Summary
Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4+ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.
Abstract
Beschreven is een eenvoudige, in vitro, kleurstof verdunnings methode voor het meten van antigeen-specifieke CD4+ T celproliferatie in menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De ontwikkeling van stabiele, niet-toxische, fluorescerende kleurstoffen zoals carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) maakt het mogelijk zeldzame, antigeen-specifieke T-cellen te onderscheiden van omstanders door vermindering in fluorescerende kleuring, zoals gedetecteerd door flow cytometrie. Deze methode heeft de volgende voordelen ten opzichte van alternatieve benaderingen: (i) het is zeer gevoelig voor laagfrequente T-cellen, (II) geen kennis van het antigeen of epitoop is vereist, III) het fenotype van de reagerende cellen kan worden geanalyseerd en (IV) levensvatbaar, cellen kunnen worden gesorteerd en gebruikt voor verdere analyse, zoals T-cellen klonen.
Introduction
De mogelijkheid om antigeen-specifieke T-cellen te detecteren en te bestuderen is belangrijk in onderzoeken naar door cellen gemedieerde immuniteit. Echter, dit is vooral een uitdaging voor autoantigen-specifieke CD4+ T-cel reacties, die zeer zwak en moeilijk te detecteren zijn. Een veelgebruikte methode voor de detectie van antigeen-specifieke lymfocyten proliferatie is [3H]-thymidine, een van nucleotide dat is opgenomen in het DNA van prolifererende cellen. Hoewel de [3H]-thymidine-test DNA-synthese kan detecteren, is deze methode een indirecte maatstaf voor celdeling, omdat DNA-synthese onafhankelijk van mitose kan starten (d.w.z. tijdens genduplicatie en apoptosis1). Dit probleem wordt verergerd door het feit dat antigeen-specifieke proliferatie van cellen kan resulteren in aanzienlijke apoptosis2, wat leidt tot een mogelijke overschatting van antigeen-specifieke proliferatie. Bovendien levert de methode [3H]-thymidine geen fenotypische informatie voor prolifererende lymfocyten, zoals CD4+ of CD8+ Lineage proliferatie in PBMCs, gestimuleerd met antigene peptiden.
In 2003 publiceerden we de eerste kleurstof verdunnings test met behulp van CFSE, genaamd de op CFSE gebaseerde proliferatie test3,4. CFSE is een fluorescerende kleurstof die stabiel bindt aan intracellulaire eiwitten door een covalente binding te vormen aan intracellulaire lysine residuen. Aangezien CFSE-gelabelde eiwitten gelijkelijk worden verdeeld onder dochtercellen3, kunnen cellen die zijn onderverdeeld worden onderscheiden van onverdeelde cellen door Flowcytometrie, wat ook de kwantitatieve fenotypering van lymfocyten populaties mogelijk maakt. Het aantal divisies dat een cel heeft ondergaan vanaf de tijd van de CFSE-kleuring kan worden gemeten tot op zekere hoogte5. Meer recentelijk zijn veel vergelijkbare kleurstoffen ontwikkeld, zoals CellTrace Violet proliferatie Dye (VPD) en CytoTrack Dye, die op dezelfde manier werken6. Dit protocol richt zich op CFSE, maar de principes gelden evenzeer voor andere verwante kleurstoffen.
Peptide-MHC tetrameer kleuring is een veelgebruikte methode voor het opsporen en klonen van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen. Dit is een goed opgezette methode7,8,9,10; het klonen op basis van tetrameer vereist echter bestaande kennis van de epitoop/MHC-beperking en elke epitoop vereist zijn eigen tetrameer11, die de reikwijdte van ontdekking en klonen van nieuwe epitoop-specifieke T-cellen beperkt. De op CFSE gebaseerde proliferatie kan worden gebruikt met peptiden, eiwitten of cellysaten. Het hier beschreven protocol is zowel eenvoudig als robuust, en de respons CD4+ T-cellen kunnen worden gesorteerd voor gebruik in downstream functionele en Biochemische karakterisering van de assays12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle proefpersonen gaven geïnformeerde toestemming voorafgaand aan het verzamelen van perifeer bloed. Ethische goedkeuring voor experimenten met behulp van PBMC werd gegeven door St. Vincent's hosptial (HREC-A 135/08, en HREC-A 161/15).
