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Immunology and Infection

Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

doi: 10.3791/59545 Published: June 4, 2019

Summary

É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4+ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.

Abstract

Descrito é um método simples, in vitro, baseado na diluição da tintura para medir a proliferação antígeno-específica da pilha de T CD4+ em pilhas mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). O desenvolvimento de tinturas estáveis, não-tóxicas, fluorescentes tais como o éster do grufo do usando (CFSE) permite que as pilhas de T raras, antígeno-específicas sejam distinguidas dos transeunte pela diminuição na mancha fluorescente, como detectado pelo fluxo cytometry. Este método tem as seguintes vantagens sobre abordagens alternativas: (i) é muito sensível a células T de baixa frequência, (II) nenhum conhecimento do antígeno ou epítopo é necessária, (III) o fenótipo das células que respondem pode ser analisado, e (IV) viável, respondendo células podem ser classificadas e usadas para análise posterior, como a clonagem de células T.

Introduction

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A capacidade de detectar e estudar células T antígeno-específicas é importante em estudos de imunidade mediada por células. No entanto, isso é particularmente desafiador para as respostas de células T CD4+ específicas do autoantígeno, que são muito fracas e difíceis de detectar. Um método comum usado para a deteção da proliferação antígeno-específica do linfócito é [3H]-thymidine, que é um nucleotide radiolabeled incorporado no ADN de pilhas proliferating. Embora o ensaio de [3h]-thymidine possa detectar a síntese do ADN, este método é uma medida indireta da divisão da pilha, porque a síntese do ADN pode iniciar independentemente da mitose (isto é, durante a duplicação do gene e o apoptose1). Esta edição é agravada pelo fato de que a proliferação antígeno-específica das pilhas pode conduzir ao apoptose considerável2, conduzindo ao overestimato potencial da proliferação antígeno-específica. Além disso, o método de [3H]-timidina não fornece informações fenotípicas para linfócitos proliferantes, como a proliferação de linhagem CD4+ ou CD8+ em PBMCs estimulados com peptídeos antigênicos.

Em 2003, publicamos o primeiro ensaio de diluição de corante utilizando o CFSE, denominado ensaio de proliferação baseado em CFSE3,4. O CFSE é um corante fluorescente que se liga de forma estável a proteínas intracelulares, formando uma ligação covalente aos resíduos de lisina intracelular. Desde que as proteínas CFSE-etiquetadas são divididas ingualmente entre as pilhas3da filha, as pilhas que dividiram podem ser distinguidas das pilhas undivididas pelo fluxo cytometry, que igualmente permite o fenotipagem quantitativo de populações do linfócito. Na verdade, o número de divisões que uma célula sofreu a partir do momento da coloração CFSE pode ser medido em algum grau5. Mais recentemente, muitas tinturas similares tais como a tintura violeta da proliferação de CellTrace (VPD) e a tintura de CytoTrack foram desenvolvidas, que trabalham em uma maneira similar6. Este protocolo centra-se no CFSE, mas os princípios aplicam-se ingualmente a outros corantes relacionados.

A coloração do tetrâmero de peptide-MHC é um método amplamente utilizado para detectar e clonar pilhas CD8+ T antígeno-específicas. Este é um método bem estabelecido7,8,9,10; Entretanto, a clonagem tetrâmero-baseada exige o conhecimento existente da limitação de epítopo mapeado/MHC e cada epítopo exige seu próprio tetrâmero11, que limita o espaço da descoberta e da clonagem de pilhas de T epítopo mapeado-específicas novas. A proliferação baseada em CFSE pode ser usada com peptídeos, proteínas ou lisados celulares. O protocolo aqui descrito é simples e robusto, e as células T CD4+ de resposta podem ser classificadas para uso em ensaios de caracterização funcional e bioquímica a jusante12,13.

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Protocol

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Todos os sujeitos deram consentimento informado antes da coleta de sangue periférico. A aprovação ética para experimentos usando PBMC foi dada por St. Vincent ' s hosptial (HREC-A 135/08, e HREC-A 161/15).

