Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

doi: 10.3791/59545 Published: June 4, 2019

Summary

הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4+ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.

Abstract

מתוארים הוא פשוט, באופן מתורבת, לדילול צבען שיטה מבוססת למדידת אנטיגן ספציפי CD4+ T התפשטות התא של דם היקפי בתאי מונפינקה (PBMCs). התפתחות יציבה, שאינם רעילים, צבעי פלורסנט כגון carboxyfluorescmidyl באסטר (CFSE) מאפשר נדיר, אנטיגן ספציפיים תאים T להיות נבדל מעוברי אורח על ידי צמצום בצביעת פלורסנט, כפי שזוהה על ידי הזרמת cy try. שיטה זו כוללת את היתרונות הבאים על פני גישות חלופיות: (i) היא רגישה מאוד לתאי T בתדר נמוך, (ii) לא ניתן לנתח את האנטיגן או האפיפי, (iii) הפנוטיפים של התאים המגיבים ניתנים לניתוח, ו-(iv) קיימא, תגובה ניתן למיין ולהשתמש בתאים לצורך ניתוח נוסף, כגון שכפול תא T.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת לזהות וללמוד אנטיגן מסוים תאים T חשוב במחקרים של חסינות התא בתיווך. עם זאת, עושה זאת היא מאתגרת במיוחד עבור התגובות autoantigen ספציפי CD4+ T-cell תשובות, אשר חלשים מאוד קשה לזהות. שיטה נפוצה המשמשת לזיהוי של הפצת לימפוציטים ספציפיים אנטיגן היא [3H]-thymidine, שהוא נוקלאוטיד הקרינה משולבים ל-DNA של תאים מתרבים. למרות העובדה [3h]-thymidine יכול לזהות סינתזה dna, שיטה זו היא מידה עקיפה של החטיבה התא, משום סינתזה dna יכול ליזום עצמאית של מיטוזה (כלומר, במהלך שכפול גנים ו אפופטוזיס1). בעיה זו היא מורכבת על ידי העובדה אנטיגן ספציפי התפשטות של תאים יכול לגרום אפופטוזיס ניכרת2, המוביל להערכת יתר פוטנציאלי של התפשטות אנטיגן ספציפי. יתר על כן, השיטה [3h]-thymidine אינו מספק מידע פנוטימית עבור לימפוציטים מתרבים, כגון CD4+ או CD8+ שושלת היוחסין ב pbmcs מגורה עם פפטידים העברה אנטיגנית.

בשנת 2003, פרסמנו את השיטה הראשונה לדילול הצבע באמצעות cfse, שנקרא שיטת ההפצה המבוססת על cfse3,4. CFSE הוא צבע פלורסנט הנקשר באופן בלתי נשכח חלבונים תאיים על ידי יצירת קשר קוולנטי לשקעי ליזין תאיים. מאז החלבונים CFSE-התווית מחולקים באופן שווה בין תאים ביתי3, תאים אשר מחולקים יכול להיות נבדל מתאים מאוחדת על ידי הזרמת cy, אשר גם מאפשר פנוטיפים כמותיים של אוכלוסיות לימפוציטים. אכן, מספר מחלקות התא עבר מזמן של CFSE-צביעת ניתן למדוד במידה מסוימת5. לאחרונה, צבעים דומים רבים כמו CellTrace צבע ויולט התפשטות (VPD) ו-ציטוtrack צבען פותחו, אשר פועלים באופן דומה6. פרוטוקול זה מתמקד CFSE, אבל העקרונות חלים באופן שווה על צבעים אחרים הקשורים.

פפטיד-MHC מכתים כתמים היא שיטה נפוצה לגילוי ושיבוט של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. זוהי שיטה מבוססת היטב7,8,9,10; עם זאת, שיבוט מבוסס הטטרמר דורש ידע קיים של ההגבלה האפירופה/MHC וכל אפירופה דורש את הטטרזה11שלו, אשר מגביל את היקף הגילוי והשכפול של תאי T ספציפיים לספרות. התפשטות CFSE מבוססי ניתן להשתמש עם פפטידים, חלבונים, או lysates תא. הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט ויציב, והתאים המגיבים CD4+ T יכולים להיות ממוינים לשימוש בתוך האפיון התפקודי והביוכימיים במורד הזרם12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הנושאים העניקו הסכמה מושכלת לפני איסוף הדם ההיקפי. אישור מוסרי לניסויים באמצעות ה-PBMC ניתן על-ידי וינסנט הקדוש (HREC-A 135/08 ו-HREC-A 161/15).