1. bereiding van het reagens
-
Human T Cell media
- Bereid RP-5-media voor op kweek PBMC, dat bestaat uit rpmi 1640, 1x niet-essentiële aminozuren, l-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mm), penicillair (100 U/ml)/streptomycine (0,1 mg/ml) en 5% gepoolde humane serum (PHS).
-
CFSE stockoplossingen
- Bereid een Master Stock door het oplossen van 25 mg CFSE in ~ 9 mL DMSO om een uiteindelijke stamoplossing met een concentratie van 5 mM te bereiken.
- Maak een werk kolf door de Master Stock in PBS te verdunen om een werkconcentratie van 10 μM te bereiken.
2. bereiding van humane PBMCs uit volbloed
- Er zijn over het algemeen tussen 0,5 – 1,5 x 106 PBMCs/ml menselijk perifeer bloed. Daarom is de vereiste hoeveelheid bloed afhankelijk van het gewenste aantal PBMCs. verdund menselijk perifeer bloed met PBS ten minste 1:2. Scheid de PBMCs door 15 mL dichtheidsgradiënt toe te voegen aan een buis van 50 mL en vervolgens 35 mL verdund volbloed te bedekken.
- Centrifugeer bij 850 x g gedurende 15 minuten zonder vertraging bij kamertemperatuur (RT). Dit zal resulteren in drie duidelijke lagen: de onderste laag met de rode bloedcel pellet, middelste laag van dichtheidsgradiënt medium met witte bloedcellen die de bovenste interface en de bovenste plasma laag14bekleden.
- Verwijder ongeveer 20 mL van de bovenste plasmaslaag. Verzamel de witte bloedcel laag, voorzichtig om te voorkomen dat de rode bloedcel pellet. Was 3x met PBS en Tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blauwe uitsluiting op een hemocytometer. Verdun tot 1 x 106 PBMCs/ml in PBS.
-
Niet-CFSE-gekleurde cellen
- Deze cellen worden gebruikt als compensatie controles voor Flowcytometrie, bestaande uit niet-bevlekt en CD4+ enkelvoudig-gekleurd cellen. Voeg 300 μL van elk controlemonster PBMC suspensie toe aan een tube van 10 mL, top met PBS, en centrifugeer bij 550 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Respendeer 1 x 106 cellen/ml in RP-5 media. Incuberen deze niet-gelabelde cellen gedurende 7 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO2 met de CFSE-gelabelde cellen (stap 2.6.1).
-
CFSE-gekleurd cellen
- Breng de cellen van stap 2,3 over in een buis van 50 mL. Voeg 1,0 μL CFSE-werkvoorraad oplossing (10 μM) toe per 1 mL celsuspensie aan de zijkant van de buis. Meng snel door de buis meerdere malen te inverteren. De uiteindelijke concentratie van CFSE is 10 nM.
- Incuberen gedurende 5 min in een incubator van 37 °C/5% CO2 . Om de kleuring te stoppen, voeg 5 mL RP-5 media toe, pellet de cellen door te centrifugeren gedurende 5 min bij 550 x g. Respendeer de PBMCs op 1 x 106/ml in de RP-5 media.
- Voeg 1,0 mL celsuspensie toe aan een tube van 10 mL. Gebruik één buis voor elk antigeen dat moet worden getest.
-
Antigene Stimulatie van menselijke PBMCs en celcultuur
- Cultuur humane CFSE-gelabelde PBMCs met antigenen in RP-5 media gedurende 7 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO2 . Cultuur 1 x 105 cellen/goed (100 μL) in een 96-put met 100 μL/goed van RP-5-media met verdund antigeen.
Opmerking: de gebruikte antigenen, inclusief werk concentraties, worden samengevat in tabel 1.
- Cultuur humane CFSE-gelabelde PBMCs met antigenen in RP-5 media gedurende 7 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO2 . Cultuur 1 x 105 cellen/goed (100 μL) in een 96-put met 100 μL/goed van RP-5-media met verdund antigeen.
3. anti-CD4 kleuring voor FACS analyse
- Pipetteer 200 μL van de gekweekte cellen in FACS buizen, was de cellen 1x in 1,0 mL PBS met 0,1% FCS, en Centrifugeer gedurende 5 min bij 550 x g.
- Vlek met anti-humane CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 mg/mL) in 100 μL PBS/0,1% FCS. Houd een monster van cellen met een CFSE-label buiten beschouwing, onbevlekt met andere fluor Foren, om te gebruiken voor het instellen van de FACS CFSE-compensatie. Inincuberen de cellen op 4 °C beschermd tegen licht gedurende 20 minuten.