1. preparação do reagente

  1. Meios humanos da pilha de T
    1. Prepare a mídia RP-5 para cultivar PBMC, que consiste em RPMI 1640, 1x aminoácidos não essenciais, dipeptídeo L-alanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (0,1 mg/mL) e 5% de soro humano agrupado (PHS).
  2. Soluções de ações CFSE
    1. Prepare um estoque mestre dissolvendo 25 mgs de CFSE em ~ 9 mL de DMSO para conseguir uma solução de estoque final com uma concentração de 5 mM.
    2. Prepare um estoque de trabalho diluindo o estoque mestre em PBS para alcançar uma concentração de trabalho de 10 μM.

2. preparação de PBMCs humanos de sangue total

  1. Existem geralmente entre 0,5 – 1,5 x 106 PBMCs/ml de sangue periférico humano. Portanto, a quantidade de sangue necessária depende do número desejado de PBMCs. diluir o sangue periférico humano com PBS, pelo menos, 1:2. Separe os PBMCs adicionando 15 mL de meio de gradiente de densidade a um tubo de 50 mL e, em seguida, sobreponha 35 mL de sangue total diluído.
  2. Centrifugador a 850 x g durante 15 min sem desaceleração à temperatura ambiente (RT). Isso resultará em três camadas claras: a camada inferior que contém o pellet de células vermelhas do sangue, camada média de meio de gradiente de densidade com células brancas do sangue que revestem sua interface superior e camada de plasma superior14.
  3. Remova aproximadamente 20 mL da camada de plasma superior. Colete a camada de glóbulos brancos, sendo cuidadoso para evitar o pellet de glóbulos vermelhos. Lave 3x com PBS e contagem de células viáveis usando Tripan exclusão azul em um Hemocytometer. Diluir para 1 x 106 PBMCs/ml em PBS.
  4. Células não-CFSE-manchadas
    1. Essas células são usadas como controles de compensação para citometria de fluxo, compreendendo células não manchadas e CD4+ de coloração única. Adicionar 300 μL de cada amostra de controlo PBMC suspensão a um tubo de 10 mL, superior com PBS, e centrifugar a 550 x g durante 5 min em RT.
    2. Ressuscite 1 x 106 células/ml na mídia RP-5. Incubar estas pilhas sem rótulo por 7 dias em uma incubadora de 37 ° c/5% co2 com as pilhas CFSE-etiquetadas (etapa 2.6.1).
  5. Células coradas por CFSE
    1. Transfira as células da etapa 2,3 para um tubo de 50 mL. Adicionar 1,0 μL de solução de trabalho CFSE (10 μM) por 1 mL de suspensão celular ao lado do tubo. Misture rapidamente invertendo o tubo várias vezes. A concentração final de CFSE é de 10 nM.
    2. Incubar por 5 min em uma incubadora de 37 ° c/5% CO2 . Para parar a coloração, adicionar 5 mL de RP-5 mídia, pellet as células por centrifugação por 5 min em 550 x g. Ressuscite o PBMCs em 1 x 106/ml na mídia RP-5.
    3. Adicionar 1,0 mL de suspensão celular a um tubo de 10 mL. Use um tubo para cada antígeno a ser testado.
  6. Estimulação antigênica de PBMCs humanos e cultura celular
    1. Cultura de CFSE humano-rotulado PBMCs com antígenos em RP-5 mídia por 7 dias em um 37 ° c/5% CO2 incubadora. Cultura 1 x 105 células/poço (100 μL) em uma placa de poço 96 com 100 μl/poço de meios RP-5 contendo antígeno diluído.
      Nota: os antígenos utilizados, incluindo as concentrações de trabalho, estão resumidos na tabela 1.

