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Immunology and Infection

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

doi: 10.3791/59545 Published: June 4, 2019

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4+ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.

Abstract

Beschrieben wird eine einfache, in vitro, auf Farbstoffen basierende Methode zur Messung der antigenspezifischen CD4+ T-Zellproliferation in mononukleären menschlichen Blutzellen (PBMCs). Die Entwicklung stabiler, ungiftiger Fluoreszenzfarbstoffe wie Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ermöglicht es, seltene, antigenspezifische T-Zellen von Umstehenden durch Verminderung der fluoreszierenden Färbung zu unterscheiden, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Diese Methode hat gegenüber alternativen Ansätzen folgende Vorteile: (i) Sie ist sehr empfindlich gegenüber niederfrequenten T-Zellen, (ii) es ist keine Kenntnis des Antigens oder Epitops erforderlich, (iii) der Phänotyp der reagierenden Zellen kann analysiert werden, und (iv) lebensfähig, Zellen können sortiert und für weitere Analysen verwendet werden, z. B. t Zellklonen.

Introduction

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Die Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu erkennen und zu untersuchen, ist in Studien zur zellvermittelten Immunität wichtig. Dies ist jedoch besonders anspruchsvoll für autoantigenspezifische CD4+ T-Zell-Antworten, die sehr schwach und schwer zu erkennen sind. Eine gängige Methode zum Nachweis der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation ist [3H]-Thymidin, ein radioaktiv markiertes Nukleotid, das in die DNA von proliferierenden Zellen integriert ist. Obwohl der [3H]-Thymidin-Assay die DNA-Synthese erkennen kann, ist diese Methode ein indirektes Maß für die Zellteilung, da die DNA-Synthese unabhängig von Mitose initiieren kann (d. h. bei Genduplizierung und Apoptose1). Dieses Problem wird durch die Tatsache verschlimmert, dass antigenspezifische Proliferation von Zellen zu einer erheblichen Apoptose führen kann2, was zu einer potenziellen Überschätzung der antigenspezifischen Proliferation führt. Darüber hinaus liefert die [3H]-Thymidin-Methode keine phänotypischen Informationen für vermehrende Lymphozyten, wie CD4+ oder CD8+ Lineage Proliferation in PBMCs, die mit antigenen Peptiden stimuliert werden.

Im Jahr 2003 veröffentlichten wir den ersten Farbstoffverdünnungstest mit CFSE, dem CFSE-basierten Proliferationstest3,4. CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff, der stabil an intrazelluläre Proteine bindet, indem er eine kovalente Bindung an intrazelluläre Lysinrückstände bildet. Da CFSE-markierte Proteine gleichmäßig auf Tochterzellen3aufgeteilt sind, können Zellen, die sich geteilt haben, von ungeteilten Zellen durch Durchflusszytometrie unterschieden werden, was auch die quantitative Phänotypisierung von Lymphozytenpopulationen ermöglicht. Tatsächlich kann die Anzahl der Divisionen, die eine Zelle seit der Zeit der CFSE-Färbung durchgemacht hat, bis zu einem gewissen Gradgemessenwerden 5 . In jüngerer Zeit wurden viele ähnliche Farbstoffe wie CellTrace Violet Proliferationsfarbstoff (VPD) und CytoTrack Farbstoff entwickelt, die in ähnlicher Weise arbeiten6. Dieses Protokoll konzentriert sich auf CFSE, aber die Prinzipien gelten gleichermaßen für andere verwandte Farbstoffe.

Peptid-MHC-Tetramerfärbung ist eine weit verbreitete Methode zum Erkennen und Klonen von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen. Dies ist eine etablierte Methode7,8,9,10; Das Klonen auf Tetramerbasis erfordert jedoch vorhandene Kenntnisse der Epitop-/MHC-Beschränkung und jedes Epitop erfordert sein eigenes Tetramer11, das den Umfang der Entdeckung und des Klonens neuartiger Epitop-spezifischer T-Zellen begrenzt. Die CFSE-basierte Proliferation kann mit Peptiden, Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und robust, und die antwortenden CD4+ T-Zellen können für den Einsatz in nachgelagerten funktionellen und biochemischen Charakterisierungstests12,13sortiert werden.

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Protocol

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Alle Probanden gaben vor der Entnahme von peripherem Blut eine informierte Einwilligung. Die ethische Zulassung für Experimente mit PBMC wurde von St. Vincent es Hosptial erteilt (HREC-A 135/08 und HREC-A 161/15).