1. הכנה מגיב

  1. מדיה סלולרית אנושית
    1. להכין RP-5 מדיה עבור culturing PBMC, אשר מורכב RPMI 1640, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד (2 מ"מ), פניצילין (100 U/mL)/streptomycin (0.1 mg/mL), ו 5% סרום אנושי במאגר (מאלפים).
  2. CFSE פתרונות מניות
    1. להכין מלאי הורים על ידי המסת 25 מ"ג של CFSE ב ~ 9 מ ל של DMSO כדי להשיג פתרון מניות סופי עם ריכוז של 5 מ"מ.
    2. הכינו מלאי עבודה על ידי דילול המניה הראשית ב-PBS כדי להשיג ריכוז עובד של 10 μM.

2. הכנת PBMCs של בני אדם מכל דם

  1. יש בדרך כלל בין 0.5 – 1.5 x 106 pbmcs/mL של דם היקפי אנושי. לכן, כמות הדם הנדרשת תלויה במספר הרצוי של PBMCs. לדלל דם היקפי אנושי עם PBS לפחות 1:2. הפרד את PBMCs על-ידי הוספת 15 mL של צפיפות מעבר הצבע לצינור 50 mL, ואז שכבת-על 35 mL של דם שלם מדולל.
  2. צנטריפוגה ב 850 x g עבור 15 דקות ללא האטה בטמפרטורת החדר (RT). זה יגרום שלוש שכבות ברורות: השכבה התחתונה המכילה את הגלולה תא דם אדום, השכבה האמצעית של בינוני מעבר הדרגתי עם כדוריות הדם הלבנות בטנת הממשק העליון שלה, ושכבת פלזמה העליון14.
  3. הסר כ-20 מ ל של שכבת הפלזמה העליונה. לאסוף את שכבת התאים הלבנים דם, להיות זהיר כדי למנוע את הגלולה תא דם אדום. לשטוף את 3x עם PBS ולספור תאים קיימא באמצעות טריקון כחול הדרה על החולה החולה. דלל ל 1 x 106 pbmcs/mL ב-PBS.
  4. תאים שאינם מוכתמים CFSE
    1. תאים אלה משמשים כפקדי פיצוי לזרימה cy, המורכב מCD4+ תאים בודדים ומוכתם. הוסף 300 μL של כל מדגם שליטה הבולם PBMC לצינור 10 mL, למעלה עם PBS, ו צנטריפוגה ב 550 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    2. השהה מחדש 1 x 106 תאים/ML ב RP-5 מדיה. דגירה אלה תאים ללא תווית עבור 7 ימים ב 37 ° c/5% החממה CO2 עם התאים המסומנים cfse (שלב 2.6.1).
  5. תאים מוכתמים CFSE
    1. העבר את התאים משלב 2.3 לתוך צינור 50 mL. הוסף 1.0 μL של פתרון מלאי העבודה CFSE (10 μM) עבור 1 mL של השעיית תא לצד הצינור. מערבבים במהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. הריכוז הסופי של CFSE הוא 10 ננומטר.
    2. דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c/5% החממה CO2 . כדי לעצור את ההכתמים, להוסיף 5 מ ל של RP-5 מדיה, גלולה את התאים על ידי תפרידו עבור 5 דקות ב 550 x g. השהה מחדש את ה-PBMCs ב-1 x 106/mL במדיית RP-5.
    3. הוסף 1.0 mL של השעיית תא לצינור 10 מ ל. השתמש בצינור אחד עבור כל אנטיגן להיבדק.
  6. הגירוי האנטי-הגניים של התרבות והתאים האנושיים
    1. התרבות האנושית CFSE מתויג PBMCs עם אנטיגנים ב RP-5 מדיה עבור 7 ימים ב 37 ° c/5% החממה CO2 . תרבות 1 x 105 תאים/גם (100 μl) ב 96 צלחת באר עם 100 μl/טוב של RP-5 מדיה המכילה אנטיגן מדולל.
      הערה: אנטיגנים המשמשים, כולל ריכוזי עבודה, מסוכמים בטבלה 1.

3. אנטי CD4 צביעת לניתוח FACS

  1. פיפטה 200 μL של תאים מתורבתים לצינורות FACS, לשטוף את התאים 1x ב 1.0 mL של PBS המכיל 0.1% FCS, ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 550 x g.
  2. כתם עם אנטי אדם CD4 אלקסה Fluor 647 (0.25 mg/mL) ב 100 μL של PBS/0.1% FCS. לשמור הצידה מדגם של תאים CFSE-מתויג, ללא המוכתמת עם כל fluorophores אחרים, כדי להשתמש עבור הגדרת פיצוי CFSE cfc. מודגנת את התאים ב 4 ° צ' מוגן מפני אור עבור 20 דקות.
  3. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 mL של PBS/0.1% FCS, צנטריפוגה ב 550 x g עבור 5 דקות ב-RT, ו להשעות מחדש ב 100 μl של PBS/0.1% fcs. מיד לפני ניתוח FACS, להוסיף 1 μL של propidium יודיד (PI, 0.1 mg/mL) על כל הצינורות כדי לאפשר את התאים מתים להיות נשלל על-ידי cy, לנסות הזרימה.