- Was de cellen door 1 mL PBS/0,1% FCS toe te voegen, centrifugeer bij 550 x g gedurende 5 minuten bij RT en respendeer in 100 μL PBS/0,1% FCS. Voeg onmiddellijk vóór de analyse van de FACS 1 μL propidium jodide (PI, 0,1 mg/mL) toe aan alle buisjes, zodat de dode cellen kunnen worden uitgesloten door Flowcytometrie.
4. Flow cytometrische configuratie en gating strategie
Opmerking: Afbeelding 1 toont de FACS-configuratie, inclusief compensatie controles en gating-strategie.
- Gate de forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) (Figuur 1a) populatie om alle lymfocyten omvatten.
- De populatie van de FSC versus PI (Figuur 1b) op Pi-negatieve cellen om apoptotische cellen uit te sluiten.
- Gebruik ongekleurde cellen om een spannings basislijn in te stellen voor niet-fluorescerende cellen. Stel de spanningen voor de CD4-A647 en de CFSE zodanig in dat het fluorescentie signaal voor elk (figuur 1c) onder de 1.000 ligt. Gebruik de enkele kleurregelaars CFSE (figuur 1d) en CD4-A647 (Figuur 1e) om positieve fluorescentie signalen (~ 10.000) voor elke kleur te bevestigen met behulp van de voltages ingesteld met Onbevlekte cellen.
- CFSE en PI hebben een aantal spectrale overlap; Pas de compensatie aan om PI-Fluoresentie van CFSE-Fluoresentie af te trekken totdat het alleen-CFSE-monster geen signaal oplevert in het PI-kanaal.
Opmerking: Deze poorten werden toegepast op alle hierin geanalyseerde monsters.
5. berekening van de Celdelings index om de antigeen-specifieke CD4+ T-celproliferatie te inventariseren
Opmerking: Cell Division index (CDI) verwijst naar het aantal verdeelde cellen (CD4+/CFSEdim) per 5.000 ONVERDEELDE cellen (CD4+/CFSEBright). Wanneer het aantal niet-verdeelde CD4+ -cellen niet exact 5.000 is, wordt het aantal verdeelde cellen gecorrigeerd om het aantal verdeelde cellen per 5.000 onverdeelde cellen uit te drukken. Bijvoorbeeld, met behulp van de tetanus toxoid-specifieke proliferatie (figuur 2D), er waren 4.930 onverdeelde cellen (CFSEbright) en 3.268 verdeelde cellen (CFSEDim); Daarom is het gecorrigeerde aantal verdeelde cellen (5000/4930) x 3.268 = 3.304,3.
- Bereken het CDI (tabel 1) door het aantal verdeelde cellen/5000 onverdeelde cellen van de antigeen-gestimuleerde groep te delen door het gemiddelde aantal verdeelde cellen (per 5.000 onverdeelde cellen) uit de cellen gekweekt zonder antigeen (tabel 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro stimulatie van humane PBMCs met tetanus toxoïde proteïne: PBMCs werden gekleurd met CFSE en werden gedurende 7 dagen gestimuleerd in de aanwezigheid van tetanutoxoïde. Bijna alle donoren toonden een sterke T-cel respons op tetanutoxoïde omdat ze waren gevaccineerd, waardoor tetanus tetanustoxoïd een nuttige positieve controle antigeen. Figuur 2 toont in drievis, dat de proliferatie van de CFSE van CD4+ T cellen van ongestimuleerde PBMCs minimaal was (~ 12 CFSEDim cellen; Figuur 2a , B, C), terwijl er een duidelijke proliferatie van CD4+ T-cellen was in reactie op tetanutoxoïde (> 3000 CFSEDim cellen; Figuur 2D , E, F).
In vitro stimulatie van humane PBMCs met antigene peptiden: PBMCs werden gekleurd met CFSE en gestimuleerd gedurende 7 dagen in de aanwezigheid van humane proinsuline C-peptide. Figuur 3 demonstreert de detectie van Proinsuline C-peptide-specifieke CD4+ T-cellen in het perifere bloed van een persoon met diabetes type 1. Proliferatie werd niet waargenomen in de PBMC van de gezonde donor (gegevens niet weergegeven). In Figuur 4heeft PBMCs gestimuleerd met een influenza-A-virus (H1N1 PR8) matrix eiwit dat proliferatie vertoonde; de tetanus-specifieke respons voor deze donor was echter relatief zwak en de reacties zijn over het algemeen variabel tussen donoren.
