Summary
हम बरकरार माउस कंकाल की मांसपेशियों का उपयोग कर छोटे कोण एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मानव रोगों के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की व्यापक उपलब्धता के साथ, इस प्रयोगात्मक मंच आनुवंशिक मांसपेशियों की बीमारियों के संरचनात्मक आधार स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी परीक्षण बिस्तर फार्म कर सकते हैं
Abstract
ट्रांसजेनिक माउस मॉडल कंकाल की मांसपेशी के उन सहित मानव रोगों के लिए phenotype करने के लिए जीनोटाइप के रिश्ते का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण किया गया है. माउस कंकाल की मांसपेशी तीसरी पीढ़ी synchron बीमलाइनों पर उच्च गुणवत्ता वाले एक्स-रे विवर्तन पैटर्न का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है स्वास्थ्य और रोग में कार्यात्मक phenotypes के लिए जीनोटाइप के स्तर पर परिवर्तन जोड़ने के लिए एक अवसर प्रदान करने का निर्धारण करके आनुवंशिक परिवर्तन के संरचनात्मक परिणाम. हम नमूनों की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, एक्स-रे पैटर्न इकट्ठा करते हैं और एक्स-रे पैटर्न से प्रासंगिक संरचनात्मक पैरामीटर निकालते हैं जो स्वयं के लिए ऐसे प्रयोगों को करने के इच्छुक गाइड प्रयोगकर्ताओं की मदद कर सकते हैं।
Introduction
सिंक्रोट्रॉन छोटे कोण एक्स-रे विवर्तन शारीरिक स्थितियों के तहत सक्रिय रूप से मांसपेशियों की तैयारी करार के एनएम पैमाने पर संरचना का अध्ययन करने के लिए पसंद की विधि है। महत्वपूर्ण बात, रहने या चमड़ी मांसपेशियों की तैयारी से संरचनात्मक जानकारी शारीरिक डेटा के साथ तुल्यकालन में प्राप्त किया जा सकता है, इस तरह के मांसपेशियों की ताकत और लंबाई में परिवर्तन के रूप में. विरासत में मिली मांसपेशियों की बीमारियों के संरचनात्मक आधार का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक को लागू करने में रुचि बढ़ रही है जो सार्कोरिक प्रोटीन में बिंदु उत्परिवर्तनों में उनके आधार हैं। मांसपेशी biophysics समुदाय संरचनात्मक अध्ययन के लिए आदर्श परीक्षण बेड प्रदान कर सकता है कि इन मानव रोग की स्थिति के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पैदा करने में बहुत सक्रिय किया गया है. हमारे समूह1,2,3 और अन्य4,5 से हाल के प्रकाशनों ने संकेत दिया है कि माउस एक्स-रे पैटर्न से एक्स-रे पैटर्न (EDL) और तलवंसी मांसपेशियों सभी प्रदान कर सकते हैं विवर्तन की जानकारी मेंढक और खरगोश psoas कंकाल की मांसपेशी के रूप में अधिक पारंपरिक मॉडल जीवों से उपलब्ध है. माउस कंकाल की मांसपेशियों की तैयारी का एक लाभ विच्छेदन की आसानी और बुनियादी झिल्ली-intact प्रदर्शन, पूरे मांसपेशी शारीरिक प्रयोगों है. विच्छेदन पेशी के आयाम ों की मात्रा बहुत कम एक्स-रे जोखिम समय में अत्यधिक विस्तृत मांसपेशी पैटर्न उपज करने के लिए पर्याप्त द्रव्यमान है ($millisecond प्रति फ्रेम) तीसरी पीढ़ी के एक्स-रे बीमलाइनपरपर.
मांसपेशी एक्स-रे विवर्तन पैटर्न विषुवतीय परावर्तन, मेड्रिलीय परावर्तन के साथ-साथ परत रेखा परावर्तन से मिलकर बनता है। विषुवतीय तीव्रता अनुपात (1,1 और 1,0 विषुवतीय परावर्तन की तीव्रता का अनुपात, I11/I10),संलग्न क्रॉस-पुलों की संख्या से निकटता से संबंधित है, जो माउस कंकाल की मांसपेशी में उत्पन्न बल के लिए आनुपातिक है 2. मोटे और पतले तंतुओं के भीतर आवर्तियों की रिपोर्ट करने वाले मेरिडियल परावर्तन का उपयोग तंतु एक्स्टेंसिबिलिटी1,3,6,7का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है . मध्यातुदार और भूमध्य रेखा पर नहीं डिफ्राक्शन सुविधाओं को परत लाइनें कहा जाता है, जो मोटे फिलामेंट रीढ़ की सतह पर लगभग helically आदेश दिया मायोसिन सिर से उत्पन्न होने के साथ ही लगभग helically आदेश दिया पतली फिलामेंट. मायोसिन परत रेखाओं की तीव्रता विभिन्न परिस्थितियों2,8के अधीन मायोसिन शीर्षों के आदेश की डिग्री से निकटता से संबंधित है . इस जानकारी के सभी स्वास्थ्य और रोग में situ में सार्किक प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन किया जा सकता है.
