Kvantifiering av prolifererande humana antigen-specifika CD4+ T-celler med hjälp av Karboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att mäta prolifererande CD4+ T-celler som svar på antigen proteiner eller peptider med hjälp av färg utspädning. Denna analys är särskilt känslig för sällsynta antigen-specifika T-celler och kan ändras för att underlätta kloning av antigen-specifika celler.
Abstract
Beskrivs är en enkel, in vitro-, Dye utspädning-baserad metod för att mäta antigen-specifik CD4+ T cell proliferation i human perifert blod mononukleära celler (pbmcs). Utvecklingen av stabila, giftfria, fluorescerande färgämnen som karboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) gör det möjligt för sällsynta, antigen-specifika T-celler att skiljas från åskådare genom minskning av fluorescerande färgning, som upptäcks av flödescytometri. Denna metod har följande fördelar jämfört med alternativa metoder: (i) den är mycket känslig för lågfrekventa T-celler, (II) ingen kunskap om antigen eller epitop krävs, (III) fenotypen för de svarande cellerna kan analyseras och (IV) livskraftiga, svara på celler kan sorteras och användas för ytterligare analys, till exempel T-cellskloning.
Introduction
Förmågan att detektera och studera antigen-specifika T-celler är viktig i studier av cellmedierad immunitet. Emellertid, detta är särskilt utmanande för autoantigen-specifika CD4+ T-cells svar, som är mycket svaga och svåra att upptäcka. En vanlig metod som används för detektion av antigen-specifika lymfocytproliferation är [3H]-tymidin, som är en radioaktivt märkt nukleotid införlivas i DNA av prolifererande celler. Även om [3H]-thymidine-analysen kan detektera DNA-syntes, är denna metod ett indirekt mått på celldelning, eftersom DNA-syntesen kan initiera oberoende av Mitos (dvs. under genduplicering och apoptos1). Denna fråga förvärras av det faktum att antigen-specifik spridning av celler kan resultera i betydande apoptos2, vilket leder till potentiell överskattning av antigen-specifik spridning. Vidare, den [3H]-thymidine metoden ger inte fenotypisk information för prolifererande lymfocyter, såsom CD4+ eller CD8+ härstamning proliferation i pbmcs stimuleras med antigen peptider.
I 2003, vi publicerade den första färg utspädning analysen med cfse, kallas cfse-baserade proliferation assay3,4. CFSE är ett fluorescerande färgämne som binder stabilt till intracellulära proteiner genom att bilda en kovalent bindning till intracellulära lysinrester. Eftersom CFSE-märkta proteiner delas lika mellan dotterceller3, celler som har delat kan särskiljas från odelade celler med flödescytometri, vilket också möjliggör kvantitativ fenotypning av lymfocytpopulationer. Faktum är att antalet divisioner som en cell har genomgått från tidpunkten för CFSE-färgning kan mätas till en viss grad5. På senare tid har många liknande färgämnen som CellTrace Violet proliferation Dye (VPD) och CytoTrack Dye utvecklats, som fungerar på ett liknande sätt6. Detta protokoll fokuserar på CFSE, men principerna gäller också för andra relaterade färgämnen.
Peptid-MHC tetramer färgning är en allmänt använd metod för att upptäcka och kloning antigen-specifika CD8+ T-celler. Detta är en väletablerad metod7,8,9,10; den tetramer-baserade kloningen kräver dock befintlig kunskap om begränsningen av epitop/MHC och varje epitop kräver sin egen tetramer11, vilket begränsar omfattningen av upptäckten och kloningen av nya epitopespecifika T-celler. Den CFSE-baserade spridningen kan användas med peptider, proteiner, eller cell Lysates. Det protokoll som beskrivs häri är både enkel och robust, och de svarande CD4+ T-celler kan sorteras för användning i nedströms funktionella och biokemiska karakteriseringstester12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE-baserad spridning är en enkel och robust metod för att upptäcka och räkna upp antigen-specifika humana CD4+ T-celler. Det har tidigare visats att användning av den optimala koncentrationen av CFSE är avgörande för optimala resultat4. För mycket cfse upphäver spridning, medan för lite inte tillåter delade och odelade celler som skall särskiljas. Däremot används relativt höga koncentrationer (5,0 μM) av CFSE för att märka renade murina T-celler3</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av: den juvenila diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Den nationella hälso-och medicinsk forskningrådet (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australien Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), drift infrastruktur stödprogram av den viktorianska regeringen (S. M., A. D., E. T., M. S.), och NHMRC Doktorandstipendium APP1094337 och JDRF PhD top-up stipendium (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
