Summary
Vi presenterar detaljerade protokoll för att utföra små-vinkel X-ray diffraktion experiment med intakt mus skelett muskler. Med den stora tillgängligheten av transgena musmodeller för mänskliga sjukdomar, kan denna experimentella plattform bilda en användbar testbädd för att belysa den strukturella grunden för genetiska muskelsjukdomar
Abstract
Transgena musmodeller har varit viktiga verktyg för att studera förhållandet mellan genotyp och fenotyp för mänskliga sjukdomar, inklusive de av skelettmuskulaturen. Mus skelettmuskel har visat sig producera högkvalitativa röntgen diffraktionsmönster på tredje generationens synkrotron beamlines ger en möjlighet att koppla förändringar på nivån av genotyp till funktionella fenotyper i hälsa och sjukdom genom att fastställa de strukturella konsekvenserna av genetiska förändringar. Vi presenterar detaljerade protokoll för beredning av prover, samla in röntgen mönster och extrahera relevanta strukturella parametrar från röntgen mönster som kan hjälpa vägleda praktiker som vill utföra sådana experiment för sig själva.
Introduction
Synchrotron liten vinkel röntgendiffraktion är den metod för val för att studera nm-skalan struktur aktivt upphandlande muskel beredningar under fysiologiska förhållanden. Viktigt, strukturell information från levande eller flådde muskel preparat kan erhållas i Synchrony med fysiologiska data, såsom muskelkraft och längdförändringar. Det har ökat intresset för att tillämpa denna teknik för att studera den strukturella grunden för ärftliga muskelsjukdomar som har sin grund i punktmutationer i sarcomeric proteiner. Den muskel biofysik samfundet har varit mycket aktiv i att generera transgena musmodeller för dessa sjukdomar hos människor som kan ge idealiska testbäddar för strukturella studier. Senaste publikationer från vår grupp1,2,3 och andra4,5 har indikerat att röntgenbilder från musen extensor digitorum longus (EDL) och soleus muskler kan ge alla diffraktions information tillgänglig från mer traditionella modellorganismer såsom groda och kanin psoas skelettmuskulaturen. En fördel med musen skelettmuskulaturen förberedelse är enkel dissektion och utföra grundläggande membran-intakt, hela muskler fysiologiska experiment. Dimensionerna av dissekerade muskler har tillräcklig massa för att ge mycket detaljerade muskelmönster i mycket korta röntgen exponeringstider (~ millisekund per bildruta) på tredje generationens X-ray beamlines.
Muskel röntgendiffraktion mönster består av de ekvatoriella reflektioner, Meridional reflektioner samt skikt linje reflektioner. Den ekvatoriella intensitet ratio (förhållandet mellan intensiteten i 1, 1 och 1,0 ekvatoriella reflektioner, jag11/I10), är nära korrelerad till antalet bifogade Cross-broar, som är proportionell mot den kraft som genereras i mus skelettmuskel 2. Meridional reflektioner som rapporterar perioditeter inom tjocka och tunna trådar kan användas för att uppskatta glödtråden utökningsbarhet1,3,6,7. Diffraktion funktioner inte på meridianen och ekvatorn kallas lager linjer, som uppstår från den ungefär spiralt beställde myosin huvuden på ytan av tjocka glödtråden ryggrad samt ungefär spiralt beställde tunna glödtrådar. Intensiteten av myosin skikt linjer är nära besläktad med graden av beställning av myosin huvuden under olika förhållanden2,8. All denna information kan användas studera beteenden av sarcomeric proteiner in situ i hälsa och sjukdom.
Synchrotron röntgendiffraktion av muskler har historiskt gjorts av grupper av högt specialiserade experter men framsteg inom teknik och tillgången till nya data verktyg för minskning tyder på att detta inte alltid behöver vara fallet. Den BioCAT Beamline 18ID vid avancerad Photon källa, Argonne National Laboratory har dedikerade personal och stöd för att utföra muskel röntgendiffraktion experiment som kan hjälpa nykomlingar till fältet komma igång med att använda dessa tekniker. Många användare väljer att formellt samarbeta med biocat personal, men ett ökande antal användare tycker att de kan göra experiment och analys själva minska bördan på fd personal. Det primära målet med denna uppsats är att tillhandahålla utbildning som ger potentiella försöksledaren med den information de behöver för att planera och utföra experiment på mus skelettmuskel systemet antingen på biocat fd eller vid andra höga Flux beamlines runt världen där dessa experiment skulle vara möjliga.