1. Reagenz-Vorbereitung

  1. HumanE T-Zell-Medien
    1. Bereiten Sie RP-5-Medien für die Kultivierung von PBMC vor, das aus RPMI 1640, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (2 mM), Penicillin (100 U/mL)/Streptomycin (0,1 mg/ml) und 5% gepooltem humanem Serum (PHS) besteht.
  2. CFSE-Aktienlösungen
    1. Bereiten Sie einen Stammbestand vor, indem Sie 25 mg CFSE in 9 ml DMSO auflösen, um eine endgültige Bestandslösung mit einer Konzentration von 5 mM zu erzielen.
    2. Bereiten Sie einen Arbeitsbestand vor, indem Sie den Stammbestand in PBS verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 10 M zu erreichen.

2. Vorbereitung menschlicher PBMCs aus Vollblut

  1. Es gibt in der Regel zwischen 0,5–1,5 x 106 PBMCs/ml des peripheren Blutes. Daher hängt die benötigte Blutmenge von der gewünschten Anzahl an PBMCs ab. Verdünnen Sie das periphere Blut des Menschen mit PBS mindestens 1:2. Trennen Sie die PBMCs, indem Sie 15 ml Dichtegradientenmedium zu einem 50 ml-Rohr hinzufügen und dann 35 ml verdünntes Vollblut überlagern.
  2. Zentrifuge bei 850 x g für 15 min ohne Verzögerung bei Raumtemperatur (RT). Dies führt zu drei klaren Schichten: die untere Schicht, die das rote Blutkörperchen pellet enthält, die mittlere Schicht des Dichtegradientenmediums mit weißen Blutkörperchen, die ihre obere Oberfläche aussäumen, und die obere Plasmaschicht14.
  3. Entfernen Sie ca. 20 ml der oberen Plasmaschicht. Sammeln Sie die weiße Blutkörperchen Schicht, vorsichtig, um die rote Blutkörperchen Pellet zu vermeiden. Waschen Sie 3x mit PBS und zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer. In PBS auf 1 x 106 PBMCs/ml verdünnen.
  4. Nicht-CFSE-gefärbte Zellen
    1. Diese Zellen werden als Kompensationssteuerung für die Durchflusszytometrie verwendet, die aus ungefärbten und CD4+ eingefärbten Zellen besteht. Fügen Sie 300 l jeder Kontrollprobe PBMC Suspension zu einem 10 ml Rohr, oben mit PBS, und Zentrifuge bei 550 x g für 5 min bei RT.
    2. 1 x 106 Zellen/ml in RP-5-Medien aussetzen. Inkubieren Sie diese nicht beschrifteten Zellen 7 Tage lang in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator mit den CFSE-markierten Zellen (Schritt 2.6.1).
  5. CFSE-gefärbte Zellen
    1. Übertragen Sie die Zellen von Schritt 2,3 in ein 50 ml-Rohr. Fügen Sie 1,0 l CFSE-Arbeitsstofflösung (10 M) pro 1 ml Zellsuspension an der Seite des Rohres hinzu. Mischen Sie schnell, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Die endgültige Konzentration von CFSE beträgt 10 nM.
    2. Inkubieren Sie für 5 min in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator. Um die Färbung zu stoppen, fügen Sie 5 ml RP-5-Medien hinzu, pellet die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 550 x g. Setzen Sie die PBMCs in RP-5-Medien bei 1 x 106/ml aus.
    3. 1,0 ml Zellsuspension zu einem 10 ml Rohr geben. Verwenden Sie ein Rohr für jedes zu prüfende Antigen.
  6. Antigene Stimulation menschlicher PBMCs und Zellkultur
    1. Kultur humane CFSE-markierte PBMCs mit Antigenen in RP-5-Medien für 7 Tage in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator. Kultur 1 x 105 Zellen/Well (100 l) in einer 96-Well-Platte mit 100 l/Well von RP-5-Medien, die verdünntes Antigen enthalten.
      ANMERKUNG: Die verwendeten Antigene, einschließlich der Arbeitskonzentrationen, sind in Tabelle 1zusammengefasst.

3. Anti-CD4 Färbung für FACS-Analyse

  1. Pipette 200 l der kultivierten Zellen in FACS-Röhren, Waschzellen 1x in 1,0 ml PBS mit 0,1% FCS und Zentrifuge für 5 min bei 550 x g.
  2. Stain mit antihumaner CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 mg/ml) in 100 l PBS/0,1% FCS. Halten Sie eine Probe von CFSE-markierten Zellen beiseite, die mit anderen Fluorophoren nicht befleckt sind, um die FACS CFSE-Kompensation festzulegen. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C 20 min vor Licht geschützt.
  3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS/0,1% FCS, Zentrifuge bei 550 x g für 5 min bei RT hinzufügen, und in 100 l PBS/0,1% FCS wieder aussetzen. Unmittelbar vor der FACS-Analyse fügen Sie allen Röhren 1 L Propidiumjodid (PI, 0,1 mg/ml) hinzu, damit die abgestorbenen Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeschlossen werden können.