मांसपेशियों का सिन्क्रोट्रॉन एक्स-रे विवर्तन ऐतिहासिक रूप से अत्यधिक विशिष्ट विशेषज्ञों की टीमों द्वारा किया गया है लेकिन प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति और नए डेटा न्यूनीकरण उपकरणों की उपलब्धता से संकेत मिलता है कि यह हमेशा मामला नहीं होना चाहिए। उन्नत फोटॉन स्रोत पर BioCAT Beamline 18ID, Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला मांसपेशियों का एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों है कि क्षेत्र के लिए नए लोगों की मदद कर सकते हैं प्रदर्शन के लिए कर्मचारियों और समर्थन सुविधाओं को समर्पित किया है इन तकनीकों का उपयोग कर में शुरू हो जाओ. कई उपयोगकर्ताओं को औपचारिक रूप से BioCAT कर्मचारियों के साथ सहयोग करने के लिए चुनते हैं, लेकिन उपयोगकर्ताओं की बढ़ती संख्या वे प्रयोगों कर सकते हैं और विश्लेषण खुद बीमलाइन कर्मचारियों पर बोझ को कम करने लगता है. इस कागज के प्राथमिक लक्ष्य के लिए प्रशिक्षण है कि वे योजना और माउस कंकाल मांसपेशी प्रणाली पर या तो BioCAT बीमलाइन पर या अन्य उच्च प्रवाह beamlines के आसपास पर प्रयोगों को निष्पादित करने की जरूरत के साथ संभावित प्रयोगकर्ताओं प्रदान करता है प्रदान करना है दुनिया जहां इन प्रयोगों संभव हो जाएगा.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों प्रोटोकॉल प्रौद्योगिकी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के इलिनोइस संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया (प्रोटोकॉल 2015-001, अनुमोदन की तारीख: 3 नवंबर 2015) और NIH "की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड"9 .
1. पूर्व प्रयोग तैयारी
- रिंगर के समाधान के 500 एमएल तैयार करें (जिसमें 145 एमएम नैक्ल, 2.5 एमएम केसीएल, 1.0 एमएम एमजीएसओ4, 1.0 एमएम केसीएल2, 10.0 एमएम हैप्स, 11 एमएम ग्लूकोज, पीएच 7.4) नए सिरे से प्रयोग के प्रत्येक दिन के लिए तैयार करें।
- एक स्प्रे बोतल में रिंगर समाधान के 200 एमएल भरें और 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर। रिंगर के समाधान के साथ एक पेट्री डिश (10 सेमी व्यास) भरें और ट्यूब को एक मछलीघर वायु पत्थर से एक ऑक्सीजन सिलेंडर से जोड़कर 100% ऑक्सीजन के साथ perfuse। पेट्री व्यंजन ("अलग व्यंजन") पहले विच्छेदन के दौरान पिन डालने की अनुमति देने के लिए एक elastomer परिसर के साथ लेपित थे.