3. anti-CD4 coloração para FACS análise

  1. Pipetam 200 μL das células cultivadas em tubos FACS, células de lavagem 1X em 1,0 mL de PBS contendo 0,1% de FCS e centrifugador por 5 min a 550 x g.
  2. Mancha com anti-humano CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) em 100 μL de PBS/0,1% FCS. Mantenha de lado uma amostra de células rotuladas por CFSE, não manchada com outros fluoróforos, para usar para definir a compensação de CFSE FACS. Incubar as células a 4 ° c protegidas da luz durante 20 min.
  3. Lave as células adicionando 1 mL de PBS/0,1% FCS, centrifugue a 550 x g durante 5 min em RT e ressuscitem em 100 ΜL de PBS/0,1% FCS. Imediatamente antes da análise de FACS, adicione 1 μL do iodeto do propidium (PI, 0,1 mg/mL) a todos os tubos para permitir que as pilhas inoperantes sejam excluídas pelo fluxo cytometry.

4. configuração Citométrica de fluxo e estratégia de gating

Nota: A Figura 1 mostra a configuração do FACS, incluindo controles de remuneração e estratégia de gating.

  1. Porta o scatter dianteiro (FSC) vs. dispersão lateral (SSC) (Figura 1a) população para incluir todos os linfócitos.
  2. Porta a população de FSC vs. PI (Figura 1b) em células PI negativas para excluir células apoptóticas.
  3. Use células não manchadas para definir uma linha de base de tensão para células não-fluorescentes. Ajuste as tensões para CD4-A647 e CFSE de modo que o sinal da fluorescência esteja abaixo de 1.000 para cada um (Figura 1C). Use os controles de cor única CFSE (Figura 1D) e CD4-A647 (Figura 1e) para confirmar sinais fluorescentes positivos (~ 10.000) para cada cor, usando as tensões ajustadas com células não manchadas.
  4. CFSE e PI têm alguma sobreposição espectral; ajuste a compensação para subtrair a fluoresence do PI da fluoresence de CFSE até que a amostra do CFSE-somente não rende um sinal no canal PI.
    Nota: Estas comportas foram aplicadas a todas as amostras analisadas neste documento.

5. cálculo do índice de divisão celular para enumerar a proliferação de células T CD4+ específica do antígeno

Nota: O índice de divisão celular (CDI) refere-se ao número de células divididas (CD4+/CFSEdim) por 5.000 células não divididas (CD4+/CFSEBright). Quando o número de células CD4+ não divididas não é exatamente 5.000, o número de células divididas é corrigido para expressar o número de células divididas por 5.000 células não divididas. Por exemplo, usando a proliferação específica do toxóide tetânico (Figura 2D), havia 4.930 células não divididas (CFSEbright) e 3.268 células divididas (CFSEDim); Portanto, o número corrigido de células divididas é (5000/4930) x 3.268 = 3304,3.

  1. Calcule o CDI (tabela 1) dividindo o número de células divididas/5000 células não divididas do grupo estimulado pelo antígeno pelo número médio de células divididas (por 5.000 células não divididas) das células cultivadas sem antígeno (tabela 2).

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Representative Results

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Estimulação in vitro de PBMCs humanos com proteína toxóide do tétano: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de toxóide tetânico. Quase todos os doadores mostraram uma resposta forte da pilha de T ao toxóide do tétano porque tinham sido vacinados, que faz o toxóide do tétano um antígeno positivo útil do controle. A Figura 2 demonstra, em triplicado, que a proliferação CFSE de células T CD4+ de PBMCs não estimulados foi mínima (~ 12 células do CFSEDim ; Figura 2a , B, C), quando havia uma proliferação marcada de pilhas de T de CD4+ em resposta ao toxóide do tétano (> 3000 pilhas deDim de CFSE; Figura 2D , E, F).