Protocol
Alla djur experimentprotokoll godkändes av Illinois Institute of Technology institutionella djuromsorg och användning kommittén (protokoll 2015-001, godkännandedatum: 3 november 2015) och följde NIH "guide för vård och användning av försöksdjur"9 .
1. förberedelse före experimentet
- Förbered 500 mL av Ringers lösning (innehåller: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CaCl2, 10,0 mm Hepes, 11 mM glukos, pH 7,4) färskt för varje dag av experimentet.
- Fyll 200 mL av Ringers lösning i en sprayflaska och förvara vid 4 ° c kylskåp. Fyll en petriskål (10 cm i diameter) med Ringers lösning och parfymera med 100% syre genom att ansluta röret från en syre cylinder till ett akvarium luft sten. Petriskålarna ("dissekera rätter") var tidigare belagda med en elastomerförening för att möjliggöra införande av stift under dissektion.
- Förbered metall monterings krokar. Skär två stycken av rostfrittstål tråd, 0,5 mm i diameter, till lämplig längd och böj tråden i båda ändar för att bilda krokar. Ordna alla dissekera verktyg, sax, sutur binda tång, mikro-sax praktiskt för användning.
Anmärkning: Krok delen ska vara ca 3 mm lång. Den längre tråden (slutar i en krok) bör vara ca 5 cm lång, och den kortare tråden (även slutar i en krok) bör vara ca 1 cm lång för att passa de anpassade kamrarna används på BioCAT och möjliggöra ett tillräckligt utbud av rörelse för givaren armen. -
Anslut och slå på all utrustning. Detta inkluderar en kombinerad motor/kraftgivare, motor/force givare styrenhet en hög effekt bi-phasic nuvarande stimulator, och en datorstyrd datainsamling/kontrollsystem.
- Aktivera datainsamlingssystemet och kalibrera det innan du påbörjar experimentet10. Kort, kalibrera kraften genom att lägga till en uppsättning kända vikter, som täcker upp till 50% av den maximala kraft som mäts av kraft givaren i en linjär progression, på kraft givaren och registrering av utspänningen förändringar. Kalibrera längden genom att använda en uppsättning kända utspänning till spaken armen och mäta längd förändring av armen.
- Anslut slangarna från termoblocket på provhållaren till ett kylt cirkulerande badkar och Ställ in temperaturen för att bibehålla den önskade temperaturen i kammaren till mellan 10 ° c och 40 ° c. Bestäm detta empiriskt före tid genom att ställa in cirkulerande badet till en rad olika temperaturer och mäta temperaturen i kammaren med ett termoelement.
2. muskel beredning
-
Euthanizing musen
- Euthanize musen genom koldioxid inandning följt av cervikal dislokation.
- Spraya huden på bakbenen med Cold Ringers lösning för att förhindra att håret blåser in i preparatet. Ta bort huden genom att skära bort runt låret med fin dissektion sax och snabbt dra huden ner med hjälp av #5 tång för att exponera musklerna.
- Amputera bakbenet och överför det till en dissekering maträtt som har fyllts med som Ringers lösning, och sedan placera under ett binokulärt dissekera Mikroskop.
-
Förbereda en soleus Muscle
- Stift bakbenen nedåt i dissekera skålen med gastrocnemius muskeln vänd uppåt. Skär den distala senan i gastrocnemius/soleus muskelgrupp och lyfta musklerna försiktigt och långsamt genom att skära bort fascian på vardera sidan av gastrocnemius muskeln med hjälp av fin sax. Isolera gastrocnemius/soleus muskelgrupp från extremiteten efter frigöra proximala senan av soleus muskeln.
- Stift muskelgruppen som innehåller gastrocnemius muskeln och distala senan ner i dissekera skålen. Lyft soleus muskeln försiktigt via proximala senan och separera den från gastrocnemius muskeln lämnar så mycket av soleus distala senan intakt som möjligt.
-
Förbereda en extensor digitorium longus (EDL) muskel
- Fäst bakbenen i den dissekerande skålen med tibialis främre muskel vänd uppåt. Skär fascian längs tibialis anterior (TA) muskler och dra det klart med hjälp av tång. Identifiera och klippa distala senan av TA-muskeln. Lyft TA-muskeln och skär ut den försiktigt utan att dra i EDL-muskeln.
- Klipp öppna den laterala sidan av knäet och exponera de två senor. Skär den proximala senan, lämnar så mycket av senan som möjligt fortfarande knutna till muskeln, och lyfta EDL muskeln (mediala muskler) genom att försiktigt dra senan. Skär den distala senan när den är exponerad.
-
Montering av muskeln
- PIN ner muskeln via senor, och trimma alla extra fett, fascia och senor bort så mycket som möjligt. Sätt en senan i en pre-bunden Knut och knyta suturen tätt med sutur binda tång. Knyt den andra knuten runt metall kroken.
- Upprepa samma förfarande med den långa kroken på andra änden av senan. Se till att ingen av kroppen av muskeln kontaktas av suturer. Detta kommer att skada preparatet.
- Fäst den korta kroken till botten av experiment kammaren och den långa kroken till Dual-läge kraftgivare/motor. Bubbla lösningen i experiment kammaren med 100% syre.
-
Optimera stimulering protokoll och muskel längd
- Sträck ut muskeln genom att justera mikromanipulatorerna som är fästa på givaren/motorn för att generera en baslinje spänning mellan 15 till 20 mN innan du hittar de bästa stimulans parametrarna. Ställ in stimuleringspänningen till 40 V. Stimulans strömmen ökas systematiskt tills det inte finns någon ytterligare ökning av Twitch-kraften. Den högsta ström som hittats ökas med ca 50% för att säkerställa övermaximal aktivering.
- Hitta den optimala längden, L0, definierad som muskel längd som ger maximal Twitch kraft, genom att öka muskel längden och aktivera muskeln med en enda rycka tills den aktiva kraften (Peak Force minus utgångs kraft) slutar öka.
- Utför en kort tetanisk sammandragning (1 s aktivering) för att testa monteringen och sträck ut muskeln tillbaka till optimal bas kraft vid behov. Spela in muskel längden i mm med en digital bromkoper.
3. röntgendiffraktion
Anmärkning: Följande beskrivning är för röntgen diffraktions experiment görs med hjälp av den lilla vinkeln x-ray diffraktion instrument på biocat fd 18id på avancerad Photon källa, Argonne National Laboratory men liknande metoder skulle kunna användas på andra beamlines som ID 02 på ESRF (Frankrike) och BL40XU på SPring8 (Japan). Beamline 18ID drivs med en fast röntgenstråle energi på 12 keV (0,1033 nm våglängd) med ett incident flöde på ~ 1013 fotoner per sekund i helljuset.
- Välj ett preparat till detektor avstånd (kamerans längd). Använd en 1,8 m kamera längd för experiment som undersöker 2,7 nm aktin och High order myosin reflektioner såsom 2,8 nm Meridional reflektioner. Använd en 4-6 m kamera för andra experiment, där man främst är intresserad av fina detaljer på meridianen och lager linjerna
-
Optimera provets position i balken
- Bestäm strål positionen genom att använda en bit röntgen känsligt papper som ger en mörk fläck som svar på röntgenstrålar ("en brännskada"). Använd sedan en video Cross-Hair generator för att skapa ett hårkors i linje med bränningen märket på papperet eller helt enkelt göra en markering på videoskärmen med en märkpenna.