- धातु बढ़ते हुक तैयार करें। स्टेनलेस स्टील के तार के दो टुकड़े, व्यास में 0.5 मिमी, उचित लंबाई के लिए और हुक बनाने के लिए दोनों सिरों पर तार मोड़। उपयोग के लिए काम करने वाले सभी विच्छेदन उपकरण, कैंची, सीवन बांधने के संदंश, माइक्रो-सिसर्स को व्यवस्थित करें।
नोट: हुक हिस्सा के बारे में होना चाहिए 3 मिमी लंबा. अब तार (एक हुक में समाप्त) के बारे में होना चाहिए 5 सेमी लंबा, और छोटे तार (भी एक हुक में समाप्त) के बारे में होना चाहिए 1 सेमी लंबे समय के लिए BioCAT में इस्तेमाल कस्टम कक्षों फिट और ट्रांसड्यूसर हाथ के लिए गति की एक पर्याप्त रेंज के लिए अनुमति देते हैं. -
कनेक्ट करें और सभी उपकरणों को चालू करें। इसमें एक संयुक्त मोटर/बल ट्रांसड्यूसर, मोटर/बल ट्रांसड्यूसर नियंत्रक एक उच्च शक्ति द्वि-फासी वर्तमान उद्दीपक, और एक कंप्यूटर नियंत्रित डेटा अधिग्रहण/नियंत्रण प्रणाली शामिल है।
- डेटा अधिग्रहण प्रणाली को चालू करें और प्रयोग शुरू करने से पहले इसे जांचना10. संक्षेप में, ज्ञात वजन का एक सेट जोड़कर बल कैलिब्रेट िंग, एक रैखिक प्रगति में बल ट्रांसड्यूसर द्वारा मापा अधिकतम बल के 50% तक को कवर, बल ट्रांसड्यूसर पर और आउटपुट वोल्टेज परिवर्तन रिकॉर्डिंग. लीवर हाथ करने के लिए ज्ञात उत्पादन वोल्टेज का एक सेट लागू करने और हाथ की लंबाई परिवर्तन को मापने के द्वारा लंबाई कैलिब्रेट।
- नमूना धारक पर थर्मल ब्लॉक से hoses एक रेफ्रिजरेटेड घूम स्नान करने के लिए कनेक्ट और तापमान सेट करने के लिए कक्ष में वांछित तापमान 10 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखने के लिए। तापमान की एक श्रृंखला के लिए घूम स्नान की स्थापना और एक thermocouple के साथ कक्ष में तापमान को मापने के द्वारा समय से आगे इस अनुभवजन्य निर्धारित.
2. मांसपेशियों की तैयारी
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माउस को यूथेनाइज़ करना
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा माउस Euthanize.
- बाल को तैयार करने में बहने से रोकने के लिए ठंडे रिंगर के समाधान के साथ पिछले अंग पर त्वचा का छिड़काव करें। ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग कर जांघ के आसपास इसे दूर काटने से त्वचा निकालें और जल्दी से मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए #5 संदंश का उपयोग कर नीचे त्वचा खींच.
- पिछले अंग Amputate और यह एक विच्छेदन पकवान है कि oxygenized रिंगर के समाधान से भर दिया गया है करने के लिए स्थानांतरण, और फिर एक दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जगह है.
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एक तलवंसी पेशी की तैयारी
- ऊपर की ओर का सामना करना पड़ gastrocnemius मांसपेशियों के साथ विच्छेदन पकवान में पिछले अंग नीचे पिन. गैस्ट्रोकेनियस/सोलस मांसपेशी समूह के डिस्टल कण्डरा को काटें और मांसपेशियों को धीरे-धीरे और धीरे-धीरे ठीक कैंची का उपयोग करके गैस्ट्रोकेनमियस मांसपेशियों के दोनों ओर फासिया को काटने से उठाएं। एक प्रकार की मांसपेशी के समीपस्थ कण्डरा को मुक्त करने के बाद अंग से गैस्ट्रोकेनिमियस/सोलस मांसपेशी समूह को अलग करें।
- गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी और विच्छेदन डिश में डिस्टल कण्डरा युक्त मांसपेशी समूह को पिन करें। सोलस मांसपेशी को धीरे से निकटस्थ कण्डरा के माध्यम से उठाएं और इसे गैस्ट्रोकेनमियस मांसपेशियों से अलग करें जो संभव के रूप में एकमात्र जिला कण्डरा के रूप में ज्यादा बरकरार है।
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एक्स्टेंजर डिजिटोरियम लांगस (EDL) पेशी तैयार करना
- ऊपर की ओर का सामना करना पड़ tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के साथ विच्छेदन पकवान में पिछले अंग नीचे पिन. टिबियालिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों के साथ फासिया को काटें और संदंश का उपयोग करके इसे स्पष्ट करें। टीए मांसपेशियों के दूरस्थ कण्डरा को पहचानें और काटें। टीए मांसपेशियों लिफ्ट और EDL मांसपेशियों पर खींच के बिना ध्यान से इसे बाहर कटौती.
- कट घुटने के पार्श्व पक्ष को खोलने और दो tendons बेनकाब. समीपस्थ कण्डरा कट, संभव के रूप में अभी भी मांसपेशियों से जुड़ी के रूप में कण्डरा के ज्यादा छोड़ने, और धीरे कण्डरा खींच कर EDL मांसपेशी (मध्य मांसपेशी) उठा. एक बार यह उजागर हो जाने के बाद डिस्टल कण्डरा को काट दें।
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पेशी पर चढ़ना
- tendons के माध्यम से मांसपेशियों नीचे पिन, और सभी अतिरिक्त वसा ट्रिम, फासिया और कण्डरा दूर के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में. एक कण्डरा को पूर्व-बांधी गाँठ में डालें और सीवन को सीवन बांधने वाले संदंश के साथ कसकर बांधें। धातु हुक के चारों ओर पर दूसरी गाँठ टाई.
