Tumör mikromiljö är en viktig del av cancer tillväxt och invasion. För att efterlikna carcinom progression, behövs en biologiskt relevant mänsklig matris. Detta protokoll introducerar en förbättring för in vitro tredimensionell sfäroid invasion assay genom att tillämpa en mänsklig leiomyoma-baserad matris. Protokollet introducerar också en datorbaserad cell invasion analys.
Två-dimensionell cell kultur-baserade analyser används ofta i in vitro-cancer forskning. Men de saknar flera grundläggande element som bildar tumören mikromiljö. För att få mer pålitliga in vitro-resultat har flera tredimensionella (3D) cell odlings analyser införts. Dessa analyser gör det möjligt för cancer celler att interagera med den extracellulära matrisen. Denna interaktion påverkar cellernas beteende, såsom proliferation och invasion, samt Cellmorfologi. Dessutom kan denna interaktion inducera eller undertrycka uttrycket av flera Pro-och anti-tumorigenic molekyler. Spheroid invasion test utvecklades för att ge en lämplig 3D in vitro-metod för att studera cancer cell invasion. För närvarande, djur-härledda matriser, såsom mus sarkom-derived Matrix (MSDM) och råtta svans typ I kollagen, används främst i sfäroid invasion analyser. Med hänsyn till skillnaderna mellan den mänskliga tumören mikromiljö och djur-härledda matriser, en mänsklig myom-derived Matrix (hmdm) utvecklades från godartad livmoder leiomyom vävnad. Det har visats att HMDM inducerar migration och invasion av cancer celler bättre än MSDM. Detta protokoll gav en enkel, reproducerbar och pålitlig 3D mänskliga tumör-baserade sfäroid invasion assay med hmdm/fibrin matris. Den innehåller också detaljerade anvisningar om avbildning och analys. Sfäroiderna växer i en U-formad Ultra-Low fästplatta i HMDM/fibrin matris och invadera genom den. Invasionen är dagligen avbildad, mätt, och analyseras med hjälp av ilastik och Fiji ImageJ program vara. Analysen plattform visades med hjälp av mänskliga larynx primära och metastaserande skivepitelcancer cellkarcinom cell. Emellertid, protokollet är lämplig även för andra solida cancer cellinjer.
Konventionella tvådimensionella (2D) cell kulturer studier har avsevärt bidragit till cancer forskning. För närvarande är forskare skiftande mer mot tredimensionell (3D) cell kultur analyser för att bättre efterlikna in vivo villkor1. 3D cancer cell kulturen mer exakt återspeglar den komplexa tumören mikromiljö i form av cell-cell och cell-matris interaktioner, gen uttrycks profiler, läkemedels känslighet, och signalering utbildningsavsnitt aktivitet2,3.
Flera 3D cell kultur modeller används i cancer forskning såsom tumör vävnad explant, tumör på ett chip, och multicellulär tumör sfäroider3,4. Multicellulär tumör sfäroider används nu i stor utsträckning, eftersom de härma flera funktioner i in vivo villkor i mänskliga tumörer1,5. När sfäroiden diametern är större än 500 μm, har den även hypoxiska regioner och en nekrotisk centrerar och att föreställa thus in-vivo tumorläget2.
Många syntetiska (t. ex. Polydimetylsiloxan) och djur-härledda (t. ex., råtta svans typ I kollagen och mus sarkom-derived Matrix, matrigel, kallad MSDM) matriser har utvecklats för 3D cell Culture analyser3,6, 7,8. Hittills har ingen av de kommersiellt tillgängliga matriserna härstammar från mänsklig tumör vävnad. Därför, de saknar funktioner i den mänskliga tumören mikromiljö, som har betydande effekter på cancer cell invasion processer8.
Myogel (Human myom-derived matris, kallad hmdm) utvinns ur människans livmoder leiomyom tumör vävnad9. Det har visats att proteinhalten i HMDM skiljer sig markant från MSDM: s. Faktum är att 66% av HMDM-proteiner skiljer sig från MSDM-proteiner. Å andra sidan, vissa proteiner, såsom laminin, typ IV kollagen, heparansulfater sulfat proteoglycans, nidogen, och Epidermal tillväxtfaktor, finns i båda matriserna10. Dessutom skiljer sig musen från den mänskliga i enzym innehåll, med människor som har 78 färre proteaser än möss11.