4. Flow Cytometric Configuration and Gating Strategy

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die FACS-Konfiguration einschließlich Kompensationskontrollen und Gating-Strategie.

  1. Gate der Vorwärtsstreuung (FSC) vs. Seitenstreuung (SSC) (Abbildung 1A) Population, um alle Lymphozyten einzubeziehen.
  2. Gate die FSC vs. PI (Abbildung 1B) Population auf PI negativen Zellen, um apoptotische Zellen auszuschließen.
  3. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um eine Spannungsbasislinie für nicht fluoreszierende Zellen festzulegen. Stellen Sie die Spannungen für CD4-A647 und CFSE so ein, dass das Fluoreszenzsignal für jeden Wert unter 1.000 liegt (Abbildung 1C). Verwenden Sie die einzelnen Farbsteuerungen CFSE (Abbildung 1D) und CD4-A647 (Abbildung 1E), um positive Fluoreszenzsignale (10.000 USD) für jede Farbe zu bestätigen, wobei die Mitspannungen verwendet werden, die mit ungefärbten Zellen eingestellt sind.
  4. CFSE und PI haben einige spektrale Überlappung; die Kompensation anpassen, um die PI-Fluoresenz von der CFSE-Fluoresenz zu subtrahieren, bis die reine CFSE-Probe kein Signal im PI-Kanal liefert.
    HINWEIS: Diese Tore wurden auf alle hier analysierten Proben angewendet.

5. Berechnung des Zellteilungsindex zur Aufzählung antigenspezifischer CD4+ T-Zellproliferation

HINWEIS: Der Zellteilungsindex (CDI) bezieht sich auf die Anzahl der geteilten Zellen (CD4+/CFSEdim) pro 5.000 ungeteilte Zellen (CD4+/ CFSEhell). Wenn die Anzahl der ungeteilten CD4+ Zellen nicht genau 5.000 beträgt, wird die Anzahl der geteilten Zellen korrigiert, um die Anzahl der geteilten Zellen pro 5.000 ungeteilten Zellen auszudrücken. Zum Beispiel gab es mit der Tetanus-Toxoid-spezifischen Proliferation (Abbildung 2D), 4.930 ungeteilte Zellen (CFSEhell)und 3.268 geteilte Zellen (CFSEdim); Daher ist die korrigierte Anzahl der geteilten Zellen (5.000/4.930) x 3.268 = 3.304,3.

  1. Berechnen Sie die CDI (Tabelle 1) durch Division der Anzahl der geteilten Zellen/5.000 ungeteilten Zellen aus der antigenstimulierten Gruppe durch die mittlere Anzahl der geteilten Zellen (pro 5.000 ungeteilte Zellen) aus den Zellen, die ohne Antigen kultiviert wurden (Tabelle 2).

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Representative Results

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In-vitro-Stimulation menschlicher PBMCs mit Tetanus-Toxoid-Protein: PBMCs wurden mit CFSE gefärbt und 7 Tage lang in Gegenwart von Tetanus-Toxoid stimuliert. Fast alle Spender zeigten eine starke T-Zell-Reaktion auf Tetanus-Toxoid, weil sie geimpft worden waren, was Tetanus-Toxoid zu einem nützlichen Positiv-Kontroll-Antigen macht. Abbildung 2 zeigt in dreifacher Ausfertigung, dass die CFSE-Proliferation von CD4+ T-Zellen aus nicht stimulierten PBMCs minimal war (12 CFSE-Dim-Zellen; Abbildung 2A ,B,C), während es eine deutliche Proliferation von CD4+ T-Zellen als Reaktion auf Tetanus-Toxoid (>3.000 CFSE-Dim-Zellen; Abbildung 2D ,E,F).

In-vitro-Stimulation menschlicher PBMCs mit antigenen Peptiden: PBMCs wurden mit CFSE gefärbt und 7 Tage lang in Gegenwart von humanem Proinsulin C-Peptid stimuliert. Abbildung 3 zeigt den Nachweis von Proinsulin C-Peptid-spezifischen CD4+ T-Zellen im peripheren Blut eines Individuums mit Typ-1-Diabetes. Die Proliferation wurde im PBMC des gesunden Spenders nicht beobachtet (Daten wurden nicht angezeigt). In Abbildung 4zeigten PBMCs, die mit dem Influenza-A-Virus (H1N1 PR8) stimuliert wurden, eine Proliferation; Die Tetanus-spezifische Reaktion für diesen Spender war jedoch relativ schwach, und die Reaktionen sind zwischen den Gebern im Allgemeinen unterschiedlich.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass der Assay mit vollfängigen Proteinen und kurzen synthetischen Peptiden durchgeführt werden kann.