- कण्डरा के दूसरे छोर पर लंबे हुक के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. सुनिश्चित करें कि मांसपेशियों के शरीर में से कोई भी टांके द्वारा संपर्क किया जाता है। यह तैयारी को नुकसान पहुंचाएगा।
- प्रयोगात्मक कक्ष के नीचे करने के लिए छोटे हुक और दोहरी मोड बल ट्रांसड्यूसर / मोटर के लिए लंबे हुक संलग्न करें। 100% ऑक्सीजन के साथ प्रयोगात्मक कक्ष में समाधान बुलबुला.
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उत्तेजना प्रोटोकॉल और मांसपेशियों की लंबाई को अनुकूलित करना
- सबसे अच्छा उत्तेजना मापदंडों को खोजने से पहले 15 से 20 mN के बीच एक आधार भूतरेखा तनाव उत्पन्न करने के लिए ट्रांसड्यूसर/मोटर से जुड़ी micromanipulators समायोजित करके मांसपेशियों खिंचाव. 40 ट के लिए उत्तेजना वोल्टेज सेट करें। उत्तेजना धारा व्यवस्थित रूप से वृद्धि हुई है जब तक वहाँ twitch बल में कोई अतिरिक्त वृद्धि हुई है. पाया उच्चतम वर्तमान के बारे में 50% की वृद्धि हुई है करने के लिए अधिअधिकतम सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए.
- इष्टतम लंबाई का पता लगाएं, एल0, मांसपेशियों की लंबाई है कि अधिकतम twitch बल देने के रूप में परिभाषित, मांसपेशियों की लंबाई बढ़ाने और सक्रिय बल (पीक बल ऋण आधाररेखा बल) तक एक एकल हिल के साथ मांसपेशियों को सक्रिय करने से बढ़ बंद हो जाता है.
- बढ़ते का परीक्षण करने और यदि आवश्यक हो तो इष्टतम आधार रेखा बल के लिए वापस मांसपेशियों खिंचाव करने के लिए एक छोटी टेटेनिक संकुचन (1 s सक्रियण) प्रदर्शन. एक डिजिटल कैलिपर के साथ मिमी में मांसपेशियों की लंबाई रिकॉर्ड.
3. एक्स-रे डिफ्रक्शन
नोट: उन्नत फोटॉन स्रोत, आर्गन नेशनल लेबोरेटरी में बायोकैट बीमलाइन 18ID पर छोटे कोण एक्स-रे विवर्तन यंत्र का उपयोग करके किए गए एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए निम्नलिखित वर्णन है, लेकिन इसी तरह के तरीकों को अन्य बीमलाइन्स पर नियोजित किया जा सकता है इस तरह के रूप में ID 02 ESRF (फ्रांस) और BL40XU पर SPring8 (जापान) में. बीमलाइन 18ID का प्रचालन 12 केवी (0ण्1033 दउ तरंगदैर्ध्य) की एक नियत एक्स-किरण किरण ऊर्जा पर किया जाता है जिसमें पूर्ण किरण में प्रति सेकंड 10 13 फोटॉनों का एक घटना फ्रलक्स होता है।
- डिटेक्टर दूरी (कैमरा लंबाई) के लिए एक नमूना चुनें. 2.7 एनएम actin और उच्च क्रम मायोसिन प्रतिबिंब जैसे 2.8 एनएम meridional प्रतिबिंब की जांच प्रयोगों के लिए एक 1.8 मीटर कैमरा लंबाई का प्रयोग करें. अन्य प्रयोगों के लिए 4-6 मीटर कैमरा का उपयोग करें, जहां एक मुख्य रूप से मध्याह्न और परत लाइनों पर ठीक विस्तार में रुचि रखता है
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बीम में नमूने की स्थिति का अनुकूलन
- एक्स-रे संवेदनशील कागज के एक टुकड़े का उपयोग करके बीम की स्थिति निर्धारित करें जो एक्स-रे ("एक जला") के जवाब में एक अंधेरे स्थान का उत्पादन करता है। फिर एक वीडियो पार बाल जनरेटर का उपयोग करने के लिए एक पार बाल कागज पर जला निशान के साथ गठबंधन या बस एक मार्कर कलम के साथ वीडियो स्क्रीन पर एक निशान बनाने के लिए.
- बीम स्थिति पर केंद्रित किया जा करने के लिए मांसपेशियों को स्थानांतरित करने के लिए नमूना स्थितिकर्ता के लिए ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस की आपूर्ति BioCAT का प्रयोग करें. जोखिम के दौरान मांसपेशियों पर एक्स-रे खुराक फैलाने के लिए नमूना चरण को ले जाकर नमूना कक्ष को $10-20 मिमी/एस पर दोलायमान करें। नमूने का निरीक्षण के रूप में यह फासिया के बड़े क्षेत्रों से बचने के लिए ले जाता है (कोलेजन जो विवर्तन पैटर्न को प्रदूषित करेगा शामिल है) और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह अपनी यात्रा के पूरे रास्ते के दौरान प्रबुद्ध रहता है.
नोट: बीमलाइन की आपूर्ति की ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का उपयोग कर आवश्यक सेटिंग्स और कार्यों बनाने के लिए वर्गों 3.3 और 3.4 में आवश्यक सटीक कदम बीमलाइन और डिटेक्टर विशिष्ट हो जाएगा। बीमलाइन स्टाफ से पूछिए कि इन कार्यों को कैसे करें।
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परिभाषित स्थिर स्थितियों में मांसपेशियों से उच्च संकल्प पैटर्न के लिए सीसीडी (चार्ज युग्मित डिवाइस) डिटेक्टर की स्थापना (आराम, या आइसोमेट्रिक संकुचन के दौरान)
- नियंत्रण सॉफ्टवेयर के लिए चित्रमय यूजर इंटरफेस में जोखिम समय और जोखिम अवधि सेट करें। जोखिम लेने से पहले एक अंधेरे पृष्ठभूमि छवि ले लो और इस प्रक्रिया को दोहराने हर 2 घंटे या जोखिम समय के बदलने के बाद डिटेक्टर readout इलेक्ट्रॉनिक्स में किसी भी बहाव को सही करने के लिए.
- एक्स-रे बीम को जोखिम के लिए वांछित मूल्य तक कम करें। तो फिर एक छवि ले लो. यह इस डिटेक्टर के साथ छवियों के दृश्यों लेने के लिए संभव नहीं है. सीसीडी डिटेक्टर भी एक व्यक्ति की छवि को पढ़ने के लिए कई सेकंड की जरूरत है.
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किसी समय हल किए गए प्रयोग के लिए पिक्सेल सरणी डिटेक्टर सेट करना
- चित्रमय यूजर इंटरफेस में छवियों, जोखिम समय, जोखिम अवधि की संख्या निर्धारित करें। यहाँ इस्तेमाल पिक्सेल सरणी डिटेक्टर readout करने के लिए कम से कम 1 एमएस की जरूरत है. फोटॉन काउंटिंग डिटेक्टर के लिए अधिकतम फ्रेम आवृत्ति 500 हर्ट्ज है। एक्स-रे शटर को नियंत्रित करने के लिए फोटॉन गिनती डिटेक्टर आउटपुट सिग्नल का उपयोग करें।
- बीम को वांछित तीव्रता तक कम करें। डिटेक्टर शाखा और डेटा अधिग्रहण प्रणाली से ट्रिगर के लिए प्रतीक्षा करें. यांत्रिक और एक्स-रे डेटा उन्हें एक ही समय में ट्रिगर करके सिंक्रनाइज़ करें। एक्स-रे पैटर्न प्रोटोकॉल भर में लगातार एकत्र कर रहे हैं एक के साथ एक 1 एमएस जोखिम समय और एक 2 एमएस जोखिम अवधि.
नोट: सटीक जोखिम समय और जोखिम अवधि वांछित जानकारी और बीम में नमूने के मनाया जीवनकाल के लिए मामले के आधार पर एक मामले पर निर्धारित किया जाना चाहिए. चुना जोखिम अवधि में analyzable डेटा प्रदान करने के लिए आवश्यक की तुलना में कोई और अधिक एक्स-रे बीम का उपयोग करने के लिए बीम attenuate।
4. पोस्ट-प्रयोग स्नायु उपचार
- प्रत्येक यांत्रिक और एक्स-रे प्रयोग के बाद मांसपेशियों को पुनर्प्राप्त करें और तौलें। मापा मांसपेशियों की लंबाई और मांसपेशियों का उपयोग कर मांसपेशियों के पार अनुभागीय क्षेत्र की गणना11 1.06 g/mL12की एक मांसपेशी घनत्व संभालने.
- पेशी को प्रायोगिक लंबाई तक फैलाएं और 10 मिनट के लिए 10% फॉर्मेलिन में मांसपेशियों को ठीक करें। निश्चित मांसपेशी को संपूर्ण मांसपेशी क्रॉस सेक्शन3में स्थानों से चयनित फाइबर बंडलों की एक श्रृंखला में अलग करें।
- एक वीडियो sarcomere लंबाई मापने प्रणाली का उपयोग कर sarcomere लंबाई उपाय.
Representative Results
आइसोमेट्रिक टेटेनिक संकुचन. क्लासिक मांसपेशी यांत्रिक प्रयोग के किसी भी प्रकार, इस तरह के आइसोमेट्रिक या आइसोटोनिक संकुचन के रूप में, एक्स-रे पैटर्न के एक साथ अधिग्रहण के साथ किया जा सकता है। चित्र 1 एक यांत्रिक और एक्स-रे प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक सेटअप से पता चलता है। किसी समदूरीक टेटेनिक संकुचन के लिए एक उदाहरण बल ट्रेस चित्र 1खमें दर्शाया गया है। मांसपेशियों के लिए आराम में आयोजित किया गया था 0.5 s से पहले सक्रिय 1 s. यांत्रिक रिकॉर्डिंग उत्तेजना के बाद 1 s बंद हो जाता है. एक्स-रे पैटर्न लगातार प्रोटोकॉल भर में 500 हर्ट्ज पर 1 एमएस जोखिम समय पर एकत्र किए गए थे।
एक्स-रे विवर्तन पैटर्न। मांसपेशी एक्स-रे विवर्तन पैटर्न सार्कोमरे के अंदर संरचनाओं से नैनोमीटर संकल्प संरचनात्मक जानकारी दे सकता है। मांसपेशी एक्स-रे विवर्तन पैटर्न भूमध्य रेखा और मध्याह्न से विभाजित चार समतुल्य वृत्ताकारों से बना है। विषुवतीय पैटर्न फाइबर अक्ष के लंबवत सार्कोमेरे के भीतर मायोफिलामेंट पैकिंग से उत्पन्न होता है, जबकि मेरिडॉलियन पैटर्न मांसपेशी अक्ष के साथ मायोफिलमेंट से संरचनात्मक जानकारी की रिपोर्ट करते हैं। शेष परावर्तन भूमध्य रेखा अथवा मध्याह्न रेखापर कहलाती है। परत रेखाएँ (उदा., चित्र 2कमें MLL4 और ALL6 लेबल की गई विशेषताएँ) मायोसिन के भीतर आण्विक उपइकाइयों की लगभग-कुंडलिक व्यवस्था से उत्पन्न होती हैं जिसमें मोटी तंतु और पतले तंतु होते हैं। मायोसिन आधारित परत रेखाएँ आराम की मांसपेशी से पैटर्न में मजबूत और तेज होती हैं (चित्र 2ए), जबकि एक्टिन-आधारित परत रेखाएं अनुबंधित मांसपेशी से पैटर्न में अधिक प्रमुख होती हैं (चित्र 2बी)। अनुबंध पैटर्न से आराम पैटर्न घटाकर प्राप्त अंतर पैटर्न (चित्र 2सी) स्वस्थ और रोगग्रस्त मांसपेशियों में बल विकास के दौरान संरचनात्मक परिवर्तन पर प्रकाश डाला जा सकता है. मांसपेशी संकुचन के दौरान आण्विक घटनाओं के मिली सेकंड समय पैमाने पर इन संरचनात्मक परिवर्तनों का पालन करके, एक्स-रे विवर्तन पैटर्न पर्याप्त संरचनात्मक जानकारी प्रकट कर सकते हैं (चित्र2ं)।
MuscleX का उपयोग कर डेटा विश्लेषण. यहाँ MuscleX पैकेज में "इक्वेटर" दिनचर्या का उपयोग कर विषुवतीय प्रतिबिंब विश्लेषण का एक उदाहरण है (चित्र 3)। MuscleX BioCAT13में विकसित एक खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज है। विषुवतीय तीव्रता अनुपात (I1,1/I1,0) आराम की मांसपेशी में एक्टिन के लिए मायोसिन की निकटता का सूचक है (चित्र 3क) जबकि यह अनुबंध में संलग्न क्रॉस-ब्रिजों की संख्या से निकटता से संबंधित है ( चित्र 3बी) मौरीन कंकाल की मांसपेशी2. तीव्रता अनुपात, मैं1,1/I1,0, के बारे में है 0.47 आराम मांसपेशियों में और के बारे में 1.2 करार मांसपेशियों में. दो 1,0 परावर्तन (2* स1,0) के बीच की दूरी अंतर-फिलामेंट रिक्ति से व्युत्क्रम रूप से संबंधित है। विस्तृत प्रलेखन और MuscleX के लिए मैनुअल ऑनलाइन उपलब्ध हैं13.
