Summary
O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.
Abstract
Ensaios baseados na cultura de células bidimensionais são comumente usados na pesquisa de câncer in vitro. No entanto, eles não têm vários elementos básicos que formam o microambiente tumoral. Para obter resultados in vitro mais fiáveis, foram introduzidos vários ensaios de cultura de células tridimensionais (3D). Esses ensaios permitem que as células cancerosas interajam com a matriz extracelular. Essa interação afeta o comportamento celular, como proliferação e invasão, bem como a morfologia celular. Adicionalmente, esta interação poderia induzir ou suprimir a expressão de diversas moléculas pró-e anti-tumorigenic. O ensaio da invasão de spheroid foi desenvolvido para fornecer um método 3D in vitro apropriado para estudar a invasão da pilha de cancro. Atualmente, matrizes derivadas de animais, como a matriz derivada do sarcoma do camundongo (MSDM) e o colágeno tipo I da cauda de rato, são usadas principalmente nos ensaios de invasão de esferóide. Tendo em consideração as diferenças entre o microambiente do tumor humano e as matrizes animal-derivadas, uma matriz Myoma-derivada humana (HMDM) foi desenvolvida do tecido benigno do leiomyoma do útero. Demonstrou-se que a HMDM induz a migração e invasão de células de carcinoma melhor do que a MSDM. Este protocolo forneceu um ensaio humano simples, reprodutível, e de confiança da invasão do esferóide do tumor-baseado 3D usando a matriz de hmdm/fibrin. Igualmente inclui instruções detalhadas na imagem latente e na análise. Os esferoides crescem em uma placa de fixação Ultrabaixa em forma de U dentro da matriz HMDM/fibrina e invadem-na. A invasão é imaged diariamente, medido, e analisado usando o software de ilastik e de Fiji ImageJ. A plataforma do ensaio foi demonstrada usando linhas de pilha da carcinoma de pilha Squamous preliminar e metastática humanas da laringe. No entanto, o protocolo é adequado também para outras linhas de células cancerosas sólidas.
Introduction
Estudos de cultura de células bidimensionais convencionais (2D) contribuíram consideravelmente para a pesquisa do câncer. Atualmente, os pesquisadores estão mudando mais para os ensaios de cultura celular tridimensional (3D) para imitar melhor as condições in vivo1. A cultura de células cancerosas 3D reflete com mais precisão o complexo microambiente tumoral em termos de interações célula-célula e célula-matriz, perfis de expressão gênica, sensibilidade a fármacos e atividade de sinalização de vias2,3.
Vários modelos de cultura de células 3D são usados na pesquisa de câncer, como explante de tecido tumoral, tumor em um chip e spheroídeos de tumor multicelular3,4. Os esferóides tumorais multicelulares são agora amplamente utilizados, uma vez que imitam diversas características das condições in vivo em tumores humanos1,5. Quando o diâmetro do esferóide é maior que 500 μm, tem até regiões hipóxicas e um centro necrótico, representando assim a situação tumoral in vivo2.
Muitos sintéticos (por exemplo, polydimethylsiloxane) e animal-derivado (por exemplo, tipo da cauda do rato mim colagénio e matriz sarcoma-derivada do rato, matrigel, referido como msdm) as matrizes foram desenvolvidas para ensaios dacultura de pilha 3D,6, 7,8. Até agora, nenhuma das matrizes comercialmente disponíveis originou do tecido humano do tumor. Portanto, faltam as características do microambiente tumoral humano, que tem efeitos significativos sobre os processos de invasão de células cancerosas8.
Myogel (matriz Myoma-derivada humana, referido como HMDM) é extraído do tecido humano do tumor do leiomyoma do útero9. Demonstrou-se que o teor de proteína do HMDM difere significativamente do MSDM. Na verdade, 66% das proteínas HMDM são diferentes das proteínas MSDM. Por outro lado, algumas proteínas, como laminina, colágeno tipo IV, proteoglicanos de sulfato heparano, nidogênio e fator de crescimento epidérmico, estão presentes em ambas as matrizes10. Adicionalmente, o rato difere do ser humano no índice da enzima, com os seres humanos que têm 78 menos proteases do que ratos11.