Tezamen tonen deze resultaten aan dat de test kan worden uitgevoerd met volledige eiwitten en korte synthetische peptiden.
Figuur 1: compensatie controles en strategie voor de proliferatie van CD4+ T-cellen op basis van CFSE. Ongestimuleerde PBMCs na 7 dagen van in vitro celkweek. Lymfocyten (a) werden bevlekt met propidium jodide en propidium jodide-negatieve cellen werden afgesloten om dode cellen uit te sluiten (B). FACS compensatie controles opgenomen Onbevlekte cellen (C), cellen bevlekt met CFSE alleen (D), en cellen gekleurd met CD4 alleen (E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: proliferatie van CFSE-gebeitste tetanus-specifieke CD4+ T-cellen. PBMCs waren CFSE-gekleurd en gekweekt voor 7 dagen in de aanwezigheid van 145 ng/ml (166 LfU/ml) tetanus toxoid. Cellen werden gekleurd met CD4. CFSE verdunning wordt zonder antigeen (A-C) en in reactie op tetanus tetanustoxoïd proteïne (D-F) weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: proliferatie van met CFSE bevlekte humane CD4+ T-cellen in reactie op Proinsuline C-peptide. CFSE-gekleurd PBMCs werden gekweekt voor 7 dagen in de aanwezigheid van 10 μM proinsuline C-peptide. Cellen werden gekleurd met CD4. CFSE verdunning wordt getoond met behulp van PBMC van een donor met type 1 diabetes. Verdunning van de CFSE in ongestimuleerde PBMCs (A), tetanus tetanustoxoïd proteïne gestimuleerd (B), en humane proinsuline C-peptide gestimuleerd PBMCs (c). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: proliferatie van met CFSE bevlekte humane CD4 + T-cellen in reactie op influenza a-virus (H1N1 PR8) matrix proteïne 1. PBMCs waren CFSE-gekleurd en gekweekt gedurende 7 dagen in de aanwezigheid van 0,08 μg/mL influenza A virus matrix Protein 1. Cellen werden gekleurd met CD4. CFSE verdunning wordt getoond voor ongestimuleerde cellen (A), tetanus tetanustoxoïd gestimuleerd cellen (B), en influenza A virus matrix eiwit-gestimuleerde cellen (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Antigeen | Werkconcentratie |
| Tetanus Toxoïde proteïne | 145 ng/mL |
| Influenza A H1N1 (PR8) matrix proteïne 1 | 0.08 – 10 μg/mL |
| Proinsuline C-peptide PI33-63 | 10 nM |
Tabel 1: opsomming van tetanus-specifieke CD4+ -proliferatie. CDI berekeningen met behulp van 5.000 opgenomen flow cytometrie gebeurtenissen van ongestimuleerde en tetanus-gestimuleerd menselijke PBMC.
| Monster | Onverdeelde cellen CD4+CFSEhelder | Verdeelde cellen CD4+CFSEDim | Aantal verdeelde cellen CFSEDim/5.000 CFSEBright | Gemiddelde verdeelde cellen CFSEDim/5.000 CFSEBright | |
| Nil 1 | 5.004 | 11 | 11 | 12,3 | |
| Nil 2 | 4.995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5.006 | 12 | 12 | ||
| Monster | Onverdeelde cellen CD4+CFSEhelder | Verdeelde cellen CD4+CFSEDim | Aantal verdeelde cellen CFSEDim/5000 CFSEBright | CDI aantal verdeelde cellen (tetanus) gemiddelde verdeelde cellen (Nil) | Gemiddelde CDI |
| Tetanus 1 | 4.930 | 3.258 | 3.304,3 | 268 | 263,7 |
| Tetanus 2 | 4.928 | 3.205 | 3.251,8 | 263,7 | |
| Tetanus 3 | 4.910 | 3.142 | 3.199,6 | 259,5 |
Tabel 2: antigenen die worden gebruikt om de CD4+ -proliferatie te simuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proliferatie op basis van CFSE is een eenvoudige en robuuste methode voor het opsporen en inventariseren van antigeen-specifieke humane CD4+ T-cellen. Het is al eerder aangetoond dat het gebruik van de optimale concentratie van CFSE essentieel is voor optimale resultaten4. Te veel CFSE abrogates proliferatie, terwijl te weinig staat niet toe dat verdeelde en onverdeelde cellen te onderscheiden. Daarentegen worden relatief hoge concentraties (5,0 μM) van CFSE gebruikt om gezuiverde Murine T-cellen3te labelen. Vanwege de variabiliteit tussen batches wordt aanbevolen om elke batch te getitreerd om de optimale concentratie te bepalen. We gebruiken onze huidige batch bij een veel lagere concentratie (10 nM) dan in de oorspronkelijke publicatie (200 nM)4.