चित्र 1 : यांत्रिक और एक्स-रे प्रयोग सेटअप और प्रोटोकॉल। (ए) पेशी एक छोर पर प्रायोगिक कक्ष के अंदर हुक पर तथा दूसरे छोर पर दोहरी मोड मोटर/बल ट्रांसड्यूसर की ओर बढ़ जाती है। यह एक्स-रे के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए दो Kapton फिल्म खिड़कियों के बीच आयोजित किया जाता है। कक्ष प्रयोग के दौरान 100% ऑक्सीजन के साथ perfused रिंगर समाधान से भर जाता है. (बी) टेटेनिक संकुचन के दौरान एक मांसपेशी पर एक्स-रे प्रयोगों के लिए यांत्रिक प्रोटोकॉल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : EDL एक्स-रे विवर्तन पैटर्न। ईडीएल मांसपेशी एक्स-रे विवर्तन पैटर्न आराम से (ए) और करार (बी) पेशी. (सी) आराम और करार पैटर्न के बीच अंतर पैटर्न. नीले क्षेत्र आराम पैटर्न में उच्च तीव्रता इंगित करता है, जबकि पीले क्षेत्र अनुबंध पैटर्न में उच्च तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। (घ) ईडीएल पेशी के साथ 1 एमएस एक्सपोजर से एक्स-रे विवर्तन पैटर्न। MLL1 - पहला आदेश मायोसिन परत लाइन; MLL4 - चौथा आदेश मायोसिन परत लाइन; ALL1 ] प्रथम आदेश actin परत लाइन ALL6 ] छठी आदेश actin परत लाइन; ALL7 ] सातवां आदेश actin परत लाइन; टीएम - ट्रोपोमायोसिन परावर्तन (एक सफेद बॉक्स द्वारा इंगित); M3 ] तृतीय क्रम meridional परावर्तन; M6 ] छठे क्रम meridional प्रतिबिंब. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : MuscleX का उपयोग कर विषुवतीय पैटर्न के डेटा विश्लेषण. पृष्ठभूमि घटाया विषुवतीय तीव्रता अनुपात प्रोफ़ाइल (जबकि क्षेत्र) और पहले पांच आदेश (हरी लाइनों) प्रत्येक चोटी की तीव्रता की गणना करने के लिए फिट थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
हमारे समूह से हाल के प्रकाशनों से पता चला है कि माउस कंकाल की मांसपेशियों से एक्स-रे पैटर्न स्वास्थ्य और रोग1,2,3 विशेष रूप से के साथ में मांसपेशियों से सार्कोरिक संरचनात्मक जानकारी पर प्रकाश डाला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न मायोपैथियों के लिए आनुवंशिक संशोधित माउस मॉडल की बढ़ी हुई उपलब्धता। एक्स-रे विवर्तन के साथ संयुक्त एकल फाइबर या छोटे बंडलों पर उच्च संकल्प यांत्रिक अध्ययन सबसे अच्छा विशेषज्ञों द्वारा किया जाता है। यदि, तथापि, और अधिक मामूली यांत्रिक जानकारी अपने प्रयोजनों के लिए पर्याप्त होगा, पूरी मांसपेशियों की तैयारी एक साधारण तैयारी से विस्तृत एक्स-रे पैटर्न के संग्रह की अनुमति देता है.
एक स्वच्छ विच्छेदन एक सफल संयुक्त यांत्रिक और एक्स-रे प्रयोग की कुंजी है। विच्छेदन के दौरान एकमात्र या ईडीएल मांसपेशियों से जुड़ी अन्य मांसपेशियों को लक्ष्य की मांसपेशियों के साथ-साथ खींचने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि यह मांसपेशियों के कुछ हिस्सों को फाड़ सकता है और कम बल का कारण बन सकता है। यह भी क्षतिग्रस्त आंतरिक संरचना है कि एक्स-रे पैटर्न नीचा होगा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। के बाद से सब कुछ एक्स-रे बीम में तितर बितर होगा, यह दूर किसी भी अतिरिक्त वसा की सफाई करने के लिए महत्वपूर्ण है, फासिया में कोलेजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किसी भी बाल या ऊतक के ढीले टुकड़े करते हुए निम्नलिखित प्रोटोकॉल कर रही है. मांसपेशियों की तैयारी में अतिरिक्त अनुपालन को कम करने के लिए, यह भी सुरक्षित रूप से हुक करने के लिए tendons टाई करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह हानिकारक के बिना मांसपेशियों के शरीर के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में.
विभिन्न एक्स-रे जोखिम समय एक ही मांसपेशी से जानकारी के विभिन्न प्रकार प्रदान कर सकते हैं। 18ID पर पूर्ण बीम का उपयोग करते हुए, एक एनालिज़बल विषुवतीय पैटर्न 1 एमएस एक्सपोजर में प्राप्त किया जा सकता है (चित्र 2डदेखें)। एक analyzable पहले मायोसिन परत लाइन प्रतिबिंब के लिए, एक 10 एमएस कुल जोखिम समय आम तौर पर आवश्यक है. इस तरह के M15 (2.8 एनएम myosin meridional प्रतिबिंब) और 2.7 एनएम actin meridional प्रतिबिंब के रूप में उच्च आदेश meridional प्रतिबिंब इकट्ठा करने के लिए, आम तौर पर कम से कम 1 s कुल जोखिम की आवश्यकता है, लेकिन अधिक से अधिक 2 s कुल जोखिम उच्च सटीकता के लिए सिफारिश की है माप.
प्रयोग के लिए इष्टतम एक्स-रे डिटेक्टर का चुनाव महत्वपूर्ण है। सबसे विस्तृत एक्स-रे पैटर्न के लिए एक अनुकूलित सीसीडी डिटेक्टर, जैसे ca. 40 डिग्री मीटर पिक्सल और फॉस्फोर में $65 डिग्री बिंदु प्रसार कार्यों के साथ BioCAT पर एक, उच्च गतिशील रेंज और अच्छा स्थानिक संकल्प के साथ पैटर्न प्रदान कर सकते हैं, लेकिन केवल एक समय में एक फ्रेम ले जा सकते हैं। समय हल प्रयोगों के लिए, BioCAT पर फोटॉन गिनती पिक्सेल सरणी डिटेक्टर 500 हर्ट्ज पर एक्स-रे पैटर्न एकत्र कर सकते हैं. इस डिटेक्टर के साथ 172 डिग्री पिक्सेल आकार, तथापि, मध्याह्न के भीतरी भाग के विस्तृत अध्ययन के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान नहीं करता है, लेकिन सबसे अन्य प्रयोजनों के लिए पर्याप्त है. BioCAT एक उच्च संकल्प फोटॉन गिनती डिटेक्टर 9,000 हर्ट्ज की अधिकतम फ्रेम दर पर 75 डिग्री वास्तविक संकल्प प्रदान हासिल की. इस प्रकार के इसी तरह डिटेक्टरों अगले कुछ वर्षों में मांसपेशियों के अध्ययन के लिए वर्तमान डिटेक्टरों supplant की उम्मीद कर रहे हैं.
तीसरी पीढ़ी के सिंक्रोट्रॉन पर एक्स-रे के बहुत उच्च प्रवाह के साथ, विकिरण क्षति एक गंभीर चिंता का विषय है। यह हमेशा बीम को क्षीण करने के लिए वांछित विवर्तन सुविधाओं का निरीक्षण करने की आवश्यकता से अधिक बीम देने के लिए एक अच्छा विकल्प है। एक क्षीण बीम से जोखिम समय को लम्बा करके एक ही कुल एक्स-रे जोखिम प्राप्त किया जा सकता है। फोटॉन गिनती पिक्सेल सरणी डिटेक्टरों का एक लाभ यह है कि अलग-अलग फ्रेम कोई शोर दंड के साथ एक साथ summed किया जा सकता है. फिर भी, विकिरण क्षति संभव है. विकिरण क्षति के लक्षण संकुचन की अधिकतम बल की बूंद भी शामिल है, परत लाइन प्रतिबिंब के smearing, यहां तक कि मांसपेशियों के रंग का परिवर्तन.
बरकरार माउस कंकाल की मांसपेशियों की तैयारी की सीमाओं में से एक प्रयोगों के दौरान बरकरार मांसपेशियों से सार्कोमर लंबाई प्राप्त करने में कठिनाई है. मांसपेशियों वीडियो माइक्रोस्कोपी और लेजर विवर्तन के लिए बहुत मोटी हैं. जबकि भविष्य के विकास के साथ, विवर्तन पैटर्न14से सीधे सार्कोमयर लंबाई का अनुमान लगाना संभव हो सकता है , निकट अवधि में प्रयोग के बाद इसे मापने का एकमात्र विकल्प है जैसा कि यहां वर्णित है।
Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध में उन्नत फोटॉन स्रोत के संसाधनों का उपयोग किया गया, जो अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) विज्ञान प्रयोक्ता सुविधा का कार्यालय है जो अनुबंध संख्या के तहत आर्गन राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा विज्ञान के डीओई कार्यालय के लिए संचालित है। डे-AC02-06CH11357. इस परियोजना के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से अनुदान P41 GM103622 द्वारा समर्थित किया गया था. Pilatus 3 1M डिटेक्टर का उपयोग NIGMS से अनुदान 1S10OD018090-01 द्वारा प्रदान की गई थी. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों को प्रतिबिंबित करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
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