A fibrina tem sido amplamente utilizada isoladamente ou em combinação com outros materiais como material de andaime12. Em ensaios de cultura de células 3D, o fibrinogênio humano disponível comercialmente e a trombina são combinados para formar um hidrogel de fibrina12.
Este protocolo descreve uma melhoria do ensaio previamente introduzido da invasão do esferóide do tumor 3D7. Este protocolo novo aplica a matriz tumor-derivada humana em vez da matriz rato-derivada do tumor. Ele também envolve técnicas de imagem e análise usando ilastik e software Fiji ImageJ. Este protocolo poderia ser usado para o ensaio do esferóide de diversas linhas de pilha contínuas diferentes do cancro. Ele oferece uma ferramenta biologicamente relevante para desenvolver novas terapias anticancerígenas e estudar os efeitos de moléculas específicas na invasão de células cancerosas.
Protocol
1. geração de esferóides tumorais multicelulares
Nota: O protocolo é demonstrado aqui com linhas de célula UT-SCC-42A e-42B, mas também pode ser aplicado usando outras linhas de célula.
- Lave as células UT-SCC-42A e-42B com 6 mL de soro fisiológico tampão fosfato (PBS), adicione 0, 5% de tripsina-EDTA (3 mL para 75 cm2 balão) e coloque o balão numa incubadora de cultura celular (37 ° c, 5% co2, 95% humidade) durante 2-5 min.
- Verifique se as células se destacaram um microscópio. Em seguida, adicione o meio da águia modificada de Dulbecco (DMEM) (DMEM + 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B, 0,4 μg/mL de hidrocortisona e 50 μg/mL de ácido ascórbico) para neutralizar a enzima 2 frascos) e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 ml.
Observação: selecione o meio de cultura de célula que se adapte às células que estão sendo estudadas. - Centrifugue a suspensão celular em 200 x g por 5 min.
- Retire o sobrenadante e suspenda o pellet celular em 2-5 mL de DMEM completo.
- Conte as células e diluir a suspensão celular com DMEM completa para uma concentração final de 20.000 células/mL.
Nota: A contagem de células ideal deve ser determinada para cada linha celular. - Dispense 50 μL da suspensão celular em cada placa de fundo de fixação ultra baixa 96 bem para uma concentração final de 1.000 células por poço.
- Transfira a placa para a incubadora de culturas de células (37 ° c, 5% CO2, 95% de humidade). Quatro dias mais tarde, confirme visualmente a formação do esferóide do tumor com um microscópio invertido e prossiga com o ensaio. Assegure-se de que haja somente um esferóide por o poço.
Nota: O tempo para formar um esferóide varia entre diferentes linhas celulares.
2. ensaio de invasão de spheroid tridimensional
Nota: Prepare a solução 2x porque o gel será diluído 1:1 quando adicionado nos poços.
- Descongelar HMDM em gelo e solução de fibrinogênio em um banho de água mantido a 37 ° c. Não perturbe o fibrinogênio até que seja completamente solubilizado e não coloque a solução em gelo; precipitação ocorrerá.
- Misture o volume adequado de cada reagente: 1 mg/mL de HMDM (concentração final: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL de trombina (concentração final: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL de aprotinina (concentração final: 33,3 UG/mL) e 1 mg/mL de fibrinogênio (concentração final: 0,5 mg/mL ).
Nota: Adicionar fibrinogênio pouco antes de dispensar a mistura para os poços e trabalhar rapidamente; Ele vai formar um gel em poucos minutos. Trate apenas alguns poços de cada vez. - Adicionar 50 μL de gel em cada poço. Dirija a ponta para a parede interna do poço e pipeta lentamente. Evite bolhas de ar (usando a técnica de pipetagem reversa) e tente não mover o esferóide do centro do poço.
- Retorne a placa de volta à incubadora da cultura de pilha e permita que a matriz de hmdm/fibrin solidificar por 30 minutos, e adicione delicadamente 100 μl do DMEM completo em cada poço sobre o gel.
3. imagem latente
- Imagem os esferoides diariamente usando um microscópio de luz invertido. Alternativamente, use sistemas de imagem automática.
4. segmentação de imagem com Ilastik
- Abra o ilastik e selecione fluxo de trabalho de classificação de pixel (Figura 1A). Ele classifica os pixels com base nas anotações feitas pelo usuário. Salve o projeto ilastik (. ILP) para o computador.
- Adicione imagens para análises. Clique em dados de entrada e Adicionar novo e, em seguida, escolha imagens (Figura 1B).
-
Para seleção de recursos, clique em seleção de recursos e selecione recursos (Figura 1C, retângulo vermelho).
Observação: os recursos selecionados devem corresponder aproximadamente às propriedades visuais que separam os objetos do plano de fundo, e eles serão usados para treinar o classificador.- Selecione os recursos clicando nas caixas. As caixas selecionadas ficam verdes (Figura 1C, retângulo azul).
Nota: Aqui o usuário pode selecionar de diversos tipos e escalas diferentes da característica. Cor/intensidade deve ser selecionado para separar objetos com base na cor ou brilho. A aresta deve ser selecionada para separar objetos com base em gradientes de brilho ou cor. A textura é uma característica importante se os objetos na imagem tiverem uma aparência textural especial. Para este ensaio, são utilizadas cor/intensidade (Sigma 0) e Edge (Sigma 6).
- Selecione os recursos clicando nas caixas. As caixas selecionadas ficam verdes (Figura 1C, retângulo azul).
-
Para treinamento, clique em treinamento e, na seção treinamento, há dois rótulos: rótulo 1 e rótulo 2 (Figura 1D, retângulo vermelho). Se houver apenas um rótulo, adicione um novo rótulo pressionando Adicionar rótulo (Figura 1D, retângulo azul).
- Marque o fundo com um dos rótulos (Figura 1d, amarelo) e as células com a outra etiqueta (Figura 1d, azul).
- Treine o software para os primeiros 10% das imagens. Escolha a próxima imagem da vista atual.
- Depois que as células e o plano de fundo estiverem marcados (da primeira imagem), pressione atualização ao vivo (Figura 1D, retângulo roxo).
Nota: com a próxima imagem, ilastik executará automaticamente a análise de acordo com as imagens anteriores.
- Após o treinamento é feito e ilastik analisou todas as imagens, clique em exportação de previsão. Escolha segmentação simples da fonte; Não escolha probabilidades ou qualquer outra coisa (Figura 1E).
- Escolha o formato de arquivo de saída desejado escolha exportar configurações de imagem... na seção exportação de previsão (Figura 1E). Exporte os resultados da rotulagem clicando em Exportar tudo (Figura 1F). Os arquivos serão exportados para a mesma pasta com as imagens originais.
Observação: neste experimento, o formato. H5 é usado.
5. análise de área com Fiji ImageJ
-
Ajuste de escala
- Abra a imagem original com uma barra de escala em Fiji ImageJ (Figura 2a). Assegure-se de que a imagem tenha o mesmo tamanho e dimensão que as imagens analisadas. Use a ferramenta seleção de linha para desenhar uma linha de um comprimento conhecido (Figura 2B).
Nota: Este protocolo é executado usando Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) e ilastik-1.3.2 RC. - Clique em analisar e definir escala (Figura 2C). Defina a distância conhecida no campo distância conhecida e defina a unidade adequada e clique em global (Figura 2D).
- Abra a imagem original com uma barra de escala em Fiji ImageJ (Figura 2a). Assegure-se de que a imagem tenha o mesmo tamanho e dimensão que as imagens analisadas. Use a ferramenta seleção de linha para desenhar uma linha de um comprimento conhecido (Figura 2B).
-
Instalando a macro
- Se um plugin ilastik não estiver instalado, siga estes passos: clique em ajuda, Atualizar.... Na janela aberta ImageJ Updater, clique em gerenciar sites de atualização. Na janela abrir gerenciar sites de atualização, clique em Avançar para ilastik e, em seguida, clique em Fechar. Em seguida, clique em aplicar alterações na janela ImageJ Updater. Este processo pode demorar algum tempo. A próxima janela será informações com o texto atualizado com êxito. Clique em OK e reinicie o ImageJ.
- Clique em plugins, macrose instalar (Figura 3A). Em seguida, escolha o arquivo Counter. IJM (consulte informações complementares) e clique em abrir.
Nota: A macro foi escrita especialmente para medir a área. A macro deve ser instalada toda vez que o software for aberto.
-
Análise de área
- Analise imagens quando todos os plugins estiverem instalados. Clique em plugins e role para baixo até ilastik (Figura 3C). Escolha importar HDF5, escolha o arquivo com formato. H5, clique em abrir e carregar e aplicar lut (Figura 3C, D).
- Pressione o botão a do teclado (macro) e a área aparecerá na janela de Resumo como área total (Figura 3e).
Representative Results
Quatro dias após a semeadura da célula UT-SCC-42B (linha celular metastática de SCC), a matriz (HMDM/fibrina, MSDM ou colágeno) foi adicionada nos esferóides formados (dia 0) e a invasão foi monitorada por três dias. As imagens aqui foram obtidas diariamente usando um microscópio invertido (Figura 4).
Uma vez incorporadas, as células da matriz HMDM/fibrina começaram a invadir rapidamente após um dia e estendidas para a matriz (Figura 4a). As células no MSDM não invadiram a matriz circundante, em vez disso, formando uma estrutura assimétrica (Figura 4B). Por outro lado, as células do colágeno invadiram um pouco, mas devido ao encolhimento da matriz a análise foi difícil (Figura 4C). Em alguns poços de colágeno, os esferóides até desapareceram após três dias (Figura 4C).
A Figura 5 ilustra a quantificação da invasão celular em hmdm/fibrina da linha celular de CEC de laringe primária UT-SCC-42A e a correspondente linha celular METASTÁTICA UT-SCC-42B. O vídeo (filme 1) tomado usando um sistema de análise de células vivas do esferóide hmdm/fibrina mostra o movimento das células de SCC dentro da matriz onde eles formam fios seguidos pelas outras células.
Figura 1 : Segmentação de imagem. Etapas selecionadas de segmentação de imagem usando ilastik. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ajuste de escala. Etapas selecionadas da configuração de escala usando Fiji ImageJ. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de invasão usando ImageJ. Etapas selecionadas de análise de imagem usando Fiji ImageJ. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Invasão de célula UT-SCC-42B em três matrizes diferentes. Imagens representativas da invasão de células SCC nos spheroids 3D. A invasão foi seguida por três dias e as imagens foram tiradas diariamente usando um microscópio invertido. (A) hmdm/fibrina, (B) msdm, (C) colágeno. A última coluna representa a clarificação da invasão do dia 3. Barra de escala = 200 μm. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Quantificação da invasão de células de CEC em HMDM/fibrina. O UT-SCC-42A laríngeo preliminar e a invasão laríngea metastática correspondente da linha celular de UT-SCC-42B SCC foram analisados usando o software de ilastik e de Fiji ImageJ. Os resultados representam média ± desvio padrão de três experimentos independentes, cada um em triplicata. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Movimento da célula SCC dentro do HMDM/fibrina por três dias. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito para baixar.)