Estimulação in vitro de PBMCs humanos com peptídeos antigênicos: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de proinsulina C-peptídeo humano. A Figura 3 demonstra a detecção de células T CD4+ específicas de proinsulina C-peptídeo no sangue periférico de um indivíduo com diabetes tipo 1. A proliferação não foi observada no PBMC do doador saudável (dados não mostrados). Na Figura 4, os PBMCs estimulados com A proteína da matriz do vírus influenza A (H1N1 PR8) demonstraram proliferação; Entretanto, a resposta tétano-específica para este doador era relativamente fraca, e as respostas são geralmente variáveis entre doadores.

Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o ensaio pode ser realizado utilizando proteínas de comprimento total e peptídeos sintéticos curtos.

Figure 1
Figura 1: controles de remuneração e estratégia de gating para a proliferação baseada em CFSE de células T CD4+ . PBMCs não estimulados após 7 dias de cultura celular in vitro. Os linfócitos (A) foram corados com iodeto do propidium, e as pilhas iodeto-negativas do propidium foram bloqueadas para excluir pilhas inoperantes (B). Os controles da compensação de FACS incluíram pilhas não manchadas (C), pilhas manchadas com o CFSE sozinho (D), e as pilhas manchadas com o CD4 sozinho (e). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: proliferação de células T CD4+ específicas do tétano, coradas por CFSE. Os PBMCs foram corados por CFSE e cultivados por 7 dias na presença de 145 ng/ml (166 LfU/ml) de toxóide tetânico. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada sem antígeno (a-C) e em resposta à proteína do toxóide do tétano (D-F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: proliferação de células T CD4+ humanas coradas por CFSE em resposta a proinsulina C-peptídeo. Os PBMCs corados por CFSE foram cultivados por 7 dias na presença de 10 μm de proinsulina C-peptídeo. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada usando PBMC de um doador com diabetes tipo 1. A diluição do CFSE em PBMCs não estimulados (A), proteína toxóide tetânica estimulada (B) e proinsulina c-peptídeo humano estimulou PBMCs (c). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: proliferação de células T CD4 + humanas coradas por CFSE em resposta à proteína de matriz 1 do vírus influenza a (H1N1 PR8). Os PBMCs foram corados por CFSE e cultivados por 7 dias na presença de 0, 8 μg/mL de proteína de matriz de vírus influenza A 1. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada para células não estimuladas (A), células estimuladas por toxóides do tétano (B) e células de proteínas de matriz de vírus influenza A (C).      Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Antígeno Concentração de trabalho
Proteína toxóide tetânica 145 ng/mL
Influenza A H1N1 (PR8) matriz de proteínas 1 0,08 – 10 μg/mL
Proinsulina C-peptídeo PI33-63 10 nanômetro

Tabela 1: enumeração da proliferação CD4+ específica do tétano. Os cálculos do CDI usando 5.000 registraram eventos citométricos de fluxo de PBMC humano não estimulados e Tetanus-estimulados.

Amostra Células não divididas CD4+CFSEBright Células divididas CD4+CFSEDim Número de células divididas CFSEDim/5.000 CFSEbrilhante Média de células divididas CFSEDim/5.000 CFSEbrilhante
Nil 1 5.004 11 11 12,3
Nil 2 4.995 14 14
Nil 3 5.006 12 12
Amostra Células não divididas CD4+CFSEBright Células divididas CD4+CFSEDim Número de células divididas CFSEDim/5000 CFSEbrilhante CDI número de células divididas (tétano) médias células divididas (Nil) CDI médio
Tétano 1 4.930 3.258 3304,3 268 263,7
Tétano 2 4.928 3.205 3251,8 263,7
Tétano 3 4.910 3.142 3199,6 259,5

Tabela 2: antígenos utilizados para simular a proliferação de CD4+ .