- Använd det grafiska användargränssnittet BioCAT till prov lägesställare för att flytta muskeln till att centreras på strål positionen. Oscillera provkammaren vid ~ 10-20 mm/s genom att flytta provtagnings stadiet för att sprida röntgen dosen över muskeln under exponeringen. Observera provet när det rör sig för att undvika stora regioner av fascia (innehåller kollagen som kommer att förorena diffraktion mönster) och att se till att den förblir upplyst under hela vägen av sin resa.
Anmärkning: De exakta steg som krävs i avsnitten 3,3 och 3,4 för att göra nödvändiga inställningar och åtgärder med hjälp av fd-medföljande grafiska användargränssnittet kommer att vara fd och detektor specifik. Be fd personal om hur man utför dessa åtgärder.
-
Ställa in CCD (Charge kopplad enhet) detektor för högupplösta mönster från muskler i definierade statiska tillstånd (vila, eller under isometrisk kontraktion)
- Ställ in exponeringstid och exponeringsperiod i det grafiska användargränssnittet till kontrollprogram varan. Ta en mörk bakgrundsbild innan du tar exponeringen och upprepa denna procedur varje 2 timmar eller efter byte av exponeringstid för att korrigera någon avdrift i detektorn avläsning elektronik.
- Dämpa röntgenstrålen till önskat värde för exponeringen. Ta sedan en bild. Det går inte att ta bilder med denna detektor. CCD-detektorn behöver också flera sekunder för att läsa upp en individuell bild.
-
Ställa in pixel mat ris detektorn för ett tidslöst experiment
- Ställ in antalet bilder, exponeringstid, exponeringsperiod i det grafiska användargränssnittet. Pixel array-detektorn som används här behöver minst 1 ms för avläsning. Den maximala bildfrekvensen för fotons räkning detektor är 500 Hz. Använd fotons räknar detektor utsignalen för att styra röntgen avtryckaren.
- Dämpa strålen till önskad intensitet. Beväpna detektorn och vänta på avtryckaren från datainsamlingssystemet. Synkronisera de mekaniska och röntgen data genom att utlösa dem på samma gång. Röntgen mönstren samlas kontinuerligt under hela protokoll a med 1 MS exponeringstid och en exponeringsperiod på 2 MS.
Anmärkning: Den exakta exponeringstiden och exponeringsperioden bör bestämmas från fall till fall för den information som önskas och den observerade livstiden för provet i balken. Dämpa strålen för att inte använda mer röntgenstråle än vad som behövs för att tillhandahålla analyserbara data under den valda exponeringsperioden.
4. efter experiment muskel behandling
- Återhämta sig och väga muskeln efter varje mekanisk och röntgen experiment. Beräkna tvärsnittsarea av muskeln med hjälp av den uppmätta muskel längd och muskelmassa11 antar en muskel täthet på 1,06 g/ml12.
- Sträck ut muskeln till experimentell längd och fixera muskeln i 10% formalin för 10 min. separera den fasta muskeln i en serie av fiber buntar utvalda från platser i hela muskeln över avsnitt3.
- Mät sarcomere längd med hjälp av en video sarcomere längd mätsystem.
Representative Results
ISO metrisk tetanisk kontraktion. Alla typer av klassiska muskel mekaniska experiment, såsom isometriska eller Isotoniska sammandragningar, kan utföras med samtidig förvärv av röntgen mönster. Figur 1 A visar experimentella inställningar för mekaniska och röntgen experiment. Ett exempel på Force trace för en isometrisk tetanisk kontraktion visas i figur 1B. Muskeln hölls vilande för 0,5 s innan aktiveras för 1 s. Den mekaniska inspelningen stoppar 1 s efter stimulansen. Röntgen mönstren samlades in kontinuerligt genom protokollet vid 1 MS exponeringstid på 500 Hz.
