Summary

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

Published: May 13, 2019
doi:

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.

Abstract

يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.

Introduction

يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي1. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري2. وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجينات مجموعة أدوات التنمية مثل الشق وbHLH، مما يعني أن أسلافهم المشتركة لديها بالفعل هذه الجينات3. ومع ذلك، فإن دور هذه الجينات مجموعة أدوات التنمية في السلف المشترك الأخير من Cnidaria وBilateria هو أقل فهما بالمقارنة جيدا. ولمعالجة هذه المشكلة، من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل هذه الجينات المحفوظة بعمق في الكنيداريين.

واحدة من النماذج الوراثية cnidarian الناشئة هو الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis. وقد تم تسلسل الجينوم3، ومجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، بما في ذلك المورفولينول بوساطة الجينات بالضربة القاضية ، وtransgenesuclease بوساطة transgenes ، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينات knockins وخروج المغلوب ، متاحة الآن للاستخدام في هذا الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير نيماتوستيلا مفهوم بشكل جيد نسبيا. أثناء تكوين الجنين، يحدث التطفل عن طريق المهبل4، ويتطور الجنين إلى يرقة بلنبولا السباحة الحرة. وتتحول البلنة في وقت لاحق إلى ورم مسيل مع الفم والمخالب المحيطة. ثم ينمو ورم ويصل إلى النضج الجنسي.

كريسبر-Cas9 بوساطة الطفرات المستهدفة يستخدم الآن بشكل روتيني لدراسة وظيفة الجينات في نيماتوستيلا vectensis5,6,7,8,9. لتوليد متحولين بالضربة القاضية في Nematostella، يتم حقن كوكتيل يحتوي على locus محددة واحدة دليل RNAs والبروتين Cas9 endonuclease لأول مرة في البيض غير المخصبة أو المخصبة لإنتاج الحيوانات مؤسس F0 التي تظهر عادة الفسيفساء. يتم رفع الحيوانات F0 في وقت لاحق إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لإنتاج السكان F1، مجموعة فرعية منها قد تكون متحولة بالضربة القاضية6. بدلا من ذلك، يمكن عبور الحيوانات F0 ناضجة جنسيا مع الحيوانات البرية من نوع لتوليد الحيوانات Heterozygous F1، وF1 heterozygotes التي تحمل أليل بالضربة القاضية في موضع الاهتمام يمكن بعد ذلك أن عبرت مع بعضها البعض لإنتاج ذرية F2، ربع منها من المتوقع أن تكون متحولة بالضربة القاضية5. ويتطلب كلا النهجين طريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من السكان غير المتجانسين وراثيا. يمكن استخدام مخالب البولي لاستخراج الحمض النووي الجينيللكتابة الجينية 6،7. ومع ذلك، في الحالات التي يتم فيها التحقيق في الوظيفة التنموية لجين الاهتمام ولا تصل الأجنة المتحولة إلى مرحلة البول (أي بسبب فتك اليرقات المرتبطة بالطفرة)، يجب تحديد المتحولين بالضربة القاضية في وقت مبكر من الأنطوجيني. يوصف هنا هو بروتوكول يستند إلى PCR للالحيوانات الفردية النمط الجيني في مرحلة gastrula دون التضحية الحيوان، والتي تمكن من تحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة.

Protocol

1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا. في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة ?…

Representative Results

جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw-a,glw-b,وglw-c) سابقا5. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW<s…

Discussion

وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حي?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم على النسخة السابقة من المخطوطة، التي حسنت المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة أركنساس.

Materials

Drosophila Peltier Refrigerated Incubator Shellab SRI6PF Used for spawning induction
Instant ocean sea salt Instant ocean 138510
Brine shrimp cysts Aquatic Eco-Systems, Inc. BS90
L-Cysteine Hydrochloride Sigma Aldrich C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500 VWR 89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0 QUALITY BIOLOGICAL 351-007-01
Potassium chloride VWR BDH9258
EDTA, 0.5M pH8 VWR BDH7830-1
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Nonidet-P40 Substitute US Biological N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
Agarose VWR 710
Micro Dissecting needle holder Roboz RS-6060
Tungsten dissecting needle Roboz RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers Eppendorf E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England BioLabs M0530L
dNTP mix New England BioLabs N0447L
GLWamide universal forward primer 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’

References

  1. Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
  2. Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
  3. Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
  4. Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
  5. Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
  6. He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
  7. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
  8. Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
  9. Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
  10. Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
  11. Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
  12. Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
  13. Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
  14. Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
  15. Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
  16. Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).

Play Video

Cite This Article
Silva, M. A., Nakanishi, N. Genotyping of Sea Anemone during Early Development. J. Vis. Exp. (147), e59541, doi:10.3791/59541 (2019).

View Video