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Discussion

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A proliferação CFSE-baseada é um método simples e robusto para detectar e enumerar pilhas humanas antígeno-específicas de CD4+ T. Tem sido demonstrado previamente que a utilização da concentração óptima de CFSE é essencial para resultados óptimos4. Demasiada proliferação dos AB roga de CFSE, visto que demasiado pouco não permite que as pilhas divididas e undivide sejam distinguidas. Por outro lado, concentrações relativamente elevadas (5,0 μM) de CFSE são usadas para rotular células T murinas purificadas3. Devido à variabilidade entre lotes, recomenda-se que cada lote seja titulado para determinar a concentração óptima. Nós usamos nosso lote atual em uma concentração muito mais baixa (10 nanômetro) do que na publicação original (200 nanômetro)4.

Outro aspecto importante deste método é a otimização da dose de antígeno. Tem sido bem estabelecido que as células T cultivadas com menos antígeno pode ser mais sensível e exibem função reforçada. Isso foi originalmente demonstrado no contexto dos peptídeos do HIV15. A quantidade de toxóide do tétano usada neste protocolo foi aperfeiçoada igualmente previamente4 para eliciar pilhas altamente sensíveis e proliferative de T CD4+ . Curiosamente, tem sido demonstrado anteriormente que o excesso de antígeno reduz a proliferação antígeno-específica15. Conseqüentemente, para detectar e enumerar populações raras da pilha de T no sangue periférico, otimizando a concentração do antígeno e do CFSE é da importância máxima.

Desde que nós publicamos o primeiro ensaio diluição-baseado humano da tintura4, muitas tinturas similares foram desenvolvidas. Nós encontramos que a proliferação da pilha de CD4+ T foi detectada menos eficazmente quando PKH-26, um corante lipofílico, foi usado comparado ao CFSE (Unpublished). Nós não testamos sistematicamente outros corantes no mercado, então não há nenhum comentário sobre suas forças relativas. No entanto, o protocolo para quantificar a proliferação de células T é igualmente aplicável a todos os ensaios de proliferação de diluição de corante.

Expressar a proliferação como índice de divisão celular (CDI) incorpora a proliferação de fundo no cálculo da magnitude das respostas. Em nossas mãos, o fundo é geralmente baixo (por exemplo, < 15 eventos/5000 CD4+ CFSEBright). A proliferação de antecedentes varia entre indivíduos e experimentos. Usar uma relação (neste caso, o CDI) para expressar a força da proliferação é um tanto eficaz em reduzir seu impacto nos resultados. As respostas de fundo às proteínas na mídia podem ser problemáticas. Recomenda-se o uso de meios de cultura de tecidos que contenham soro humano, não soro bovino, como proteínas bovina podem estimular uma fraca resposta de fundo que diminui a sensibilidade do ensaio. Uma proliferação elevada do fundo foi encontrada nas pessoas que têm uma infecção suave, presumivelmente devido à proliferação que é aprontado in vivo em resposta à infecção. Em tais casos, o ensaio deve ser repetido uma vez que o doador limpou a infecção.

O ensaio de proliferação baseado em CFSE pode ser modificado para clonar eficientemente células T CD4+ específicas do antígeno humano diretamente do PBMCs12. Por exemplo, essa abordagem foi usada para clonar células T CD4+ específicas para insulina12. Mais recentemente, a clonagem e as análises funcionais de células T CD4+ específicas de proinsulina C-peptídeo forneceram uma visão notável da patogênese da T1D, particularmente em pacientes com início recente T1D13.

Em conclusão, o ensaio de proliferação baseado em CFSE é sensível e robusto. É rápido e tecnicamente simples e pode ser realizado usando PBMC fresco ou criopreservado. A habilidade de incorporar o CFSE na análise multicolor de FACS fornece uma medida quantitativa do immunophenotype de proliferating pilhas de T de PBMC que contem muitos tipos da pilha, e este grau de detalhe não é possível com os ensaios que utilizam a incorporação do ADN como [3H]-thymidine.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por: o juvenil diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). O Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Austrália Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), programa de apoio à infra-estrutura operacional do governo vitoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.), e NHMRC Bolsista de pós-graduação APP1094337 e JDRF PhD top-up Scholarship (M. S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

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References

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Cite this Article

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).More

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

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