Discussion
O método apresentado fornece um ensaio 3D baseado em tumor humano para avaliar a invasividade de células cancerosas dentro do microambiente humano do tumor que imita a matriz. A invasão de células cancerosas pode ser facilmente medida pela imagem diária com um microscópio padrão e usando o software de análise de imagem. O método demonstra a invasão da pilha um pouco do que meramente a proliferação.
Diferentemente do MSDM, a matriz HMDM/fibrina não requer nenhum controle de temperatura. Este método é fácil de executar, em particular, sem a necessidade de transferir os esferoides de uma placa para outra. Tem apenas um passo tecnicamente sensível, a adição de fibrinogênio à matriz. Uma vez que o fibrinogênio começa a gel após alguns minutos, a adição de fibrinogênio requer uma pipetagem robusta e tratamento de apenas alguns poços de cada vez. Há igualmente um risco de perturbar o esferóide e de movê-lo de sua posição central no poço em forma de U se a pipetagem é feita em uma maneira de alta pressão. A luxação do esferóide pode complicar a imagem e, eventualmente, a análise.
O ensaio pode ser modificado alterando a concentração de HMDM ou fibrinogênio. As células também podem ser fixas e manchadas para estudos moleculares subsequentes. Mesmo que este método possa ser modificado para uma forma totalmente automatizada, ele também pode ser realizado com um microscópio normal e dois softwares de código aberto, sem necessidade de equipamentos dispendiosos.
Em comparação com os tradicionais ensaios 3D baseados em MSDM, este ensaio poderia mostrar melhor as propriedades de invasão de células. Os esferoides cultivados em uma matriz rica em laminina contendo membrana basal, como a MSDM, podem ter mais proliferação de células cancerosas do que a invasão real, tornando-a inadequada para ensaios de invasão em várias linhagens de células cancerosas devido à sua baixa capacidade invasora. Uma outra matriz freqüentemente usada, tipo mim colagénio, tende a encolhimento das bordas durante o cultivo 3D, que afeta a localização do esferóide e a imagem latente dos poços. Adicionalmente, as diferenças entre as propriedades invasivas intrínsecas das linhagens celulares de carcinoma de língua mais (HSC-3) e menos (SCC-25) agressivas têm sido demonstradas por meio do microambiente de tumores humanos imitando modelos (discos de mioma e sua forma solúvel Matrix)10,13.
O ensaio é igualmente mais ético do que usando MSDM desde que HMDM é extraído do material restante do tumor humano do leiomyoma. Atualmente, o hmdm é o único produto de ECM derivado do tumor humano disponível que parece ser adequado para muitos ensaios in vitro relacionados ao câncer8,10. No futuro, matrizes derivadas de tecido animal poderiam ser substituídas por matrizes de tumores humanos para reduzir a necessidade de sacrificar os animais para a produção matricial.
Substituindo ensaios de cultura de células 2D com métodos 3D fornece informações mais precisas sobre o comportamento das células cancerosas. Atualmente, existem vários modelos 3D e matrizes comerciais, mas, infelizmente, nenhum é adequado para todas as linhagens de células cancerosas. Os pesquisadores devem selecionar a matriz mais adequada para o seu ensaio particular. A harmonização óptima do ensaio e da matriz pode ser desafiante, mas poderia significativamente aumentar a confiabilidade dos resultados.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos financiadores deste estudo: a Fundação Sigrid Jusélius, a sociedade do câncer da Finlândia e os fundos de pesquisa do hospital central da Universidade de Helsínquia. Os autores reconhecem a unidade de Biomedicum Imaging na Universidade de Helsínquia para a ajuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
- Jung, H., et al. Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo. Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).
- Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport. Nature Communications. 4, 2718 (2013).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).
- Salo, T., et al. A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies. BMC Cancer. 15, 981 (2015).
- Nurmenniemi, S., et al. A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment. The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).
- Salo, T., et al. Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).
- Overall, C. M., Blobel, C. P. In search of partners: linking extracellular proteases to substrates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).
- Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).
- Hoornstra, D., et al. Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin. In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).