4. הגדרת התצורה והאסטרטגיה של הזרימה

הערה: איור 1 מציג את תצורת ה-facs כולל שולטת פיצוי והערכת אסטרטגיה.

  1. שער האוכלוסיה העברה (FSC) לעומת פיזור בצד (מתחת לפני המטה) (איור 1a) שתכלול את כל לימפוציטים.
  2. השער את האוכלוסיה של FSC vs. PI (איור 1B) בתאים שליליים של pi כדי שלא יכללו תאים אפוטוטיים.
  3. השתמש בתאים שאינם מוכתמים כדי לקבוע בסיס מתח עבור תאים שאינם פלורסנט. הגדר את המתח עבור CD4-A647 ו CFSE כך את האות הפלואורסצנטית הוא מתחת 1,000 עבור כל (איור 1C). השתמש בפקדי צבע יחיד CFSE (איור 1D) ו-CD4-A647 (איור 1d) כדי לאשר אותות פלורסנט חיוביים (~ 10,000) לכל צבע, תוך שימוש במתח הקבוע עם תאים לא מוכתמים.
  4. CFSE ו-PI יש חפיפה ספקטרלית; להתאים את הפיצוי כדי להחסיר הפחתה של PI fluoresence מתוך CFSE fluoresence עד שמדגם CFSE בלבד אינו מהניב אות בערוץ ה-PI.
    הערה: השערים הללו הוחלו על כל. הדגימות שנותחו במסמך זה

5. חישוב של מדד החטיבה תא לספירת אנטיגן ספציפי CD4+ T הפצת תאים

הערה: מדד חלוקת תאים (CDI) מתייחס למספר התאים המחולקים (CD4+/cfsedim5,000) לתאים מאוחדת (CD4+/cfse בהיר). כאשר מספר התאים CD4+ מחולקת אינו בדיוק 5,000, מספר התאים המחולקים מתוקן כדי לבטא את מספר התאים המחולקים ל-5,000 תאים לא מאוחדת. לדוגמה, שימוש בהתפשטות הספציפית של טטנוס (איור 2D), היו 4,930 תאים מאוחדת (cfseבהירים) ו-3,268 תאים מחולקים (cfsedim); לפיכך, המספר המתוקן של תאים מחולקים הוא (5000/4930) x 3,268 = 3,304.3.

  1. לחשב את CDI (טבלה 1) על ידי חלוקת מספר תאים מחולקים/5000 תאים מחולקת מהקבוצה אנטיגן-מגורה על-ידי מספר ממוצע של תאים מחולקים (לכל 5,000 תאים מאוחדת) מן התאים התרבותי ללא אנטיגן (שולחן2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בגירוי מתורבת של PBMCs האדם עם חלבון טוקאיד טטנוס: PBMCs היו מוכתמים CFSE ו מגורה עבור 7 ימים בנוכחות של טטנוס רעלים. כמעט כל התורמים הראו תגובה תא T חזקה לרעלים טטנוס בגלל שהם חוסנו, מה שהופך את הטטנוס טוקסין שימושי אנטיגן שליטה חיובית. איור 2 מדגים בטרילקאט, כי התפשטות cfse של CD4+ T תאים מ pbmcs לא מגורה היה מינימלי (~ 12 cfseעמום תאים; איור 2A , B, C), בעוד היה מסומן התפשטות של CD4+ T תאים בתגובה טטנוס טוקסואידי של (> 3000 cfseעמום תאים; איור 2D , E, F).

בגירוי מחוץ לגוף של pbmcs עם פפטידים אנטיגניים: pbmcs היו מוכתמים cfse ו מגורה עבור 7 ימים בנוכחות של האדם פרואינסולין C-פפטיד. איור 3 מדגים את הגילוי של פרואינסולין C-פפטיד CD4+ T תאים בתוך דם היקפי של אדם עם סוכרת מסוג 1. התפשטות לא נצפתה ב-PBMC של התורם הבריא (נתונים לא מוצגים). באיור 4, pbmcs הגירוי עם שפעת A וירוס (H1N1 PR8) חלבון מטריצה הפגינו התפשטות; עם זאת, התגובה הספציפית טטנוס עבור תורם זה היה חלש יחסית, ותגובות הן בדרך כלל משתנה בין תורמים.

ביחד, תוצאות אלו מדגימות כי ניתן לבצע את האפשרות באמצעות חלבונים באורך מלא ופפטידים סינתטיים קצרים.

Figure 1
איור 1: שולטת פיצוי והמשך אסטרטגיה עבור התפשטות CFSE מבוססי CD4+ T תאים. PBMCs לאחר 7 ימים של תרבות תא מבחנה. לימפוציטים (א) היו מוכתמים propidium יודיד, ו propidium יודיד-תאים שליליים היו מגודרת להוציא תאים מתים (ב). שולטת הפיצויים של FACS כללו תאים בלתי מוכתמים (C), תאים מוכתמים cfse לבד (D), ותאים מוכתם CD4 לבד (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התפשטות של מוכתם CFSE-טטנוס CD4+ T ספציפיים. Pbmcs היו CFSE מוכתם ותרבותי עבור 7 ימים בנוכחות של 145 ng/ml (166 LfU/ml) טטנוס רעלים. התאים היו מוכתמים בCD4. דילול CFSE מוצג ללא אנטיגן (A-C) ובתגובה לחלבון טוקאיד טטנוס (D-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התפשטות התאים האנושיים CD4+ T של האדם בתגובה לפרואינסולין C-פפטיד. Cfse-מוכתם pbmcs היו מתורבתים למשך 7 ימים בנוכחות 10 μm פרואינסולין C-פפטיד. התאים היו מוכתמים בCD4. דילול CFSE מוצג באמצעות PBMC מתורם עם סוכרת מסוג 1. דילול cfse ב pbmcs בלתי מגורה (A), גירוי חלבונים טטנוס (B), ו-פרואינסולין C-פפטיד מגורה pbmcs (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התפשטות הCD4 האנושית של CFSE-האדם + T בתגובה לשפעת וירוס (H1N1 PR8) חלבון מטריצה 1. PBMCs היו CFSE-מוכתם ותרבותי עבור 7 ימים בנוכחות של 0.08 μg/mL שפעת חלבון מטריצה 1. התאים היו מוכתמים בCD4. דילול CFSE מוצג עבור תאים בלתי ממריצים (א), ממריצים בתאי טטנוס (ב), ושפעת מטריצה וירוס בתאים ממריצים (C).      אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אנטיגן עבודה בריכוז
החלבון טטנוס 145 ng/mL
שפעת (PR8) חלבון מטריצות 1 0.08 – 10 μg/mL
פרואינסולין C-פפטיד PI33-63 10 ננומטר

טבלה 1: ספירת CD4+ הפצה ספציפית לטטנוס. CDI חישובים באמצעות 5,000 זרם מוקלט cy, האירועים מתוך גירוי ו טטנוס-מגורה אדם PBMC.

דוגמה תאים מאוחדת CD4+cfseבהיר תאים מחולקים CD4+cfsedim מספר התאים המחולקים CFSEעמום/5,000 cfseבהיר מתכוון תאים מחולקים CFSEעמום/5,000 cfseבהיר
נילי 1 5,004 11 11 12.3
נילי 2 4,995 14 14
אפס 3 5,006 12 12
דוגמה תאים מאוחדת CD4+cfseבהיר תאים מחולקים CD4+cfsedim מספר התאים המחולקים CFSEעמום/5000 cfseבהיר מספר CDI של תאים מחולקים (טטנוס) ממוצע תאים מחולקים (אפס) משמעות הדבר
טטנוס 1 4,930 3,258 3,304.3 268 263.7
טטנוס 2 4,928 3,205 3,251.8 263.7
טטנוס 3 4,910 3,142 3,199.6 259.5

שולחן 2: אנטיגנים המשמשים להדמיית CD4+ הפצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התפשטות CFSE מבוססת היא שיטה פשוטה ואיתנה לזיהוי ולספירה של תאים אנושיים ספציפיים CD4+ T. זה כבר הוכיחה בעבר כי באמצעות ריכוז אופטימלי של CFSE חיוני עבור תוצאות אופטימליות4. יותר מדי CFSE abrogates התפשטות, בעוד מעט מדי אינו מאפשר לתאים מחולקים ומחולקת להיות מכובד. לעומת זאת, ריכוזים גבוהים יחסית (5.0 μM) של CFSE משמשים לתווית מוריין T מטוהרים תאים3. עקב שינויים בין קבוצות, מומלץ כי כל אצווה תהיה מרוצה כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי. אנו משתמשים באצווה הנוכחית שלנו בריכוז נמוך בהרבה (10 ננומטר) מאשר בפרסום המקורי (200 nM)4.

היבט חשוב נוסף של שיטה זו הוא אופטימיזציה של המינון אנטיגן. זה כבר הוקמה היטב כי תאים T מתורבתים עם פחות אנטיגן יכול להיות רגיש יותר מוצג פונקציה משופרת. זה הוכח במקור בהקשר של פפטידים HIV15. כמות של טטנוס רעלים בשימוש בפרוטוקול זה יש גם אופטימיזציה בעבר4 כדי לעורר רגיש מאוד מתרבים CD4+ T תאים. מעניין, זה כבר הוכח בעבר כי אנטיגן עודף מפחית התפשטות ספציפיים אנטיגן15. לכן, כדי לזהות ולספור אוכלוסיות נדירות תא T בתוך דם היקפי, אופטימיזציה הן אנטיגן ו-CFSE ריכוז הוא בעל חשיבות עליונה.

מאז שפרסמנו את השיטת דילול הצבע הראשונה המבוססת על האדם4, צבעים דומים רבים פותחו. מצאנו כי הפצת התא CD4+ T זוהה פחות ביעילות כאשר pkh-26, ליפוליים צבע, שימש לעומת cfse (לא פורסם). לא בדקנו באופן שיטתי צבעים אחרים בשוק, כך שאין תגובה על החוזקות היחסיות שלהם. עם זאת, הפרוטוקול לכמת את התפשטות התא T חל באותה מידה על כל הפצת דילול הצבע שאומר.

הבעת התפשטות כמדד של חלוקת תאים (CDI) משלבת את התפשטות הרקע לחישוב גודל התגובות. בידינו, הרקע הוא בדרך כלל נמוך (למשל, < 15 אירועים/5000 CD4+ cfse בהיר). התפשטות הרקע משתנה בין אנשים וניסויים. באמצעות יחס (במקרה זה, CDI) כדי לבטא את עוצמת ההתפשטות הוא יעיל במידה מסוימת בהפחתת השפעתה על התוצאות. תגובות הרקע לחלבונים במדיה יכולים להיות בעייתיים. מומלץ להשתמש במדיה של תרבות הרקמה המכילים סרום אנושי, לא סרום בשור, כמו חלבונים של השור יכול לעורר תגובת רקע חלשה הפוחתת הרגישות של השיטת. התפשטות רקע גבוה נמצא אצל אנשים שיש להם זיהום קל, ככל הנראה בשל התפשטות הvivo בתגובה לזיהום. במקרים כאלה, יש לחזור על הדרישות ברגע שתורם ניקה את הזיהום.

ניתן לשנות את שיטת ההפצה המבוססת על CFSE כדי לשכפל ביעילות את תאי CD4+ T הספציפיים לאנטיגן ישירות מ-PBMCs12. לדוגמה, גישה זו שימש לשכפול CD4+ T תאים ספציפיים עבור אינסולין12. לאחרונה, שיבוט וניתוחים פונקציונליים של פרואינסולין C-פפטיד CD4+ T תאים סיפק תובנה מדהימה לתוך הפתוגנזה של T1D, במיוחד בחולים עם התחלתה האחרונות T1D13.

לסיכום, שיטת ההפצה המבוססת CFSE היא רגישה ואיתנה. זה מהיר וטכנית פשוט יכול להתבצע באמצעות PBMC טריים או cryopreserved. היכולת לשלב cfse לתוך ניתוח facs מרובת צבעים מספק מידה כמותית של החיסונית של מתרבים תאים T מ-pbmc המכיל סוגי תאים רבים, ומידה זו של פירוט אינו אפשרי עם בחני ניצול ה-DNA התאגדות כגון [3 ה]-thymidine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי: הקרן לחקר סוכרת נעורים [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (ש. מ.). המועצה הלאומית לחקר הבריאות והרפואה (NHMRC GNT123586) (ש. מ.), סוכרת המילניום של אוסטרליה מחקר ביחסי אמון (Y17M1-מאן), תוכנית תמיכה בתשתיות תפעוליות של הממשלה הויקטוריאנית (ש. מ., א. ד., א. ט.), ו-NHMRC מלגת לתארים מתקדמים APP1094337 ו-JDRF PhD מלגה למעלה (M. S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
  3. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
  4. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 4-7 (2010).
  6. Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
  7. Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
  8. Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
  9. Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
  10. Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
  11. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  12. Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
  13. So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
  14. Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. 2-7 (2011).
  15. Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4<sup>+</sup> T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).More

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter