические возмущения. Неожиданный вывод, что мы можем четко визуализировать мембранные поддомены в широких мембран клеточных волокон в живых личинок transgenics, но не в фиксированных линз. Это подчеркивает разницу в маркировке трансгеном и фалалидин, а также тот факт, что эти поддомены могут быть затронуты процессом фиксации.

Анализ молекулярных механизмов централизацией объектива с использованием методов, которые мы описываем, может раскрыть механизмы, необходимые для развития оптических свойств объектива. Хотя, на сегодняшний день, осевая асимметрия ядра объектива только было сообщено в рыбе данио, изучая этот процесс, мы, вероятно, чтобы получить представление о механизмах, необходимых для разработки оптики объектива у других видов. В будущем, трансгенные животные могут быть использованы в комбинации с другими приложениями-например, исследования избыточного выражения, с использованием зелёного маркера трансгенеза. Они могут быть использованы для изучения эффектов перевыражения конкретного белка в объективе, или для спасения фенотипов в существующих мутантов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет информации.

Acknowledgments

Мы хотели бы отметить наш источник финансирования: низ R01 EY05661 к J. E. H, Инес Герринг для оказания помощи в генерации aqp0a/b двойных мутантов и рерио рыбоводства, д-р Даниэль Дранов для дискуссий, ведущих к генерации transgenics, д-р Брюс Лаборатории Блумберга и доктора Кена Чо для использования их анатомический микроскопов, и д-р Меган Смит за помощью в статистическом анализе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

Биология выпуск 147 рыба данио объектив объектив шов ядро объектива AQP0 МИПО живая визуализация разработка объектива трансгенные
Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter