Summary
ट्यूमर microenvironment कैंसर के विकास और आक्रमण का एक अनिवार्य हिस्सा है । कार्सिनोमा प्रगति की नकल करने के लिए, एक जैविक रूप प्रासंगिक मानव मैट्रिक्स की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल में एक मानव leiomyoma आधारित मैट्रिक्स लागू करके इन विट्रो तीन आयामी गोलाभ आक्रमण परख के लिए एक सुधार का परिचय । प्रोटोकॉल भी एक कंप्यूटर आधारित सेल आक्रमण विश्लेषण का परिचय ।
Abstract
दो आयामी कोशिका संस्कृति आधारित assays है सामांयतः में इन विट्रो कैंसर अनुसंधान में उपयोग किया जाता है । हालांकि, वे कई बुनियादी तत्वों है कि ट्यूमर microenvironment फार्म की कमी है । विट्रो परिणामों में और अधिक विश्वसनीय प्राप्त करने के लिए, कई तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति assays हैं पेश किया गया है. ये assays हैं, कैंसर कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं । इस बातचीत के प्रसार और आक्रमण के रूप में सेल व्यवहार को प्रभावित करता है, साथ ही साथ कोशिका morphology. इसके अतिरिक्त, इस बातचीत के लिए प्रेरित या कई समर्थक और विरोधी tumorigenic अणुओं की अभिव्यक्ति को दबा सकता है । Spheroid आक्रमण परख कैंसर सेल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त 3 डी में विट्रो विधि प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था । वर्तमान में, पशु व्युत्पंन matrices, जैसे माउस सार्कोमा व्युत्पंन मैट्रिक्स (msdm) और चूहे की पूंछ प्रकार मैं कोलेजन, मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे है गोलाभ आक्रमण assays हैं । मानव ट्यूमर microenvironment और पशु व्युत्पंन matrices के बीच मतभेदों को ध्यान में रखते हुए, एक मानव myoma व्युत्पंन मैट्रिक्स (HMDM) सौम्य गर्भाशय leiomyoma ऊतक से विकसित किया गया था । यह दिखाया गया है कि hmdm प्रवास और कार्सिनोमा कोशिकाओं के आक्रमण msdm से बेहतर लाती है । इस प्रोटोकॉल एक सरल, reproducible, और विश्वसनीय 3 डी मानव ट्यूमर आधारित गोलाभ आक्रमण hmdm का उपयोग परख/ इसमें इमेजिंग और विश्लेषण पर विस्तृत निर्देश भी शामिल हैं । Spheroids एचएमएमडीएम के भीतर एक U-आकार अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में वृद्धि/ आक्रमण दैनिक imaged, मापा जाता है, और ilastik और फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया । परख मंच मानव स्वरयंत्र प्राथमिक और मेटास्टेटिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा सेल लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । हालांकि, प्रोटोकॉल भी अंय ठोस कैंसर सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है ।
Introduction
पारंपरिक दो आयामी (2 डी) कोशिका संस्कृति के अध्ययन में काफी कैंसर अनुसंधान के लिए योगदान दिया है । वर्तमान में, शोधकर्ताओं को और अधिक तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति assays है की ओर स्थानांतरित कर रहे है बेहतर करने के लिए vivo में1शर्तों की नकल । 3 डी कैंसर कोशिका संस्कृति और अधिक सही कोशिका कोशिका और सेल मैट्रिक्स बातचीत, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, दवा संवेदनशीलता, और संकेतन मार्ग गतिविधि2,3के मामले में जटिल ट्यूमर microenvironment को दर्शाता है ।
कई 3 डी कोशिका संस्कृति मॉडल कैंसर अनुसंधान में इस तरह के ट्यूमर ऊतक explant, एक चिप पर ट्यूमर के रूप में उपयोग किया जाता है, और बहु कोशिकीय ट्यूमर spheroids3,4। बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids अब व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, के रूप में वे मानव ट्यूमर1,5में vivo में स्थितियों में कई सुविधाओं की नकल । जब गोलाभ व्यास ५०० μm से अधिक है, यह भी hypoxic क्षेत्रों और एक परिगलित केंद्र है, इस प्रकार vivo में ट्यूमर स्थिति2का प्रतिनिधित्व ।
कई सिंथेटिक (जैसे, polydimethylsiloxane) और पशु व्युत्पन्न (जैसे, चूहा पूंछ प्रकार मैं कोलेजन और माउस सार्कोमा व्युत्पंन मैट्रिक्स, matrigel, एमएसडीएम के रूप में संदर्भित) matrices3डी सेल संस्कृति के लिए विकसित किया गया है assays हैं,6, 7,8. इस प्रकार अभी तक, कोई भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध matrices मानव ट्यूमर ऊतक से उत्पंन हुआ है । इसलिए, वे मानव ट्यूमर microenvironment है, जो कैंसर सेल आक्रमण8प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव है की सुविधाओं की कमी है ।
Myogel (मानव myoma-मैट्रिक्स व्युत्पंन, HMDM के रूप में संदर्भित) मानव गर्भाशय leiomyoma ट्यूमर ऊतक9से निकाला जाता है । यह दर्शाया गया है कि एचएमडीएम के प्रोटीन की मात्रा एमएसडीएम से काफी भिन्न है । दरअसल, एचएमडीएम प्रोटीन का ६६ प्रतिशत एमएसडीएम प्रोटीन से अलग होता है । दूसरी ओर, कुछ प्रोटीन, जैसे laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, heparan सल्फेट proteoglycans, nidogen, और एपिडर्मल विकास कारक, दोनों matrices10में मौजूद हैं । इसके अतिरिक्त, माउस एंजाइम सामग्री में मानव से अलग है, मनुष्य के साथ ७८ कम proteases11चूहों से ।
Fibrin व्यापक रूप से किया गया है अकेले या एक पाड़ सामग्री12के रूप में अंय सामग्री के साथ संयोजन में । 3 डी कोशिका संस्कृति में assays हैं, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन एक फाइफ़िन हाइड्रोजेल12फार्म के लिए संयुक्त कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन पहले से शुरू की एक सुधार 3 डी ट्यूमर गोलाभ आक्रमण परख7। इस नए प्रोटोकॉल पर लागू होता है मानव ट्यूमर व्युत्पंन मैट्रिक्स के बजाय माउस व्युत्पंन ट्यूमर मैट्रिक्स । यह भी इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों का उपयोग कर ilastik और फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर शामिल है । इस प्रोटोकॉल कई अलग ठोस कैंसर सेल लाइनों के गोलाभ परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सा विकसित करने के लिए और कैंसर सेल आक्रमण पर विशिष्ट अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक जैविक रूप से प्रासंगिक उपकरण प्रदान करता है ।
Protocol
1. बहुकोशिकीय ट्यूमर Spheroids की पीढ़ी
नोट: प्रोटोकॉल यहां UT-SCC-42A और-42A सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन किया है, लेकिन यह भी अंय सेल लाइनों का उपयोग कर लागू हो सकता है ।
- के साथ यूटी-scc-42a और-42a कोशिकाओं को धो लें फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) के 6 मिलीलीटर, ०.०५% trypsin जोड़ने-edta (७५ सेमी2 फ्लास्क के लिए 3 मिलीलीटर), और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में फ्लास्क जगह (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, ९५% आर्द्रता) 2-5
- जांच करें कि कोशिकाओं को एक खुर्दबीन के नीचे अलग कर दिया है । तो पूरा dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (dmem) मीडिया (dmem + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ने, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, २५० एनजी/एमएल एम्फीटेरिसिन बी बी, ०.४ μg/ml हाइड्रोकॉर्टिएक ५० 2 फ्लास्क) और सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ट्रांसफर करें ।
नोट: कक्ष संस्कृति माध्यम है कि अध्ययन किया जा रहा कक्षों सूट का चयन करें । - अपकेंद्रित्र २०० x g पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन ।
- Supernatant निकालें और पूर्ण DMEM की 2-5 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित ।
- कोशिकाओं की गणना और २०,००० कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पूरा DMEM साथ सेल निलंबन पतला.
नोट: प्रत्येक कक्ष रेखा के लिए इष्टतम कक्ष गणना निर्धारित की जानी चाहिए । - प्रत्येक अल्ट्रा कम लगाव ९६-अच्छी तरह से प्रति १,००० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठीक दौर नीचे प्लेट में सेल निलंबन की ५० μL बांटना ।
- सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, ९५% आर्द्रता) के लिए थाली स्थानांतरण । चार दिन बाद, नेत्रहीन एक औंधा खुर्दबीन के साथ ट्यूमर गोलाभ गठन की पुष्टि करें और परख के साथ आगे बढ़ना । सुनिश्चित करें कि प्रति अच्छी तरह से केवल एक ही गोलाभ है ।
नोट: स्लाभ बनाने में लगने वाला समय विभिन्न कोशिका रेखाओं के बीच बदलता रहता है ।
2. तीन आयामी Spheroid आक्रमण परख
नोट: 2x समाधान तैयार है क्योंकि जेल 1:1 पतला हो जाएगा जब कुओं में जोड़ा ।
- एक जल स्नान में बर्फ और फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान पर hmdm पिघलना ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा । जब तक यह पूरी तरह से घुलनशील है और बर्फ पर समाधान नहीं डाल फाइब्रिनोजेन परेशान मत करो; वर्षण हो जाएगा ।
- प्रत्येक अभिकर्मक की उपयुक्त मात्रा को एक साथ मिलाएं: 1 मिलीग्राम/एमएल HMDM (अंतिम एकाग्रता: ०.५ मिलीग्राम/एमएल), ०.६ U/एमएल थ्रोम्बिन (अंतिम एकाग्रता: ०.३ U/एमएल), ६६.६ मिलीग्राम/एमएल aprotinin (अंतिम एकाग्रता: ३३.३ यूजी/एमएल), और 1 मिलीग्राम/एमएल फाइनोजेन (अंतिम एकाग्रता: ०.५ मिलीग्राम/एमएल ).
नोट: बस कुओं में मिश्रण वितरण और जल्दी से काम करने से पहले फाइब्रिनोजेन जोड़ें; यह कुछ ही मिनटों में जेल का रूप धारण कर लेगा । एक समय में सिर्फ कुछ कुओं का इलाज करें । - प्रत्येक अच्छी तरह से जेल के ५० μL जोड़ें । ठीक है और पिपेट के अंदर की दीवार की ओर धीरे टिप प्रत्यक्ष । एयर बुलबुले से बचें (रिवर्स pipetting तकनीक का उपयोग) और अच्छी तरह के केंद्र से गोलाभ स्थानांतरित करने के लिए नहीं की कोशिश करो ।
- थाली वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर करने के लिए और HMDM की अनुमति दें/-fibrin मैट्रिक्स 30 मिनट के लिए जमना करने के लिए, और धीरे से जेल के शीर्ष पर एक अच्छी तरह से पूरा DMEM के १०० μL जोड़ें ।
3. इमेजिंग
- छवि spheroids दैनिक एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करें ।
4. Ilastik के साथ छवि विभाजन
- Ilastik खोलें और पिक्सेल वर्गीकरण वर्कफ़्लो का चयन करें (चित्र 1A) । यह उपयोगकर्ता द्वारा किए गए एनोटेशन के आधार पर पिक्सेल्स को वर्गीकृत करता है । Ilastik प्रोजेक्ट (. ilp) को कंप्यूटर में सहेजें ।
- विश्लेषण के लिए छवियां जोड़ें । इनपुट डेटा क्लिक करें और नया जोड़ें और फिर छवियां चुनें (चित्र 1ख) ।
-
सुविधा चयन के लिए, सुविधा चयन क्लिक करें और सुविधाएं चुनें (चित्रा 1सी, लाल आयत) ।
नोट: चयनित सुविधाएं मोटे तौर पर उन विज़ुअल गुणों से संबंधित होनी चाहिए जो ऑब्जेक्ट्स को पृष्ठभूमि से अलग करते हैं, और उनका उपयोग क्लासिफायर के प्रशिक्षण के लिए किया जाएगा ।- बक्सों को क्लिक करके सुविधाओं का चयन करें । चयनित बक्से हरे रंग के हो जाएंगे (चित्र 1ग, नीला आयत) ।
नोट: यहां उपयोगकर्ता कई विभिंन प्रकार की सुविधा और तराजू से चुन सकते हैं । रंग या चमक के आधार पर वस्तुओं को अलग करने के लिए का चयन किया जाना चाहिए । एज चमक या रंग gradients के आधार पर अलग वस्तुओं के लिए चुना जाना चाहिए । बनावट एक महत्वपूर्ण विशेषता है अगर छवि में वस्तुओं एक विशेष गठनात्मक उपस्थिति है । इस परख के लिए, रंग/(सिग्मा 0) और एज (सिग्मा 6) का उपयोग किया जाता है ।
- बक्सों को क्लिक करके सुविधाओं का चयन करें । चयनित बक्से हरे रंग के हो जाएंगे (चित्र 1ग, नीला आयत) ।
-
प्रशिक्षण के लिए, प्रशिक्षण पर क्लिक करें और प्रशिक्षण अनुभाग में दो लेबल हैं: लेबल 1 और लेबल 2 (चित्र 1D, लाल आयत) । यदि केवल एक लेबल है, तो जोड़ें लेबल दबाकर कोई नया लेबल जोड़ें (चित्रा 1D, नीला आयत) ।
- किसी एक लेबल के साथ पृष्ठभूमि चिह्नित करें (चित्र 1d, पीला) और अंय लेबल वाले कक्ष (चित्र 1d, नीला) ।
- छवियों के पहले 10% के लिए सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित । वर्तमान दृश्यसे अगली छवि चुनें ।
- कोशिकाओं और पृष्ठभूमि (पहली छवि के) के रूप में चिह्नित कर रहे हैं के बाद, प्रेस लाइव अद्यतन (चित्रा 1डी, बैंगनी आयत).
नोट: अगले छवि के साथ, ilastik स्वचालित रूप से पिछले छवियों के अनुसार विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे ।
- प्रशिक्षण के बाद किया है और ilastik सभी छवियों का विश्लेषण किया है, क्लिक करें पूर्वानुमान निर्यात। स्रोतसे साधारण विभाजन चुनें; संभाव्यताओं या कुछ और का चयन न करें (चित्र 1ई).
- चुनें से वांछित उत्पादन फ़ाइल स्वरूप का चयन करें छवि सेटिंग्स निर्यात करें.. । भविष्यवाणी निर्यात अनुभाग में (चित्रा 1ई) । सभी निर्यात करें (चित्र 1F) क्लिक करके लेबलिंग के परिणामों को निर्यात करना । फ़ाइलें मूल छवियों के साथ एक ही फ़ोल्डर में निर्यात किया जाएगा ।
नोट: इस प्रयोग में,. h5 स्वरूप का उपयोग किया जाता है ।
5. फिजी ImageJ के साथ क्षेत्र विश्लेषण
-
स्केल सेटिंग
- फिजी ImageJ में स्केल बार के साथ मूल छवि खोलें (चित्र 2a) । सुनिश्चित करें कि छवि का एक ही आकार और विश्लेषण छवियों के रूप में आयाम है । ज्ञात लंबाई की रेखा आरेखित करने के लिए पंक्ति चयन उपकरण का उपयोग करें (चित्र 2ख) ।
नोट: इस प्रोटोकॉल फिजी ImageJ १.५१ (६४-बिट) और ilastik-1.3.2 rc का उपयोग करके निष्पादित किया जाता है । - विश्लेषण और सेट स्केल (चित्रा 2C) पर क्लिक करें. ज्ञात दूरी फ़ील्ड में ज्ञात दूरी सेट करें और उचित इकाई सेट और वैश्विक (चित्रा 2D) क्लिक ।
- फिजी ImageJ में स्केल बार के साथ मूल छवि खोलें (चित्र 2a) । सुनिश्चित करें कि छवि का एक ही आकार और विश्लेषण छवियों के रूप में आयाम है । ज्ञात लंबाई की रेखा आरेखित करने के लिए पंक्ति चयन उपकरण का उपयोग करें (चित्र 2ख) ।
-
मैक्रो स्थापित कर रहा है
- यदि एक प्लगइन ilastik स्थापित नहीं है, इन चरणों का पालन करें: क्लिक करें मदद, अद्यतन... । खुली विंडो Imagej Updaterपर, अद्यतन साइट्स प्रबंधितकरेंक्लिक करें । खुली विंडो पर अद्यतन साइट्स का प्रबंधनकरें, ilastik के लिए अगला क्लिक करेंऔर उसके बाद बंदकरेंक्लिक करें । फिर विंडो Imagej Updaterमें परिवर्तन लागू करेंक्लिक करें । इस प्रक्रिया में कुछ समय लग सकता है । अगली विंडो सफलतापूर्वक अद्यतनकिए गए पाठ के साथ जानकारी होगी । क्लिक करें ठीक है और पुनः आरंभ ImageJ ।
- प्लगइंस, मैक्रोज़, और स्थापित करें (चित्रा 3A) फिर काउंटर. ijm फ़ाइल चुनें ( पूरक जानकारीदेखें) और खोलेंक्लिक करें ।
नोट: मैक्रो विशेष रूप से क्षेत्र को मापने के लिए लिखा गया था । हर बार सॉफ्टवेयर खोलने पर मैक्रो इंस्टॉल होना चाहिए ।
-
क्षेत्र विश् लेषण
- छवियों का विश्लेषण जब सभी plugins स्थापित कर रहे हैं । Plugins क्लिक करें और ilastik के लिए नीचे स्क्रॉल (चित्रा 3सी) । HDF5 आयातचुनें,. h5 प्रारूप के साथ फ़ाइल चुनें, खोलें क्लिक करें और लोड और lut लागू (चित्रा 3सी, डी) ।
- कुंजीपटल ( मैक्रो) से बटन दबाएं और क्षेत्र सारांश विंडो में कुल क्षेत्र के रूप में दिखाई देगा (चित्र 3E) ।
Representative Results
चार दिनों के बाद UT-SCC-42B (मेटास्टेटिक स्वरयंत्रीय SCC सेल लाइन) सेल सीडिंग, मैट्रिक्स (HMDM/फाइब्रोन, MSDM, या कोलेजन) के गठन spheroids पर जोड़ा गया था (0 दिवस) और आक्रमण तीन दिनों के लिए निगरानी की गई थी । यहां छवियां एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दैनिक प्राप्त किया गया (चित्रा 4) ।
एक बार एंबेडेड, HMDM में कोशिकाओं/एक दिन के बाद तेजी से आक्रमण करने के लिए शुरू किया और मैट्रिक्स में विस्तारित (चित्रा 4ए). MSDM में कोशिकाओं आसपास के मैट्रिक्स में आक्रमण नहीं किया, बजाय एक विषम संरचना बनाने (चित्रा 4बी). दूसरी ओर, कोलेजन में कोशिकाओं को थोड़ा पर हमला किया, लेकिन मैट्रिक्स संकुचन के कारण विश्लेषण मुश्किल था (चित्रा 4सी). कुछ कोलेजन कुओं में, spheroids भी तीन दिनों के बाद गायब हो गया (चित्रा 4सी).
चित्रा 5 hmdm में सेल आक्रमण की मात्रा का पता चलता है/प्राथमिक स्वरयंत्र scc सेल लाइन ut-scc-42a और इसी मेटास्टेटिक सेल लाइन UT-scc-42a के fibrin । वीडियो (1 फिल्म) hmdm के एक जीवित सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर लिया/(फाइफ़िन गोलाभ) मैट्रिक्स के भीतर scc कोशिकाओं के आंदोलन से पता चलता है, जहां वे अंय कोशिकाओं द्वारा पीछा किस्में फार्म ।
चित्रा 1 : छवि विभाजन । Ilastik का उपयोग कर छवि विभाजन के चयनित चरणों । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : स्केल सेटिंग । फिजी ImageJ का उपयोग करते हुए स्केल सेटिंग के चयनित चरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : आक्रमण विश्लेषण ImageJ का उपयोग कर । फिजी ImageJ का उपयोग करके छवि विश्लेषण के चयनित चरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : UT-SCC-42B तीन अलग matrices में सेल आक्रमण । 3 डी spheroids में SCC सेल आक्रमण के प्रतिनिधि छवियां । तीन दिन तक आक्रमण किया गया और प्रतिलोमित सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करके छवियों को प्रतिदिन लिया गया. (क) एचएमडीएम/फाइफ़िन, (ख) एमएसडीएम, (ग) कोलाजेन । अंतिम स्तंभ दिन 3 आक्रमण के स्पष्टीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टी = २०० μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : HMDM में SCC सेल आक्रमण का परिमाणीकरण/ प्राथमिक स्वरयंत्र UT-SCC-42A और इसी मेटास्टेटिक स्वरयंत्र UT-SCC-42A SCC सेल लाइन आक्रमण ilastik और फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रत्येक triplicate में । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
वीडियो 1: HMDM के भीतर Scc सेल आंदोलन/ कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Discussion
प्रस्तुत विधि एक 3 डी मानव ट्यूमर आधारित परख के लिए मानव ट्यूमर microenvironment नकल उतार मैट्रिक्स के भीतर कैंसर कोशिकाओं की invasiveness का मूल्यांकन प्रदान करता है । कैंसर कोशिका आक्रमण आसानी से एक मानक माइक्रोस्कोप के साथ दैनिक इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके । विधि केवल प्रसार के बजाय कोशिका आक्रमण को दर्शाता है ।
एमएसडीएम के विपरीत, HMDM/फाइफ़िन मैट्रिक्स किसी भी तापमान नियंत्रण की आवश्यकता नहीं है । इस विधि का प्रदर्शन करने के लिए आसान है, विशेष रूप से आवश्यकता के बिना एक थाली से दूसरे करने के लिए spheroids हस्तांतरण करने के लिए । यह केवल एक तकनीकी रूप से संवेदनशील कदम है, मैट्रिक्स को फाइब्रिनोजेन के अलावा । के बाद से फाइनोजेन कुछ मिनट के बाद जेल के लिए शुरू होता है, जोड़ने फाइब्रिनोजेन मजबूत pipetting और एक समय में केवल कुछ कुओं के उपचार की आवश्यकता है । अगर पिपीटिंग हाई ब् लड प्रेशर तरीके से की जाए तो स्लाभ को परेशान करने और उसे यू-आकार के कुएं में अपनी केंद्रीय स्थिति से हिलाने का भी खतरा होता है । गोलाभ की अव्यवस्था इमेजिंग और अंततः विश्लेषण जटिल कर सकते हैं ।
परख HMDM या fibrinogen की एकाग्रता में फेरबदल द्वारा संशोधित किया जा सकता है । कोशिकाओं को भी तय किया जा सकता है और बाद में आणविक अध्ययन के लिए दाग । हालांकि इस विधि को एक पूरी तरह से स्वचालित रूप से संशोधित किया जा सकता है, यह भी एक सामांय खुर्दबीन और दो खुले स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ बाहर किया जा सकता है, महंगा उपकरण के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ ।