Figure 1
Abbildung 1: Kompensationskontrollen und Gating-Strategie für die CFSE-basierte Proliferation von CD4+ T-Zellen. Unstimulierte PBMCs nach 7 Tagen In-vitro-Zellkultur. Lymphozyten (A) wurden mit Propidiumiodid gefärbt, und Propidium iodid-negative Zellen wurden abgezäurt, um abgestorbene Zellen auszuschließen (B). Die FACS-Kompensationskontrollen umfassten ungefärbte Zellen (C), Zellen, die allein mit CFSE gefärbt waren (D), und Zellen, die mit CD4 allein gefärbt waren (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Proliferation von CFSE-gebeizten Tetanus-spezifischen CD4+ T-Zellen. PBMCs wurden in Gegenwart von 145 ng/ml (166 LfU/mL) Tetanustoxoid 7 Tage lang CFSE-gefärbt und kultiviert. Die Zellen wurden mit CD4 befleckt. CFSE-Verdünnung wird ohne Antigen (A-C) und als Reaktion auf Tetanus-Toxoid-Protein (D-F) gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Proliferation von CFSE-gefleckten menschlichen CD4+ T-Zellen als Reaktion auf Proinsulin C-Peptid. CFSE-befleckte PBMCs wurden 7 Tage lang in Gegenwart von 10 M Proinsulin C-Peptid kultiviert. Die Zellen wurden mit CD4 befleckt. CFSE-Verdünnung wird mit PBMC von einem Spender mit Typ-1-Diabetes gezeigt. CFSE-Verdünnung in nicht stimulierten PBMCs (A), Tetanus-Toxoid-Protein stimuliert (B), und humanes Proinsulin C-Peptid stimulierte PBMCs (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Proliferation von CFSE-gefleckten menschlichen CD4+ T-Zellen als Reaktion auf das Matrixprotein 1 des Influenza-A-Virus (H1N1 PR8). PBMCs wurden 7 Tage lang CFSE-gefärbt und kultiviert in Gegenwart von 0,08 g/ml Influenza-A-Virusmatrixprotein 1. Die Zellen wurden mit CD4 befleckt. CfSE-Verdünnung wird für nicht stimulierte Zellen (A), Tetanus toxoid stimulierte Zellen (B) und Influenza A Virusmatrix-Protein-stimulierte Zellen (C) gezeigt.      Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antigen Arbeitskonzentration
Tetanus Toxoid Protein 145 ng/mL
Influenza A H1N1 (PR8) Matrixprotein 1 0,08–10 g/ml
Proinsulin C-Peptid PI33-63 10 nM

Tabelle 1: Aufzählung der Tetanus-spezifischen CD4+ Proliferation. CDI-Berechnungen mit 5.000 aufgezeichneten Strömungszytometrie-Ereignissen aus unstimuliertem und tetanusstimuliertem humanem PBMC.

probe Ungeteilte Zellen CD4+CFSEhell Geteilte Zellen CD4+CFSEdim Anzahl der geteilten Zellen CFSEdim/5.000 CFSEhell Mittelgeteilte Zellen CFSEdim/5.000 CFSEhell
Nil 1 5.004 11 11 12,3
Nil 2 4.995 14 14
Nil 3 5.006 12 12
probe Ungeteilte Zellen CD4+CFSEhell Geteilte Zellen CD4+CFSEdim Anzahl der geteilten Zellen CFSEdim/ 5000 CFSEhell CDI Anzahl der geteilten Zellen (Tetanus) Mittelgeteilte Zellen (Nil) Mittlere CDI
Tetanus 1 4.930 3.258 3.304,3 268 263,7
Tetanus 2 4.928 3.205 3.251,8 263,7
Tetanus 3 4.910 3.142 3.199,6 259,5

Tabelle 2: Antigene zur Simulation von CD4+ Proliferation.

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Discussion

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CFSE-basierte Proliferation ist eine einfache und robuste Methode zum Erkennen und Aufzählen von antigenspezifischen menschlichen CD4+ T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, dass die optimale Konzentration von CFSE für optimale Ergebnisse unerlässlich ist4. Zu viel CFSE hebt die Proliferation auf, während zu wenig nicht zulässt, dass geteilte und ungeteilte Zellen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu werden relativ hohe CfSE-Konzentrationen (5,0 m) zur Kennzeichnung gereinigter muriner T-Zellen3verwendet. Aufgrund der Variabilität zwischen den Chargen wird empfohlen, jede Charge zu titrieren, um die optimale Konzentration zu bestimmen. Wir verwenden unsere aktuelle Charge in einer viel niedrigeren Konzentration (10 nM) als in der Originalpublikation (200 nM)4.

Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Methode ist die Optimierung der Antigendosis. Es ist gut erwiesen, dass T-Zellen mit weniger Antigen kultiviert können empfindlicher sein und verbesserte Funktion aufweisen. Dies wurde ursprünglich im Zusammenhang mit HIV-Peptiden15nachgewiesen. Die Menge an Tetanus-Toxoid, die in diesem Protokoll verwendet wird, wurde auch zuvor4 optimiert, um hochempfindliche und proliferative CD4+ T-Zellen auszulösen. Interessanterweise wurde bereits gezeigt, dass überschüssiges Antigen antigenspezifische Proliferationreduziert 15. Daher ist die Optimierung der Antigen- und CFSE-Konzentration von größter Bedeutung, um seltene T-Zellpopulationen im peripheren Blut zu erkennen und aufzuzählen.

Seit der Veröffentlichung des ersten humanen Farbverdünnungs-basierten Assays4wurden viele ähnliche Farbstoffe entwickelt. Wir fanden heraus, dass die Proliferation von CD4+ T-Zellen weniger effektiv nachgewiesen wurde, wenn PKH-26, ein lipophiler Farbstoff, im Vergleich zu CFSE (unveröffentlicht) verwendet wurde. Wir haben andere Farbstoffe nicht systematisch auf dem Markt getestet, daher gibt es keinen Kommentar zu ihren relativen Stärken. Das Protokoll zur Quantifizierung der T-Zellproliferation ist jedoch gleichermaßen auf alle Farbverdünnungs-Proliferationstests anwendbar.

Die Angabe der Proliferation als Zellteilungsindex (CDI) beinhaltet die Hintergrundproliferation in die Berechnung der Stärke der Antworten. In unseren Händen ist der Hintergrund in der Regel niedrig (z.B. <15 Ereignisse/5.000 CD4+ CFSEhell). Die Verbreitung des Hintergrunds variiert zwischen Individuen und Experimenten. Die Verwendung eines Verhältnisses (in diesem Fall des Ziege), um die Stärke der Proliferation auszudrücken, ist etwas effektiv bei der Verringerung ihrer Auswirkungen auf die Ergebnisse. Hintergrundreaktionen auf Proteine in den Medien können problematisch sein. Es wird empfohlen, Gewebekulturmedien zu verwenden, die menschliches Serum enthalten, nicht Rinderserum, da Rinderproteine eine schwache Hintergrundreaktion stimulieren können, die die Empfindlichkeit des Assays verringert. Eine hohe Hintergrundproliferation wurde bei Menschen gefunden, die eine leichte Infektion haben, vermutlich aufgrund der Proliferation, die in vivo als Reaktion auf eine Infektion grundiert wird. In solchen Fällen muss der Test wiederholt werden, sobald der Spender die Infektion gelöscht hat.

Der CFSE-basierte Proliferationstest kann modifiziert werden, um menschliche antigenspezifische CD4+ T-Zellen direkt aus PBMCs12effizient zu klonen. Dieser Ansatz wurde beispielsweise zum Klonen von CD4+ T-Zellen verwendet, die speziell für Insulin12spezifisch sind. In jüngerer Zeit haben Klon- und funktionelle Analysen von Proinsulin C-Peptid-spezifischen CD4+ T-Zellen bemerkenswerte Einblicke in die Pathogenese von T1D gegeben, insbesondere bei Patienten mit kürzlichem Beginn T1D13.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der CFSE-basierte Proliferationstest sowohl empfindlich als auch robust ist. Es ist schnell und technisch einfach und kann mit frischem oder kryokonserviertem PBMC durchgeführt werden. Die Möglichkeit, CFSE in die mehrfarbige FACS-Analyse zu integrieren, liefert ein quantitatives Maß für den Immunophenotyp von sich ausbreitenden T-Zellen aus PBMC, die viele Zelltypen enthalten, und dieser Detaillierungsgrad ist bei Assays unter Verwendung von DNA-Inkorporation nicht möglich. wie [3H]-Thymidin.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). The National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Operational Infrastructure Support Program of the Victorian Government (S. M., A. D., E. T., M. S.) und NHMRC Postgraduate Scholarship APP1094337 und JDRF PhD Top-up Scholarship (M. S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

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References

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Cite this Article

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).More

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

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