Röntgen diffraktionsmönster. Muskeln röntgendiffraktion mönster kan ge nanometer upplösning strukturell information från strukturer inuti sarcomere. Muskel röntgen diffraktionsmönster består av fyra likvärdiga kvadranter dividerat med ekvatorn och meridianen. Den ekvatoriella mönstret uppstår från myofilament packning inom sarcomere vinkelrät mot fiber axeln, medan Meridional mönster rapport strukturell information från hjärtmyofilamenten längs muskel axeln. De resterande reflexionerna inte på ekvatorn eller meridianen kallas lagrar fodrar. Layer Lines (t. ex. funktioner märkta MLL4 och ALL6 i figur 2A) uppstår från ungefär spiralformade arrangemang av molekylära subenheter inom myosin som innehåller tjocka filament och aktin som innehåller tunna trådar. Den myosin-baserade skikt linjer är starka och skarpa i mönster från vilo muskel (figur 2a), medan Actin-baserade lager linjer är mer framträdande i mönster från upphandlande muskel (figur 2B). Skillnaden mönster erhålls genom att subtrahera vilo mönstret från den upphandlande mönstret (figur 2C) kan belysa strukturella förändringar under kraftutveckling i friska och sjuka muskler. Genom att följa dessa strukturella förändringar på millisekunden tid skala av molekylära händelser under muskelkontraktion, röntgendiffraktion mönster kan avslöja betydande strukturell information (figur 2D).
Data analys med MuscleX. Här är ett exempel på analys av ekvatoriella reflektioner med hjälp av "ekvatorn"-rutinen i MuscleX-förpackningen (figur 3). MuscleX är ett programvarupaket med öppen källkod som utvecklats på BioCAT13. Den ekvatoriella intensitet ratio (I1, 1/I1,0) är en indikator på närheten av myosin att aktin i vila muskler (figur 3A), medan den är nära korrelerade till antalet bifogade tvär broar i upphandlande ( Figur 3B) murin skelettmuskulaturen2. Intensiteten förhållandet, I1, 1/I1,0, är ca 0,47 i vila muskler och om 1,2 i upphandlande muskler. Avståndet mellan de två 1,0 reflektion (2 * S1,0) är omvänt relaterat till Inter-filament avstånd. Detaljerade dokumentationer och manualer för MuscleX finns på nätet13.
Figur 1 : Mekanisk och röntgen experiment setup och protokoll. (A) muskeln monteras i ena änden till en krok inuti experiment kammaren och den andra änden till en motor/kraftgivare med Dubbelläge. Det hålls mellan två Kapton film fönster så att röntgenstrålar passera. Kammaren är fylld med Ringers lösning parfymera med 100% syre i hela experimentet. (B) det mekaniska protokollet för röntgen experiment på en muskel under tetanisk sammandragning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : EDL röntgen diffraktionsmönster. EDL muskel röntgendiffraktion mönster från vila (a) och upphandlande (B) muskel. Cdifferensmönstret mellan vilo-och entreprenad mönstret. Den blå regionen indikerar hög intensitet i vilo mönstret, medan den gula regionen representerar hög intensitet i entreprenad mönstret. D) röntgen diffraktionsmönster från en 1 MS-exponering med EDL-muskler. MLL1 = första ordningens myosin skikt linje; MLL4 = fjärde ordningens myosin skikt linje; ALL1 = första ordningens aktin Layer line ALL6 = sjätte ordningens aktin Layer Line; ALL7 = sjunde ordningens aktin-skikt linje; TM = Tropomyosin reflexion (indikeras av en vit boxas); M3 = tredje ordningens Meridional reflektion; M6 = sjätte ordningens Meridional reflektion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Data analys av ekvatoriella mönster med MuscleX. Bakgrunden subtraberas den ekvatoriella intensitetskvoten (medan området) och de första fem beställningarna (gröna linjer) passade för att beräkna intensiteten för varje topp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Senaste publikationer från vår grupp visade att röntgen mönster från musen skelettmuskulaturen kan användas för att belysa sarcomeric strukturell information från muskler i hälsa och sjukdom1,2,3 särskilt med den ökade tillgängligheten av genetiskt modifierade musmodeller för olika myopatier. Högupplöst mekaniska studier på enstaka fibrer eller små buntar kombinerat med röntgendiffraktion görs bäst av experter. Om, emellertid, mer blygsam mekanisk information kommer att räcka för dina ändamål, hela muskeln preparatet tillåter insamling av detaljerade röntgen mönster från en enkel beredning.
