वयस्क Murine अश्रु और अवअधोहनुज ग्रंथियों से मायोउपकला कोशिकाओं का अलगाव
Summary
अश्रु ग्रंथि (LG) में α-चिकनी मांसपेशी एसीटिन (α एसएमए) को व्यक्त करने वाले दो कोशिका प्रकार होते हैं: मायोउपकला कोशिकाएं (एमसीएस) और पेरिसाइट्स । Mecs एक्टोडर्मल मूल के हैं, कई ग्रंथियों के ऊतकों में पाया, जबकि pericytes संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं endodermal मूल के हैं । इस प्रोटोकॉल mecs और pericytes murine lgs से आइसोलेट्स ।
Abstract
अश्रु ग्रंथि (एलजी) एक बहिःस्त्रावी ट्यूबुलोसेनार ग्रंथि है कि आंसू फिल्म की एक जलीय परत स्रावित करता है । एलजी उपकला वृक्ष में एसीनार, वाहिनी उपकला और मायोउपकला कोशिकाएं (एमईसीएस) शामिल हैं । MECs एक्सप्रेस अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (α Sma) और एक सिकुड़ा समारोह है । वे कई ग्रंथियों अंगों में पाए जाते हैं और एक्टोडर्मल मूल के हैं । इसके अलावा, एलजी SMA + अंतर्त्वचीय उत्पत्ति की संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं pericytes कहा जाता है: सिकुड़ा कोशिकाओं है कि संवहनी ट्यूबों की सतह आवृत । एक नया प्रोटोकॉल हम दोनों MECs और pericytes वयस्क murine LGs और अवअधोहनुज ग्रंथियों (SMGs) से अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रोटोकॉल MECs और pericytes के आनुवंशिक लेबलिंग पर आधारित है SMA CreErt2 का उपयोग /+: Rosa26-tdटमाटरूfl/fl माउस तनाव, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई के लिए एलजी एकल सेल निलंबन की तैयारी के द्वारा पीछा किया (facs ). प्रोटोकॉल की अनुमति देता है विभिंन मूल के इन दो सेल आबादी के अलगाव के आधार पर उपकला सेल आसंजन अणु (EpCAM) की अभिव्यक्ति पर आधारित है, जबकि pericytes EpCAM व्यक्त नहीं करते । अलग कोशिकाओं कोशिका खेती या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
कई बहिर्स्रावी ग्रंथियों जिनमें अश्रु, लार, हार्डेरियन, पसीना, प्रोस्टेट, और स्तन शामिल हैं, में मायोउपकला कोशिकाएं (एमसीएस) मौजूद हैं । MECs एक अद्वितीय कोशिका प्रकार है कि एक उपकला और एक चिकनी मांसपेशी phenotype को जोड़ती है । Mecs एक्सप्रेस α-चिकनी मांसपेशी actin (SMA) और एक सिकुड़ा समारोह1,2है । MECs के अलावा, अश्रु ग्रंथि (एलजी) और अवअधोहनुज ग्रंथि (SMG) शामिल है SMA + संवहनी कोशिकाओं pericytes कहा जाता है, जो endodermal मूल की कोशिकाओं है कि संवहनी ट्यूबों की सतह को आवृत3. हालांकि mecs और pericytes कई मार्कर एक्सप्रेस, SMA केवल मार्कर है कि अन्य एलजी और SMG कोशिकाओं में व्यक्त नहीं है1,3.
पिछले ४० वर्षों के भीतर, कई प्रयोगशालाओं ने विभिन्न बहिर्स्रावी ग्रंथि ऊतकों के पृथक्करण के लिए कहा है, जिसमें गैर-एंजाइमेटिक और एंजाइमेटिक दृष्टिकोण लागू किए गए थे । पहली १९८०, Fritz और coauthors में प्रकाशित रिपोर्टों में से एक में एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक collagenase/trypsin समाधान4 १९८९, Hann और coauthors में चूहे LGs से acini अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल collagenase का एक मिश्रण का उपयोग कर समायोजित, hyaluronidase और DNase5। १९९० में, क्रिप्स और सहकर्मियों गैर की विधि-अश्रु ग्रंथि acini6के enzymatic वियोजन प्रकाशित किया । बाद में, १९९८ में, zoukhri और coauthors के लिए एक एंजाइमी वियोजन प्रोटोकॉल को लौट Ca 2 के बाद+-एलजी और SMG अलग acini7पर इमेजिंग । पिछले दशक के भीतर, शोधकर्ताओं ने अपना ध्यान केंद्रित कर दिया है स्टेम के अलगाव पर/ प्रंगल और coauthors २०११ में माउस SMG स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन8। यह पद्धति स्टेम सेल-युक्त salispheres के अलगाव पर आधारित थी, जो संस्कृति में बनाए रखा गया था । लेखकों का दावा है कि proliferating कोशिकाओं स्टेम सेल एसोसिएटेड मार्कर व्यक्त इन salispheres8से अलग किया जा सकता है । Shatos और coauthors अघायल वयस्क चूहा lgs एंजाइमी पाचन का उपयोग और इकट्ठा “मुक्त” कोशिकाओं9से जनक कोशिका अलगाव के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित किया । बाद में, २०१५ में, Ackermann और coauthors इस प्रक्रिया को अलग करने के लिए प्रकल्पित “murine अश्रु ग्रंथि स्टेम सेल” (“mLGSCs”) है कि एक मोनो परत संस्कृति के रूप में कई अंश10पर प्रचारित किया जा सकता है समायोजित । तथापि, सेलुलर उपप्रकारों और पृथक उपकला कोशिकाओं की व्यक्तिगत आबादी में भेद करने के लिए पहले उल्लिखित प्रक्रियाओं में से कोई भी नहीं । २०१६ में, Gromova और coauthors एलजी स्टेम के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया को प्रकाशित किया/ हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य MECs को अलग-थलग करना नहीं था ।
हाल ही में, हम ने दिखाया है कि हम SMA + कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम हैं 3 सप्ताह से पुराने SMA-GFP चूहों12. हालांकि, इस समय हम SMA + कोशिकाओं की विभिन्न आबादी को अलग नहीं किया है । यहां हम विभेदित MECs और pericytes से वयस्क LGs और SMGs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक नई प्रक्रिया की स्थापना की ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में एलजी और स्मॉग से MEC और pericyte अलगाव का एक प्रोटोकॉल बताया गया । यह प्रक्रिया SMA के आनुवंशिक लेबलिंग, MECs और pericytes के एकमात्र विश्वसनीय biomarker पर आधारित थी ।
इस प्रोटोकॉल को विकसित करने की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एसएमएCreErt2 माउस तनाव के साथ हमें प्रदान करने के लिए Dr. Ivo kalajzic शुक्रिया अदा करने के लिए, माउस टेलिंग और Genotyping, चित्रा 2 के लिए पेशेवर चित्रों को प्राप्त करने के लिए मार्क शेली के लिए Umazume takकेशी । हम भी वैज्ञानिक अंग्रेजी संपादन के लिए वैज्ञानिक संपादकों और मार्क शेली के Scripps परिषद धंयवाद । हम सेल छंटाई के साथ सहायता के लिए स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट फ्लो साइटोमेट्री कोर के लिए आभारी हैं और डॉ रॉबिन को कई चर्चाओं/
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान अनुदान 5 R01 EY026202 और 1 R01 EY028983 H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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