पारंपरिक MSDM की तुलना में 3 डी assays आधारित है, इस परख बेहतर सेल आक्रमण संपत्तियों को प्रदर्शित कर सकता है । ऐसे MSDM के रूप में एक तहखाने झिल्ली युक्त laminin-रिच मैट्रिक्स, में उगाया spheroids, वास्तविक आक्रमण से कैंसर की कोशिकाओं के अधिक प्रसार हो सकता है, यह आक्रमण के लिए अनुपयुक्त प्रदान कई कैंसर कोशिका में उनके कम हमलावर क्षमता के कारण लाइनों में assays हैं । एक और अक्सर इस्तेमाल किया मैट्रिक्स, प्रकार मैं कोलेजन, को 3 डी खेती के दौरान किनारों से सिकुड़ जाता है, जो गोलाभ स्थानीयकरण और कुओं की इमेजिंग को प्रभावित करता है । इसके अतिरिक्त, अधिक (HSC-3) और कम (SCC-25) आक्रामक जीभ कार्सिनोमा सेल लाइनों के आंतरिक इनवेसिव गुणों के बीच अंतर मानव ट्यूमर microenvironment मॉडल (myoma डिस्क और इसके घुलनशील रूप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है मैट्रिक्स)10,13।
परख भी MSDM का उपयोग कर के बाद से अधिक नैतिक है HMDM मानव leiomyoma ट्यूमर के बचे हुए सामग्री से निकाला जाता है । वर्तमान में, hmdm ही उपलब्ध मानव ट्यूमर व्युत्पंन ecm उत्पाद है कि कई कैंसर के लिए उपयुक्त प्रतीत होता है में विट्रो assays है8,10। भविष्य में, पशु ऊतक व्युत्पंन matrices मानव ट्यूमर आधारित matrices द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता करने के लिए मैट्रिक्स उत्पादन के लिए पशुओं के बलिदान की जरूरत को कम ।
2 डी कोशिका संस्कृति की जगह 3 डी तरीकों के साथ assays हैं कैंसर सेल व्यवहार पर अधिक सटीक जानकारी प्रदान करता है । वर्तमान में, वहां कई 3D मॉडल और वाणिज्यिक matrices हैं, लेकिन, दुर्भाग्य से, कोई भी सभी कैंसर सेल लाइनों के लिए उपयुक्त हैं । शोधकर्ताओं ने अपने विशेष परख के लिए सबसे उपयुक्त मैट्रिक्स का चयन करना चाहिए । परख और मैट्रिक्स के इष्टतम मिलान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन यह काफी परिणाम की विश्वसनीयता बढ़ा सकता है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक इस अध्ययन के funders धंयवाद: Sigrid Jusélius फाउंडेशन, फिनलैंड के कैंसर सोसायटी, और हेलसिंकी विश्वविद्यालय के केंद्रीय अस्पताल अनुसंधान कोष । लेखकों तकनीकी मदद के लिए हेलसिंकी विश्वविद्यालय में Biomedicum इमेजिंग इकाई स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
- Jung, H., et al. Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo. Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).
- Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport. Nature Communications. 4, 2718 (2013).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).
- Salo, T., et al. A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies. BMC Cancer. 15, 981 (2015).
- Nurmenniemi, S., et al. A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment. The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).
- Salo, T., et al. Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).
- Overall, C. M., Blobel, C. P. In search of partners: linking extracellular proteases to substrates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).
- Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).
- Hoornstra, D., et al. Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin. In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).
