Summary
Tumör mikromiljö är en viktig del av cancer tillväxt och invasion. För att efterlikna carcinom progression, behövs en biologiskt relevant mänsklig matris. Detta protokoll introducerar en förbättring för in vitro tredimensionell sfäroid invasion assay genom att tillämpa en mänsklig leiomyoma-baserad matris. Protokollet introducerar också en datorbaserad cell invasion analys.
Abstract
Två-dimensionell cell kultur-baserade analyser används ofta i in vitro-cancer forskning. Men de saknar flera grundläggande element som bildar tumören mikromiljö. För att få mer pålitliga in vitro-resultat har flera tredimensionella (3D) cell odlings analyser införts. Dessa analyser gör det möjligt för cancer celler att interagera med den extracellulära matrisen. Denna interaktion påverkar cellernas beteende, såsom proliferation och invasion, samt Cellmorfologi. Dessutom kan denna interaktion inducera eller undertrycka uttrycket av flera Pro-och anti-tumorigenic molekyler. Spheroid invasion test utvecklades för att ge en lämplig 3D in vitro-metod för att studera cancer cell invasion. För närvarande, djur-härledda matriser, såsom mus sarkom-derived Matrix (MSDM) och råtta svans typ I kollagen, används främst i sfäroid invasion analyser. Med hänsyn till skillnaderna mellan den mänskliga tumören mikromiljö och djur-härledda matriser, en mänsklig myom-derived Matrix (hmdm) utvecklades från godartad livmoder leiomyom vävnad. Det har visats att HMDM inducerar migration och invasion av cancer celler bättre än MSDM. Detta protokoll gav en enkel, reproducerbar och pålitlig 3D mänskliga tumör-baserade sfäroid invasion assay med hmdm/fibrin matris. Den innehåller också detaljerade anvisningar om avbildning och analys. Sfäroiderna växer i en U-formad Ultra-Low fästplatta i HMDM/fibrin matris och invadera genom den. Invasionen är dagligen avbildad, mätt, och analyseras med hjälp av ilastik och Fiji ImageJ program vara. Analysen plattform visades med hjälp av mänskliga larynx primära och metastaserande skivepitelcancer cellkarcinom cell. Emellertid, protokollet är lämplig även för andra solida cancer cellinjer.
Introduction
Konventionella tvådimensionella (2D) cell kulturer studier har avsevärt bidragit till cancer forskning. För närvarande är forskare skiftande mer mot tredimensionell (3D) cell kultur analyser för att bättre efterlikna in vivo villkor1. 3D cancer cell kulturen mer exakt återspeglar den komplexa tumören mikromiljö i form av cell-cell och cell-matris interaktioner, gen uttrycks profiler, läkemedels känslighet, och signalering utbildningsavsnitt aktivitet2,3.
Flera 3D cell kultur modeller används i cancer forskning såsom tumör vävnad explant, tumör på ett chip, och multicellulär tumör sfäroider3,4. Multicellulär tumör sfäroider används nu i stor utsträckning, eftersom de härma flera funktioner i in vivo villkor i mänskliga tumörer1,5. När sfäroiden diametern är större än 500 μm, har den även hypoxiska regioner och en nekrotisk centrerar och att föreställa thus in-vivo tumorläget2.
Många syntetiska (t. ex. Polydimetylsiloxan) och djur-härledda (t. ex., råtta svans typ I kollagen och mus sarkom-derived Matrix, matrigel, kallad MSDM) matriser har utvecklats för 3D cell Culture analyser3,6, 7,8. Hittills har ingen av de kommersiellt tillgängliga matriserna härstammar från mänsklig tumör vävnad. Därför, de saknar funktioner i den mänskliga tumören mikromiljö, som har betydande effekter på cancer cell invasion processer8.
