Summary
El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.
Abstract
Los ensayos basados en cultivos celulares bidimensionales se utilizan comúnmente en la investigación del cáncer in vitro. Sin embargo, carecen de varios elementos básicos que forman el microambiente tumoral. Para obtener resultados in vitro más fiables, se han introducido varios ensayos de cultivo celular tridimensionales (3D). Estos ensayos permiten que las células cancerosas interactúen con la matriz extracelular. Esta interacción afecta el comportamiento de las células, como la proliferación y la invasión, así como la morfología celular. Además, esta interacción podría inducir o suprimir la expresión de varias moléculas Pro y anti-tumorigénicas. El ensayo de invasión esferoide fue desarrollado para proporcionar un método 3D in vitro adecuado para estudiar la invasión de células cancerosas. Actualmente, las matrices derivadas de animales, como la matriz derivada de sarcoma de ratón (MSDM) y el colágeno tipo I de cola de rata, se utilizan principalmente en los ensayos de invasión esferoide. Teniendo en cuenta las diferencias entre el microambiente tumoral humano y las matrices derivadas de animales, se desarrolló una matriz humana derivada de mioma (HMDM) a partir del tejido del Leiomioma uterino benigno. Se ha demostrado que la HMDM induce la migración y la invasión de células de carcinoma mejor que MSDM. Este protocolo proporcionó un ensayo de invasión esferoide basado en un tumor humano en 3D simple, reproducible y confiable usando la matriz HMDM/fibrina. También incluye instrucciones detalladas sobre imágenes y análisis. Las esferoides crecen en una placa de fijación ultra baja en forma de U dentro de la matriz HMDM/fibrina e invaden a través de ella. La invasión es a diario imaged, medido, y analizado utilizando ilastik y Fiji ImageJ software. La plataforma de ensayo se demostró utilizando líneas celulares de carcinoma de células escamosas primarias y metastásicas de la laringe humana. Sin embargo, el protocolo es adecuado también para otras líneas celulares de cáncer sólido.
Introduction
Los estudios de cultivos celulares bidimensionales convencionales (2D) han contribuido considerablemente a la investigación del cáncer. Actualmente, los investigadores están cambiando más hacia los ensayos de cultivo celular tridimensionales (3D) para imitar mejor las condiciones in vivo1. La cultura celular del cáncer 3D refleja con mayor precisión el complejo microambiente tumoral en términos de interacciones de células celulares y matrices celulares, perfiles de expresión génica, sensibilidad a los fármacos y actividad de vías de señalización2,3.
Varios modelos de cultivo celular en 3D se utilizan en la investigación del cáncer como el explant de tejido tumoral, el tumor en un chip y los esferoides multicelulares del tumor3,4. Los esferoides multicelulares son ahora ampliamente utilizados, ya que imitan varias características de las condiciones in vivo en los tumores humanos1,5. Cuando el diámetro esferoide es superior a 500 μm, incluso tiene regiones hipoxicas y un centro necrótico, representando así la situación tumoral in vivo2.
Se han desarrollado matrices de muchos sintéticos (p. ej., polidimetilsiloxano) y derivados de animales (p. ej., matriz derivada de colágeno de rata de cola tipo I y de sarcoma de ratón, Matrigel, denominados msdm) para ensayos de cultivos celulares 3D de3,6, 7,8. Hasta el momento, ninguna de las matrices comercialmente disponibles se originó a partir de tejido tumoral humano. Por lo tanto, carecen de las características del microambiente tumoral humano, que tiene efectos significativos en los procesos de invasión de células cancerosas8.
Myogel (matriz derivada de mioma humana, conocida como hmdm) se extrae del útero humano Leiomioma tejido tumoral9. Se ha demostrado que el contenido de proteína de HMDM difiere significativamente de la de MSDM. De hecho, el 66% de las proteínas HMDM son diferentes de las proteínas MSDM. Por otro lado, algunas proteínas, como la laminin, el colágeno tipo IV, los proteoglicanos de sulfato de heparán, el Nidogen y el factor de crecimiento epidérmico, están presentes en ambas matrices10. Además, el ratón difiere del humano en el contenido de la enzima, con los seres humanos que tienen 78 menos proteasas que los ratones11.
La fibrina se ha utilizado ampliamente solo o en combinación con otros materiales como material de andamio12. En los ensayos de cultivo celular en 3D, el fibrinógeno y la trombina humana disponibles comercialmente se combinan para formar un hidrogel de fibrina12.
Este protocolo describe una mejora del ensayo de invasión de esferoide tumoral 3D previamente introducido7. Este nuevo protocolo aplica la matriz humana derivada de tumor en lugar de la matriz tumoral derivada del ratón. También involucra técnicas de diagnóstico por imágenes y análisis utilizando el software ilastik y Fiji ImageJ. Este protocolo podría ser utilizado para el ensayo esferoide de varias líneas celulares de cáncer sólido diferentes. Ofrece una herramienta biológicamente relevante para desarrollar nuevas terapias contra el cáncer y para estudiar los efectos de moléculas específicas en la invasión de células cancerosas.
Protocol
1. generación de esferoides tumorales multicelulares
Nota: El protocolo se demuestra aquí con las líneas celulares UT-SCC-42A y-42B, pero también se puede aplicar utilizando otras líneas celulares.
- Lave las células UT-SCC-42A y-42B con 6 mL de solución salina amortiguada por fosfato (PBS), añada 0,05% tripsina-EDTA (3 mL para 75 cm2 matraz) y coloque el matraz en una incubadora de cultivos celulares (37 ° c, 5% Co2, 95% de humedad) durante 2-5 min.
- Compruebe que las células se han desprendido bajo un microscopio. Luego agregue el medio de águila modificada de Dulbecco completo (DMEM) media (DMEM + 10% suero bovino fetal, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B, 0,4 μg/mL de hidrocortisona, y 50 μg/mL de ácido ascórbico) para neutralizar la enzima (6 mL para 75 cm 2 matraz) y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
Nota: seleccione el medio de cultivo celular que se adapte a las celdas que se estudian. - Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y suspenda el pellet de células en 2-5 mL de DMEM completo.
- Contar las células y diluir la suspensión celular con DMEM completa a una concentración final de 20.000 células/mL.
Nota: Se debe determinar el recuento óptimo de celdas para cada línea celular. - Dispense 50 μL de la suspensión de la célula en cada accesorio ultra-bajo 96-placa inferior bien redonda bien para una concentración final de 1.000 células por pozo.
- Transfiera la placa a la incubadora de cultivos celulares (37 ° c, 5% CO2, 95% humedad). Cuatro días después, confirme visualmente la formación de esferoide tumoral con un microscopio invertido y proceda con el ensayo. Asegúrese de que sólo hay un esferoide por pozo.
Nota: El tiempo que se toma para formar un esferoide varía entre diferentes líneas celulares.
2. ensayo de invasión de esferoide tridimensional
Nota: Prepare la solución 2x porque el gel se diluye 1:1 cuando se agrega a los pozos.
- Thaw HMDM sobre hielo y solución de fibrinógeno en un baño de agua mantenido a 37 ° c. No molestar al fibrinógeno hasta que esté completamente solubilizado y no ponga la solución sobre hielo; precipitación ocurrirá.
- Mezclar el volumen adecuado de cada reactivo: 1 mg/mL de HMDM (concentración final: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL de trombina (concentración final: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL de aprotinina (concentración final: 33,3 UG/mL) y 1 mg/mL de fibrinógeno (concentración final: 0,5 mg/mL ).
Nota: Añadir fibrinógeno justo antes de dispensar la mezcla en los pozos y trabajar rápidamente; formará un gel en pocos minutos. Trate sólo unos pocos pozos a la vez. - Añadir 50 μL del gel en cada pozo. Dirija la punta hacia la pared interior del pozo y Pipet lentamente. Evite las burbujas de aire (utilizando la técnica de pipeteo inverso) e intente no mover el esferoide desde el centro del pozo.
- Devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares y permita que la matriz de HMDM/fibrina se solidifique durante 30 minutos, y agregue suavemente 100 μL de DMEM completo a cada pozo en la parte superior del gel.
3. imágenes
- Imagen de los esferoides diariamente utilizando un microscopio de luz invertida. Alternativamente, utilice sistemas automáticos de imágenes.
4. segmentación de imágenes con Ilastik
- Abra ilastik y seleccione flujo de trabajo de clasificación de píxeles (figura 1A). Clasifica los píxeles en función de las anotaciones realizadas por el usuario. Guarde el proyecto ilastik (. ILP) en el equipo.
- Añadir imágenes para análisis. Haga clic en datos de entrada y agregue nuevo y, a continuación, elija imágenes (figura 1B).
-
Para la selección de operaciones, haga clic en selección de entidades y seleccionar entidades (figura 1C, rectángulo rojo).
Nota: las entidades seleccionadas deben corresponder aproximadamente a las propiedades visuales que separan los objetos del fondo, y se usarán para entrenar el clasificador.- Seleccione las entidades haciendo clic en las casillas. Los cuadros seleccionados se vuelven de color verde (figura 1C, rectángulo azul).
Nota: Aquí el usuario puede seleccionar entre varios tipos de funciones y escalas diferentes. Se debe seleccionar color/intensidad para separar los objetos en función del color o el brillo. Edge debe seleccionarse para separar objetos según el brillo o los degradados de color. La textura es una característica importante si los objetos de la imagen tienen una apariencia texturales especial. Para este ensayo, se utilizan color/intensidad (Sigma 0) y Edge (Sigma 6).
- Seleccione las entidades haciendo clic en las casillas. Los cuadros seleccionados se vuelven de color verde (figura 1C, rectángulo azul).
-
Para entrenar, haga clic en formación y en la sección formación hay dos etiquetas: etiqueta 1 y etiqueta 2 (figura 1D, rectángulo rojo). Si solo hay una etiqueta, agregue una nueva etiqueta presionando agregar etiqueta (figura 1D, rectángulo azul).
- Marque el fondo con una de las etiquetas (figura 1d, amarillo) y las celdas con la otra etiqueta (figura 1d, azul).
- Entrena el software para el primer 10% de las imágenes. Elija la siguiente imagen de la vista actual.
- Después de que las celdas y el fondo estén marcados (de la primera imagen), presione Live Update (figura 1D, rectángulo púrpura).
Nota: con la siguiente imagen, ilastik realizará automáticamente el análisis de acuerdo con las imágenes anteriores.
- Después de que el entrenamiento se realiza y ilastik ha analizado todas las imágenes, haga clic en predicción de exportación. Elija segmentación simple de origen; No elija probabilidades ni nada más (figura 1E).
- Elija el formato de archivo de salida deseado en elegir exportar configuración de imagen... en la sección predicción de exportación (figura 1E). Exporte los resultados del etiquetado haciendo clic en exportar todo (figura 1F). Los archivos se exportarán a la misma carpeta con las imágenes originales.
Nota: en este experimento, se utiliza el formato. H5.
5. Análisis de área con Fiji ImageJ
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Ajuste de escala
- Abra la imagen original con una barra de escala en Fiji ImageJ (figura 2a). Asegúrese de que la imagen tenga el mismo tamaño y dimensión que las imágenes analizadas. Utilice la herramienta Selección de líneas para dibujar una línea de una longitud conocida (figura 2B).
Nota: Este protocolo se ejecuta utilizando Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) e ilastik-1.3.2 RC. - Haga clic en analizar y establecer escala (figura 2C). Fije la distancia conocida en el campo de la distancia conocida y fije la unidad apropiada y haga clic global (figura 2D).
- Abra la imagen original con una barra de escala en Fiji ImageJ (figura 2a). Asegúrese de que la imagen tenga el mismo tamaño y dimensión que las imágenes analizadas. Utilice la herramienta Selección de líneas para dibujar una línea de una longitud conocida (figura 2B).
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La instalación de la macro
- Si un plugin ilastik no está instalado, siga estos pasos: haga clic en ayuda, Actualizar.... En la ventana abierta ImageJ Updater, haga clic en administrar sitios de actualización. En la ventana abierta administrar sitios de actualización, haga clic en siguiente a ilastik y, a continuación, haga clic en cerrar. A continuación, haga clic en aplicar cambios en la ventana actualizador ImageJ. Este proceso puede tardar algún tiempo. La siguiente ventana será información con el texto actualizado con éxito. Haga clic en Aceptar y reinicie ImageJ.
- Haga clic en plugins, macrose instalar (figura 3A). A continuación, elija el archivo Counter. IJM (consulte información complementaria) y haga clic en abrir.
Nota: La macro fue escrita especialmente para medir el área. La macro debe instalarse cada vez que se abre el software.
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Análisis de área
- Analice las imágenes cuando se instalen todos los plugins. Haga clic en plugins y desplácese hacia abajo hasta ilastik (figura 3C). Elija Import HDF5, elija el archivo con formato. H5, haga clic en abrir y cargue y aplique LUT (figura 3C, D).
- Pulse el botón a del teclado (macro) y el área aparecerá en la ventana de Resumen como área total (figura 3E).
Representative Results
Cuatro días después de la siembra de células UT-SCC-42B (línea celular de la laringe metastásica), la matriz (HMDM/fibrina, MSDM o colágeno) se añadió en los esferoides formados (día 0) y la invasión fue monitoreada durante tres días. Las imágenes aquí se obtuvieron diariamente usando un microscopio invertido (figura 4).
Una vez incrustadas, las células de la matriz de HMDM/fibrina empezaron a invadir rápidamente después de un día y se extendieron a la matriz (figura 4A). Las celdas en el MSDM no invadió la matriz circundante, en su lugar formando una estructura asimétrica (figura 4B). Por otro lado, las células del colágeno invadieron ligeramente, pero debido a la contracción de la matriz, el análisis fue difícil (figura 4C). En algunos pozos de colágeno, las esferoides incluso desaparecieron después de tres días (figura 4C).
La figura 5 ilustra la cuantificación de la invasión celular en hmdm/fibrina de la línea primaria de células de la laringe SCC UT-SCC-42A y la correspondiente línea celular metastásica UT-SCC-42B. El video (película 1) tomado usando un sistema de análisis de células vivas del esferoide hmdm/fibrn muestra el movimiento de las células SCC dentro de la matriz donde forman hebras seguidas por las otras células.
Figura 1 : Segmentación de imágenes. Pasos seleccionados de segmentación de imágenes mediante ilastik. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ajuste de escala. Pasos seleccionados de ajuste de escala utilizando Fiji ImageJ. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de invasiones utilizando ImageJ. Pasos seleccionados de análisis de imagen utilizando Fiji ImageJ. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : La invasión de células UT-SCC-42B en tres matrices diferentes. Imágenes representativas de la invasión de células SCC en las esferoides 3D. La invasión fue seguida durante tres días y las imágenes fueron tomadas diariamente usando un microscopio invertido. (A) hmdm/fibrina, (B) msdm, (C) colágeno. La última columna representa la aclaración de la invasión del día 3. Barra de escala = 200 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Cuantificación de la invasión de células SCC en HMDM/fibrina. Se analizó el laríngeo primario UT-SCC-42A y la correspondiente invasión de la línea celular de la laringe del metastásico UT-SCC-42B SCC utilizando el software ilastik y Fiji ImageJ. Los resultados representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, cada uno por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: SCC movimiento de células dentro de la HMDM/fibrina durante tres días. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Discussion
El método presentado proporciona un ensayo basado en un tumor humano en 3D para evaluar la invasividad de las células cancerosas dentro del microentorno tumoral humano imitando la matriz. La invasión de células cancerosas se puede medir fácilmente por imágenes diarias con un microscopio estándar y mediante el uso de software de análisis de imágenes. El método demuestra la invasión celular en lugar de la mera proliferación.
A diferencia de MSDM, la matriz HMDM/fibrn no requiere ningún control de temperatura. Este método es fácil de llevar a cabo, en particular, sin la necesidad de transferir los esferoides de una placa a otra. Tiene sólo un paso técnicamente sensible, la adición de fibrinógeno a la matriz. Dado que el fibrinógeno comienza a gel después de unos minutos, la adición de fibrinógeno requiere un pipeteo robusto y un tratamiento de solo unos pocos pozos a la vez. También existe el riesgo de perturbar el esferoide y de desplazarlo desde su posición central en el pozo en forma de U si el pipeteo se realiza en una forma de alta presión. La luxación del esferoide puede complicar la imagen y eventualmente el análisis.
El ensayo puede modificarse alterando la concentración de HMDM o fibrinógeno. Las células también pueden ser fijas y teñidas para estudios moleculares posteriores. A pesar de que este método se puede modificar a una forma totalmente automatizada, también se puede llevar a cabo con un microscopio normal y dos software de código abierto, sin necesidad de costosos equipos.
Comparado con los tradicionales ensayos 3D basados en MSDM, este ensayo podría mostrar mejor las propiedades de invasión celular. Los esferoides cultivados en una matriz rica en laminados que contienen membrana en el sótano, como MSDM, podrían tener más proliferación de células cancerosas que la invasión real, lo que lo hace inadecuado para los ensayos de invasión en varias líneas celulares de cáncer debido a su baja capacidad invasora. Otra matriz de uso frecuente, colágeno tipo I, tiende a encogerse desde los bordes durante el cultivo en 3D, que afecta la localización esferoide y la imagen de los pozos. Adicionalmente, las diferencias entre las propiedades invasivas intrínsecas de las líneas celulares de carcinoma de lengua agresiva (HSC-3) y menos (SCC-25) se han demostrado utilizando modelos de microentorno tumoral humano imitando (los discos de mioma y su forma soluble Matrix)10,13.
El ensayo también es más ético que el uso de MSDM ya que el HMDM se extrae del material sobrante del tumor de Leiomioma humano. Actualmente, hmdm es el único producto de ECM derivado del tumor humano disponible que parece ser adecuado para muchos ensayos in vitro relacionados con el cáncer8,10. En el futuro, las matrices derivadas de tejido animal podrían reemplazarse por matrices basadas en tumores humanos para reducir la necesidad de sacrificar animales para la producción de matrices.
Reemplazar los ensayos de cultivos celulares 2D con métodos 3D proporciona información más precisa sobre el comportamiento de las células cancerosas. Actualmente, hay varios modelos 3D y matrices comerciales, pero, desafortunadamente, ninguno es adecuado para todas las líneas celulares de cáncer. Los investigadores deben seleccionar la matriz más adecuada para su ensayo en particular. La coincidencia óptima de ensayo y matriz puede ser desafiante, pero podría aumentar significativamente la confiabilidad de los resultados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los financiadores de este estudio: la Fundación Sigrid Jusélius, la sociedad del cáncer de Finlandia y los fondos de investigación del hospital central de la Universidad de Helsinki. Los autores reconocen la unidad de imagen Biomedicum en la Universidad de Helsinki para obtener ayuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
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