Een ander belangrijk aspect van deze methode is het optimaliseren van de antigeen dosis. Het is goed vastgesteld dat T-cellen gekweekt met minder antigeen kunnen gevoeliger en vertonen verbeterde functie. Dit werd oorspronkelijk aangetoond in de context van HIV peptiden15. De hoeveelheid tetanus tetanustoxoïd die in dit protocol wordt gebruikt, is ook eerder4 geoptimaliseerd om zeer gevoelige en proliferatieve CD4+ T-cellen uit te lokken. Interessant is eerder aangetoond dat overtollig antigeen antigeen-specifieke proliferatie15vermindert. Daarom is voor het opsporen en inventariseren van zeldzame T celpopulaties in perifeer bloed, het optimaliseren van zowel antigeen en CFSE concentratie is van het allergrootste belang.
Sinds de eerste test op basis van de humane kleurstof verdunning4zijn er veel vergelijkbare kleurstoffen ontwikkeld. We constateerden dat CD4+ T celproliferatie minder effectief werd ontdekt toen PKH-26, een lipofiele kleurstof, werd gebruikt in vergelijking met CFSE (ongepubliceerd). We hebben niet systematisch andere kleurstoffen op de markt getest, dus er is geen commentaar op hun relatieve sterktes. Het protocol voor het kwantificeren van de proliferatie van T-cellen is echter evenzeer van toepassing op alle assays van de kleurstof verdunning.
Het uitdrukken van proliferatie als een Cell Division index (CDI) omvat de achtergrond proliferatie in de berekening van de omvang van de reacties. In onze handen is de achtergrond meestal laag (bijvoorbeeld < 15 gebeurtenissen/5000 CD4+ CFSEBright). Achtergrond proliferatie varieert tussen individuen en experimenten. Met behulp van een ratio (in dit geval, de CDI) om de kracht van de proliferatie uit te drukken is enigszins effectief in het verminderen van de impact ervan op de resultaten. Achtergrond reacties op eiwitten in de media kunnen problematisch zijn. Het wordt aanbevolen om weefselkweek media te gebruiken die humaan serum bevatten, geen runderserum, omdat rundereiwitten een zwakke achtergrond respons kunnen stimuleren die de gevoeligheid van de assay vermindert. Een hoge achtergrond proliferatie is gevonden bij mensen die een milde infectie, vermoedelijk als gevolg van proliferatie die in vivo in reactie op infectie is klaar. In dergelijke gevallen moet de test worden herhaald zodra de donor de infectie heeft gewist.
De op CFSE gebaseerde proliferatie test kan worden aangepast om humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen op efficiënte wijze te klonen rechtstreeks van PBMCs12. Deze aanpak is bijvoorbeeld gebruikt voor het klonen van CD4+ T-cellen die specifiek zijn voor insuline12. Meer recentelijk heeft het klonen en de functionele analyse van Proinsuline C-peptide-specifieke CD4+ T-cellen een opmerkelijk inzicht gegeven in de pathogenese van T1D, met name bij patiënten met recente aanvang T1D13.
Concluderend, de op CFSE gebaseerde proliferatie test is zowel gevoelig als robuust. Het is snel en technisch eenvoudig en kan worden uitgevoerd met behulp van verse of cryopreserved PBMC. De mogelijkheid om CFSE in Multicolor FACS-analyse op te nemen, biedt een kwantitatieve meting van het aspecten van prolifererende T-cellen van PBMC met veel celtypen, en deze mate van detail is niet mogelijk met assays met behulp van DNA-integratie zoals [3H]-thymidine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door: de juveniele diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). De National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), operationeel infrastructuur ondersteuningsprogramma van de Victoriaanse overheid (S. M., A. D., E. T., M. S.) en NHMRC Postdoctorale studiebeurs APP1094337 en JDRF PhD top-up beurs (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