Myogel (Human myom-derived matris, kallad hmdm) utvinns ur människans livmoder leiomyom tumör vävnad9. Det har visats att proteinhalten i HMDM skiljer sig markant från MSDM: s. Faktum är att 66% av HMDM-proteiner skiljer sig från MSDM-proteiner. Å andra sidan, vissa proteiner, såsom laminin, typ IV kollagen, heparansulfater sulfat proteoglycans, nidogen, och Epidermal tillväxtfaktor, finns i båda matriserna10. Dessutom skiljer sig musen från den mänskliga i enzym innehåll, med människor som har 78 färre proteaser än möss11.
Fibrin har använts i stor utsträckning ensamt eller i kombination med andra material som en byggnads ställning12. I 3D cell kultur analyser, är kommersiellt tillgängliga humant fibrinogen och trombin kombineras för att bilda en fibrin hydrogel12.
Detta protokoll beskriver en förbättring av den tidigare införda 3D-tumör sfäroid invasion test7. Detta nya protokoll gäller mänskliga tumör-derived matris i stället för mus-härledda tumör matris. Det innebär också Imaging och analys tekniker med hjälp av ilastik och Fiji ImageJ program vara. Detta protokoll kan användas för sfäroiden assay av flera olika solida cancer cellinjer. Det erbjuder ett biologiskt relevant verktyg för att utveckla nya anti-cancer terapier och att studera effekterna av specifika molekyler på cancer cell invasion.
Protocol
1. generering av multicellulär tumör Sfäroider
Anmärkning: Protokollet visas här med cell linjerna UT-SCC-42A och-42B, men det kan också användas med andra cellinjer.
- Tvätta cellerna UT-SCC-42A och-42B med 6 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 0,05% trypsin-EDTA (3 mL för 75 cm2 kolv) och Placera kolven i en cell kultur inkubator (37 ° c, 5% co2, 95% fuktighet) för 2-5 min.
- Kontrol lera att cellerna har lossnat under ett Mikroskop. Tillsätt sedan komplett Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) media (DMEM + 10% Foster bovint serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 250 ng/mL amfotericin B, 0,4 μg/mL Hydro kortison och 50 μg/mL askor bin syra) för att neutralisera enzymet (6 mL för 75 cm 2 -kolven) och överför cell SUS pensionen till ett 15 ml koniskt rör.
Obs: Välj det cell odlings medium som passar de celler som studeras. - Centrifugera cell SUS pensionen vid 200 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 2-5 mL komplett DMEM.
- Räkna cellerna och späd cell SUS pensionen med fullständig DMEM till en slutlig koncentration av 20 000 celler/mL.
Anmärkning: Optimalt cell antal måste bestämmas för varje cellrad. - Fördela 50 μL av cell SUS pensionen i varje ultra-låg infästning 96-väl rund botten platta väl för en slutlig koncentration av 1 000 celler per brunn.
- Överför plattan till cell kulturens inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% luft fuktighet). Fyra dagar senare, visuellt bekräfta tumör sfäroid bildning med en inverterad Mikroskop och fortsätt med analysen. Se till att det bara finns en sfäroid per brunn.
Anmärkning: Den tid det tar att bilda en sfäroid varierar mellan olika cellinjer.
2. tredimensionell sfäroid invasion assay
Anmärkning: Förbered 2x lösning eftersom gelen kommer att spädas 1:1 när de tillsätts i brunnarna.
- Tina HMDM på is och Fibrinogen stam lösning i ett vatten bad som hålls vid 37 ° c. Stör inte fibrinogenen förrän det är helt solubilized och inte sätta lösningen på isen; nederbörd kommer att inträffa.
- Blanda ihop lämplig volym av varje reagens: 1 mg/mL HMDM (slutlig koncentration: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL trombin (slutlig koncentration: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (slut koncentration: 33,3 UG/mL) och 1 mg/mL fibrinogen (slutlig koncentration: 0,5 mg/mL ).
Anmärkning: Tillsätt fibrinogen strax före dispensering blandningen i brunnarna och arbeta snabbt; Det kommer att bilda en gel i några minuter. Behandla bara några brunnar i taget. - Tillsätt 50 μL av gelen i varje brunn. Rikta spetsen mot insidan av brunnen och Pipettera långsamt. Undvik luft bubblor (med omvänd pipettering teknik) och försök att inte flytta sfäroiden från mitten av brunnen.
- Returnera plattan tillbaka till cell kulturen inkubator och låta HMDM/fibrin matris för att stelna i 30 min, och försiktigt Tillsätt 100 μL komplett DMEM i varje brunn ovanpå gelen.
3. avbildning
- Avbilda sfäroiderna dagligen med ett inverterat ljus Mikroskop. Alternativt kan du använda automatiska avbildnings system.
4. bild segmentering med Ilastik
- Öppna ilastik och välj pixel klassificerings arbets flöde (figur 1a). Den klassificerar pixlarna baserat på annoteringar som gjorts av användaren. Spara ilastik projekt (. ILP) till datorn.
- Lägg till bilder för analyser. Klicka på ingångs information och Lägg till ny och välj sedan bilder (bild 1B).
-
För val av funktioner, klicka på funktions val och välj funktioner (figur 1C, röd rektangel).
Anmärkning: de valda funktionerna bör ungefär motsvara de visuella egenskaper som separerar objekten från bakgrunden, och de kommer att användas för att utbilda klassificeraren.- Välj funktioner genom att klicka på rutorna. De markerade rutorna blir gröna (bild 1C, blå rektangel).
Anmärkning: Här kan användaren välja mellan flera olika funktions typer och skalor. Färg/intensitet ska väljas för att separera objekt baserat på färg eller ljus styrka. Kant bör väljas för att separera objekt baserat på ljus styrka eller färg övertoningar. Textur är en viktig funktion om objekten i bilden har en speciell textur utseende. För denna analys, färg/intensitet (Sigma 0) och Edge (Sigma 6) används.
- Välj funktioner genom att klicka på rutorna. De markerade rutorna blir gröna (bild 1C, blå rektangel).
-
För träning, klicka på träning och i sektionen träning finns två etiketter: etikett 1 och etikett 2 (figur 1D, röd rektangel). Om det bara finns en etikett lägger du till en ny etikett genom att trycka på Lägg till etikett (bild 1D, blå rektangel).
- Markera bakgrunden med en av etiketterna (figur 1d, gul) och cellerna med den andra etiketten (figur 1d, blå).
- Utbilda program varan för de första 10% av bilderna. Välj nästa bild från Aktuell vy.
- När cellerna och bakgrunden är markerade (av den första bilden) trycker du på Live Update (bild 1D, lila rektangel).
Obs: med nästa bild, kommer ilastik automatiskt utföra analysen enligt de tidigare bilderna.
- Efter träningen är klar och ilastik har analyserat alla bilder, klicka på förutsägelse export. Välj enkel segmentering från Källa; Välj inte sannolikheter eller något annat (bild 1E).
- Välj önskat utdatafilformat från Välj exportera bild inställningar... i avsnittet förutsägelse export (bild 1E). Exportera resultatet av märkningen genom att klicka på exportera alla (bild 1F). Filerna kommer att exporteras till samma mapp med original bilderna.
Anmärkning: i det här experimentet. H5-format används.
5. Area analys med Fiji ImageJ
-
Skala inställning
- Öppna original bilden med ett skalnings fält i Fiji ImageJ (bild 2a). Se till att bilden har samma storlek och dimension som de analyserade bilderna. Använd linje markerings verktyget för att rita en rad med känd längd (bild 2B).
Anmärkning: Detta protokoll körs med hjälp av Fiji ImageJ 1,51 (64-bitars) och ilastik-1.3.2 RC. - Klicka på analysera och Ange skala (bild 2C). Ange det kända avståndet i fältet känt avstånd och Ställ in rätt enhet och klicka på Global (bild 2D).
- Öppna original bilden med ett skalnings fält i Fiji ImageJ (bild 2a). Se till att bilden har samma storlek och dimension som de analyserade bilderna. Använd linje markerings verktyget för att rita en rad med känd längd (bild 2B).
-
Installera makrot
- Om en plugin ilastik inte är installerad, Följ dessa steg: Klicka på Hjälp, Uppdatera.... I det öppna fönstret imagej Updaterklickar du på hantera uppdaterings platser. I det öppna fönstret hantera uppdatera platser, klicka på Nästa till ilastik och klicka sedan på Stäng. Klicka sedan på Verkställ ändringar i fönstret imagej Updater. Den här processen kan ta lite tid. Nästa fönster kommer att vara information med texten uppdateras. Klicka på OK och starta om imagej.
- Klicka på insticksmoduler, makronoch installera (figur 3a). Välj sedan Counter. IJM filen (se kompletterande information) och klicka på Öppna.
Anmärkning: Makrot skrevs speciellt för att mäta området. Makrot ska installeras varje gång program varan öppnas.
-
Områdes analys
- Analysera bilder när alla insticksmoduler är installerade. Klicka på insticksmoduler och Skrolla ner till ilastik (figur 3C). Välj Importera hdf5, välj filen med. H5-format, klicka på Öppna och Läs in och Använd lut (figur 3C, D).
- Tryck på a -knappen från tangent bordet (makrot) så visas området i sammanfattnings fönstret som Total Area (bild 3E).
Representative Results
Fyra dagar efter UT-SCC-42B (metastaserad larynx SCC cell line) cell seedning, matrisen (HMDM/fibrin, MSDM, eller kollagen) lades på bildade sfäroider (dag 0) och invasionen övervakades i tre dagar. Bilder här erhölls dagligen med hjälp av ett inverterat Mikroskop (figur 4).
En gång inbäddad, celler i HMDM/fibrin matrisen började invadera snabbt efter en dag och utvidgas till matrisen (figur 4A). Celler i MSDM invaderar inte i den omgivande matrisen, utan bildar en asymmetrisk struktur (figur 4B). Å andra sidan, celler i kollagen invaderade något, men på grund av matrisen krympning analysen var svårt (figur 4C). I vissa kollagen brunnar, sfäroiderna försvann även efter tre dagar (figur 4C).
Figur 5 illustrerar kvantifieringen av cell invasionen i hmdm/fibrin av den primära larynx SCC cell line ut-SCC-42a och motsvarande metastaserande cellinjen ut-SCC-42b. Videon (film 1) tas med hjälp av en Live-cell analys system av hmdm/fibrin sfäroid visar förflyttning av SCC cellerna i matrisen där de bildar strängar följt av de andra cellerna.
Figur 1 : Bildsegmentering. Valda steg i bildsegmentering med hjälp av ilastik. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Skalnings inställning. Markerade steg för skalnings inställning med Fiji ImageJ. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Invasion analys med hjälp av ImageJ. Utvalda steg i bild analys med Fiji ImageJ. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Ut-SCC-42B cell invasion i tre olika matriser. Representativa bilder av SCC cell invasion i 3D sfäroider. Invasionen följdes i tre dagar och bilder togs dagligen med hjälp av ett inverterat Mikroskop. (A) hmdm/fibrin, (B) MSDM, (C) kollagen. Den sista kolumnen representerar för tydligande av dag 3 invasion. Skalbar = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kvantifiering av SCC-cellinvasion i HMDM/fibrin. Primär larynx ut-SCC-42a och motsvarande metastaserande larynx ut-SCC-42b SCC cell linje invasion analyserades med hjälp av ilastik och Fiji imagej program vara. Resultaten representerar medelvärdet ± standard avvikelsen för tre oberoende experiment, var och en i triplicate. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: SCC cell-förflyttning inom HMDM/fibrin i tre dagar. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
Den presenterade metoden ger en 3D mänsklig tumör-baserad analys för att utvärdera invasivitet av cancer celler inom mänsklig tumör mikromiljö härma matris. Cancer cell invasion kan lätt mätas genom daglig avbildning med en standard Mikroskop och med hjälp av bild analys program. Metoden visar cell invasion snarare än bara spridning.
Till skillnad från MSDM kräver inte HMDM/fibrin-matrisen någon temperatur kontroll. Denna metod är lätt att utföra, i synnerhet utan att behöva överföra sfäroiderna från en platta till en annan. Det har endast ett tekniskt känsligt kliver, tillsatsen av fibrinogen till matrisen. Eftersom fibrinogen börjar gel efter några minuter kräver fibrinogen en robust pipettering och behandling av endast ett fåtal brunnar i taget. Det finns också en risk att störa sfäroiden och flytta den från sitt centrala läge i den U-formade brunnen om pipettering sker på ett högtrycks sätt. Dislocation av sfäroiden kan komplicera avbildning och så småningom analysen.
Analysen kan modifieras genom att koncentrationen av HMDM eller fibrinogen förändras. Cellerna kan också fixeras och färgas för efterföljande molekyl ära studier. Även om denna metod kan modifieras till en helt automatiserad form, kan den också utföras med ett normalt Mikroskop och två program med öppen källkod, utan behov av dyr utrustning.
Jämfört med den traditionella MSDM-baserade 3D-analyser, kan denna analys Visa bättre cell invasion egenskaper. Sfäroider odlas i en källare membran-innehållande laminin-rik matris, såsom MSDM, kan ha mer spridning av cancer celler än faktisk invasion, vilket gör det olämpligt för invasion analyser i flera cancer cellinjer på grund av deras låga invaderande kapacitet. En annan ofta använd matris, typ I kollagen, tenderar att krympa från kanterna under 3D-odling, vilket påverkar sfäroid lokalisering och avbildning av brunnarna. Dessutom, skillnaderna mellan de inneboende invasiva egenskaperna hos de mer (HSC-3) och mindre (SCC-25) aggressiva tungan carcinom cellinjer har visats med hjälp av mänsklig tumör mikromiljö imitera modeller (myoma skivor och dess lösliga form matris)10,13.
Analysen är också mer etiskt än att använda MSDM eftersom hmdm utvinns ur överblivna material av mänsklig leiomyom tumör. För närvarande är hmdm den enda tillgängliga humana tumörhärledda ECM-produkt som verkar vara lämplig för många cancerrelaterade in vitro-analyser8,10. I framtiden kan djur vävnad härledda matriser ersättas med mänskliga tumörbaserade matriser för att minska behovet av att offra djur för mat ris produktion.
Byta 2D cell kultur analyser med 3D-metoder ger mer exakt information om cancer cell beteende. För närvarande finns det flera 3D-modeller och kommersiella matriser, men tyvärr, ingen är lämpliga för alla cancer cellinjer. Forskarna bör välja den lämpligaste matrisen för deras specifika analys. Optimal matchning av analys och matris kan vara utmanande, men det kan avsevärt öka tillförlitligheten i resultaten.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar finansiär av denna studie: Sigrid Jusélius stiftelse, cancer sällskapet i Finland och forsknings fonderna vid Helsingfors universitets central sjukhus. Författarna erkänner Biomedicincum Imaging Unit vid Helsingfors universitet för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
- Jung, H., et al. Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo. Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).
- Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport. Nature Communications. 4, 2718 (2013).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).
- Salo, T., et al. A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies. BMC Cancer. 15, 981 (2015).
- Nurmenniemi, S., et al. A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment. The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).
- Salo, T., et al. Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).
- Overall, C. M., Blobel, C. P. In search of partners: linking extracellular proteases to substrates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).
- Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).
- Hoornstra, D., et al. Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin. In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).