En ren dissektion är nyckeln till en lyckad kombinerad mekanisk och röntgen experiment. Det är mycket viktigt att inte dra på mål muskeln samt andra muskler i samband med soleus eller EDL muskler under dissektion eftersom detta kan riva delar av muskeln och leda till minskad kraft. Det kan också leda till skadade inre struktur som kommer att försämra röntgen mönster. Eftersom allt kommer att sprida sig i röntgenstrålen, är det viktigt att rengöra bort eventuella extra fett, kollagen i fascia samt alla hårstrån eller lösa bitar av vävnad medan du gör följande protokoll. För att minska ytterligare efterlevnad i muskeln preparatet, det är också viktigt att säkert binda senor till krokar, så nära som möjligt till muskel kroppen utan att skada den.
Olika X-ray exponeringstider kan ge olika typer av information från samma muskel. Med full stråle på 18ID kan ett analyserbart ekvatoriellt mönster erhållas i en 1 MS-exponering (se figur 2D). För en analyserbart första myosin skikt linje reflektion, en 10 MS total exponeringstid krävs normalt. För att samla högre ordning Meridional reflektioner såsom M15 (2,8 nm myosin Meridional reflektion) och 2,7 nm aktin Meridional reflektion, typiskt minst 1 s totala exponeringen krävs men mer än 2 s totala exponeringen rekommenderas för hög noggrannhet Mätningar.
Valet av optimal röntgen detektor för experimentet är viktigt. För de mest detaljerade röntgen mönster en anpassad CCD-detektor, såsom den på BioCAT med ca. 40 μm pixlar och ~ 65 μm punkt sprids funktioner i fosfor, kan ge mönster med hög dynamiskt omfång och god rumslig upplösning men kan bara ta en ram i taget. För tid löst experiment, den Photon Counting pixel array detektor på BioCAT kan samla röntgen mönster på 500 Hz. Den 172 μm pixelstorlek med denna detektor, dock inte ger tillräcklig rumslig upplösning för detaljerade studier av den inre delen av meridianen, men är tillräcklig för de flesta andra ändamål. BioCAT förvärvade en högupplöst Photon Counting detektor som ger 75 μm verklig upplösning vid maximal bildhastighet på 9 000 Hz. liknande detektorer av denna typ förväntas ersätta nuvarande detektorer för muskel studier under de närmaste åren.
Med de mycket höga flödena av röntgenstrålar vid tredje generationens synchrotrons är strålningsskador ett allvarligt bekymmer. Det är alltid ett bra val att dämpa strålen för att leverera ingen mer balk än vad som behövs för att Observera de önskade diffraktion funktioner. Samma totala X-ray-exponering kan uppnås genom att förlänga exponeringstiden från en försvagad stråle. En fördel med Photon Counting pixel array detektorer är att enskilda ramar kan summeras tillsammans utan buller straff. Även då är strålningsskador möjligt. Tecken på strålningsskador inkluderar droppe av maximal kraft av kontraktion, smetar av lager linje reflektioner, även förändring av muskel färg.
En av begränsningarna i intakt mus skelettmuskel förberedelse är svårigheten att få sarcomere längd från intakt muskler under experimenten. Musklerna är för tjocka för videomikroskopi och laser diffraktion. Även med framtida utveckling kan det vara möjligt att uppskatta sarcomere längd direkt från diffraktion mönster14, i den närmaste tiden det enda alternativet är att mäta det efter experimentet som beskrivs här.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning används resurser av den avancerade Photon källa, en US Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning drivs för DOE Office of Science av Argonne National Laboratory under kontrakt nr. DE-AC02-06CH11357. Detta projekt stöddes av Grant P41 GM103622 från det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health. Användning av Pilatus 3 1M detektor tillhandahölls av Grant 1S10OD018090-01 från NIGMS. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som det nationella institutet för allmänmedicin eller National Institutes of Health har.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
- Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