Fibrin har använts i stor utsträckning ensamt eller i kombination med andra material som en byggnads ställning12. I 3D cell kultur analyser, är kommersiellt tillgängliga humant fibrinogen och trombin kombineras för att bilda en fibrin hydrogel12.
Detta protokoll beskriver en förbättring av den tidigare införda 3D-tumör sfäroid invasion test7. Detta nya protokoll gäller mänskliga tumör-derived matris i stället för mus-härledda tumör matris. Det innebär också Imaging och analys tekniker med hjälp av ilastik och Fiji ImageJ program vara. Detta protokoll kan användas för sfäroiden assay av flera olika solida cancer cellinjer. Det erbjuder ett biologiskt relevant verktyg för att utveckla nya anti-cancer terapier och att studera effekterna av specifika molekyler på cancer cell invasion.
Den presenterade metoden ger en 3D mänsklig tumör-baserad analys för att utvärdera invasivitet av cancer celler inom mänsklig tumör mikromiljö härma matris. Cancer cell invasion kan lätt mätas genom daglig avbildning med en standard Mikroskop och med hjälp av bild analys program. Metoden visar cell invasion snarare än bara spridning.
Till skillnad från MSDM kräver inte HMDM/fibrin-matrisen någon temperatur kontroll. Denna metod är lätt att utföra, i synnerhet utan att behöva överföra sfäroiderna från en platta till en annan. Det har endast ett tekniskt känsligt kliver, tillsatsen av fibrinogen till matrisen. Eftersom fibrinogen börjar gel efter några minuter kräver fibrinogen en robust pipettering och behandling av endast ett fåtal brunnar i taget. Det finns också en risk att störa sfäroiden och flytta den från sitt centrala läge i den U-formade brunnen om pipettering sker på ett högtrycks sätt. Dislocation av sfäroiden kan komplicera avbildning och så småningom analysen.
Analysen kan modifieras genom att koncentrationen av HMDM eller fibrinogen förändras. Cellerna kan också fixeras och färgas för efterföljande molekyl ära studier. Även om denna metod kan modifieras till en helt automatiserad form, kan den också utföras med ett normalt Mikroskop och två program med öppen källkod, utan behov av dyr utrustning.
Jämfört med den traditionella MSDM-baserade 3D-analyser, kan denna analys Visa bättre cell invasion egenskaper. Sfäroider odlas i en källare membran-innehållande laminin-rik matris, såsom MSDM, kan ha mer spridning av cancer celler än faktisk invasion, vilket gör det olämpligt för invasion analyser i flera cancer cellinjer på grund av deras låga invaderande kapacitet. En annan ofta använd matris, typ I kollagen, tenderar att krympa från kanterna under 3D-odling, vilket påverkar sfäroid lokalisering och avbildning av brunnarna. Dessutom, skillnaderna mellan de inneboende invasiva egenskaperna hos de mer (HSC-3) och mindre (SCC-25) aggressiva tungan carcinom cellinjer har visats med hjälp av mänsklig tumör mikromiljö imitera modeller (myoma skivor och dess lösliga form matris)10,13.
Analysen är också mer etiskt än att använda MSDM eftersom hmdm utvinns ur överblivna material av mänsklig leiomyom tumör. För närvarande är hmdm den enda tillgängliga humana tumörhärledda ECM-produkt som verkar vara lämplig för många cancerrelaterade in vitro-analyser8,10. I framtiden kan djur vävnad härledda matriser ersättas med mänskliga tumörbaserade matriser för att minska behovet av att offra djur för mat ris produktion.
Byta 2D cell kultur analyser med 3D-metoder ger mer exakt information om cancer cell beteende. För närvarande finns det flera 3D-modeller och kommersiella matriser, men tyvärr, ingen är lämpliga för alla cancer cellinjer. Forskarna bör välja den lämpligaste matrisen för deras specifika analys. Optimal matchning av analys och matris kan vara utmanande, men det kan avsevärt öka tillförlitligheten i resultaten.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar finansiär av denna studie: Sigrid Jusélius stiftelse, cancer sällskapet i Finland och forsknings fonderna vid Helsingfors universitets central sjukhus. Författarna erkänner Biomedicincum Imaging Unit vid Helsingfors universitet för teknisk hjälp.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |