Summary
눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.
Abstract
눈물 샘 (LG)은 인 열 막의 수성 층을 은닉 하는 외 각 성 tubuloacinar 동맥입니다. LG 상피 나무는 포상, ductal 상피 및 근 상피 세포 (MECs)로 구성 됩니다. MECs 익스프레스 알파 평활 근 액 틴 (α Sma)와 수축 기능을가지고 있습니다. 그들은 여러 선상 기관에서 발견 되 고 외 배 엽 기원입니다. 또한, LG에는 혈관 관의 표면을 감싸는 수축 세포 인 내 진 피 기원의 SMA + 혈관 평활 근 세포가 포함 되어 있습니다. 새로운 프로토콜을 통해 우리는 성인 뮤 린 LGs 및 턱 밑 샘 (SMGs)에서 MECs와 심 낭을 모두 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스 스트레인을 사용 하 여 mecs 및 심 낭의 유전 적 라벨링을 기반으로 하며, 형광 활성 세포 선별을 위한 LG 단일 세포 현 탁 액의 준비를 따른다 (FACS ). 이 프로토콜은 흉 막이 EpCAM을 표현 하지 않는 반면에, MECs에의 한 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)의 발현에 기초한 상이한 기원의 이들 두 세포 집단의 분리를 허용 한다. 고립 된 세포는 세포 배양 또는 유전자 발현 분석에 사용 될 수 있었다.
Introduction
근 상피 세포 (MECs)는 눈물, 타 액, harderian, 땀, 전립선 및 유선을 포함 한 많은 외 분 비 동맥에 존재 합니다. MECs는 상피와 평활 근 표현 형을 결합 하는 독특한 세포 유형입니다. Mecs 익스프레스 α-평활 근 액 틴 (SMA) 및 수축 기능1,2를 갖는다. MECs 외에도 눈물 동맥 (LG)과 턱 밑 동맥 (기관단총)은 혈관 관의 표면을 감싸는 내 진 피 기원의 세포 인 심 낭 이라는 SMA + 혈관 세포를 포함 합니다. Mecs와 심 낭은 많은 마커를 표현 하지만, SMA는 다른 LG 및 기관단총 세포1,3에서 표현 되지 않는 유일한 마커 이다.
지난 40 년 이내에, 몇몇 실험실은 다른 외 분 비 동맥 조직의 해리에 대 한 분석을 보고,이는 비효소 및 효소 적 접근법을 적용 하였다. 1980에 발표 된 첫 번째 보고서 중 하나에서, 프리츠와 코 저자는 콜라 게 나아 제/트립 신 솔루션4에서 순차 소화를 사용 하 여 고양이를 분리 하는 프로토콜을 설명 했다. 1989에서, hann 및 공동 저자는 콜라 게 나 제, 히 알루로 니다 제 및 dnase5의 혼합물을 사용 하 여 LGs에서의 느리게만 격리를 위해이 프로토콜을 조정 하였다. 1990에서, cripps 및 동료는 눈물 샘의 느리게만6의 비 효소 적 해리의 방법을 간행 했습니다. 나중에 1998에서 주크 리와 공동 저자는 LG 및 서울시 고립 된 느리게만7에서의 Ca2 +이미징에 대 한 효소 해리 프로토콜을 반환 했습니다. 지난 10 년 내에 연구원 들은 외 분 비 땀 샘의 줄기/전구 세포의 분리에 초점을 돌렸다. Pringle 및 공동 저자는 마우스 기관단총 줄기 세포의 분리를 위한 2011의 프로토콜을 설명 했다8. 이 방법은 배양에서 유지 되었던 줄기 세포 함유 돌출 구의 분리를 기초로 하였다. 저자는 줄기 세포 관련 마커를 발현 하는 세포 증식이 살 리 구체8에서 분리 될 수 있다고 주장 했다. 샤 로스와 공동 저자는 손상 되지 않은 성인 쥐 LGs에서 효소 소화를 사용 하 고 "해방 된" 세포9를 수집 하는 전구 세포 분리에 대 한 프로토콜을 발표 했습니다. 나중에, 2015에서, Ackermann과 공동 저자는 추정 "뮤 린 눈물 동맥 줄기 세포" ("mLGSCs")를 여러 통로에 걸쳐 모노 층 문화로 전파할 수 있는 분리 하기 위해이 절차를 조정 했습니다. 그러나, 이전에 언급 한 절차의 아무도 분리 된 상피 세포의 세포질 특수형과 개별 인구를 구별 하기 위하여 허용 했습니다. 2016에서 그로 모 바와 코 저자는 FACS11을 사용 하 여 성인 뮤 린 LGS에서 LG 줄기/전구 세포를 분리 하는 절차를 발표 했습니다. 그러나이 프로토콜은 MECs를 격리 하기 위한 것이 아닙니다.
최근에, 우리는 3 주 된 SMA GFP 쥐12에서 sma + 세포를 분리할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나,이 시간에 우리는 SMA + 세포의 다른 인구를 분리 하지 않았습니다. 여기에서 우리는 성인 LGs와 SMGs에서 차별화 된 MECs와 심 낭을 직접 분리 하기 위한 새로운 절차를 수립 했습니다.
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Protocol
모든 동물 작업은 국립 건강 연구소 (NIH) 지침에 따라 진행 되었으며 스 크립 스 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 생쥐의 수와 고통을 최소화 하기 위해 노력 했습니다. 모든 실험 동물은 수돗물에 대 한 무료 액세스와 표준 다이어트를 받았다.
참고: MEC 및 심 막 분리를 위한 주요 단계는 도 1A-1f에 개략적으로 설명 되어 있습니다. 이 절차에 사용 된 모든 시 약과 장비는 표 1에 설명 되어 있습니다.
1. 마우스와 SMA 세포 라벨링
- 사용 하는 성인 (2-4 개월) 타 목 타 유도성, α Sma가 구동 리포터 마우스 SmaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
참고: SMACreErt2 스트레인 친절 박사이 보 kalajzic13에 의해 제공 되었다. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. Cg-Gt (로 사) 26Sortm9 () Ai9라고도 하는 hze/J) 스트레인 (# 007909)은 잭슨 연구소 (새크라멘토, 캘리포니아)에서 구입 하였다. SMA + 세포는 복 강 내 타 목 타 마 (TM) 투여에 의해 표지 되었다. -
타 목 제 용액의 제조
- 여과 된 옥수수 기름을 준비 합니다. 옥수수 오일이 점성이 있기 때문에 0.22 µm 진공 필터를 사용 하십시오.
- 1 그램의 TM 파우더를 병에서 50 mL 튜브에 옮겨 넣습니다. 1 mL의 에탄올을 병에 넣고, 뚜껑을 닫고 헹 구 어 서 50 mL 튜브에 첨가 합니다. 또 다른 1 mL의 에탄올로 한 번 더 반복 한다.
- 20 밀리 그램/mL TM 용액의 50 mL를 만들기 위해 여과 된 옥수수 기름을 추가 합니다. 소용돌이 튜브는 호 일에 싸서 45 ° c에서 흔들 수 욕 또는 동요 인큐베이터에 넣어.
- TM을 용 해 시키기 위해 약 12-24 h가 소요 될 수 있다. 때때로, 튜브를 제거 하 고 남아 있는 결정을 확인 하십시오. 일단 TM이 완전히 용 해 되 면, 분 취 및-80 ° c에 저장 한다. 해 동 된 취 액을 재사용할 수 있습니다.
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SMA + 셀에 레이블을 지정 하려면 2 개의 순차적 일에 TM을 사용 하 여 마우스 복 강 내 (IP)를 주입 하십시오.
- 주입 3-4 주 오래 된 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f 100 µ에서 TM을 가진 어떤 남녀 마우스 든 지 (또는 2Mg/20g) 몸 무게 (그림 1a). 마우스는 마지막 TM 주입 후 2-3 일 내에 세포 분리에 사용할 준비가 되어 있습니다. 필요한 경우, 주입 된 마우스는 TM 주사 후 더 긴 시간에 희생 될 수 있다.
참고: FACS 동안 적절 한 보상을 위한 컨트롤로 서, 하나의 야생 유형 (C57Bl/6) 마우스와 1 개의 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스는 동일한 연령의 "미 염색" mecs와 TM을 주입 하지 않아도 됩니다. 2 SMA CreErt2에 대해 제공 된 동일한 계산을 사용 하 여 : Rosa26-TdTomatofl/fl 마우스. SMACreErt2/+를 주입 하지 않음: Rosa26-tdtomatoFl/fl 는 dsred 배경의 평가를 허용 할 것 이다. C57Bl/6 마우스는 염색 되지 않은 세포의 음성 제어 역할을 합니다.
- 주입 3-4 주 오래 된 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f 100 µ에서 TM을 가진 어떤 남녀 마우스 든 지 (또는 2Mg/20g) 몸 무게 (그림 1a). 마우스는 마지막 TM 주입 후 2-3 일 내에 세포 분리에 사용할 준비가 되어 있습니다. 필요한 경우, 주입 된 마우스는 TM 주사 후 더 긴 시간에 희생 될 수 있다.
2. 솔루션 및 버퍼
참고: LG는 세포의 해리를 어렵게 만드는 세포 외 기질을 포함 하는 상피 유래 동맥입니다. 따라서, 효소의 특별 한 조합과 아래에 설명 된 다단계 소화 과정을 사용 하는 것이 좋습니다.
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디 스퍼 타입 II 재고 솔루션 (25 배)
- 50 mM 헵 스/150mm 염화 나트륨 2 mL의 디 카 제 타입 II 분말 120 mg을 녹 인 후 25 배 원 액을 준비 합니다 (디 스퍼의 최종 농도는 30 단위/m l 이어야 함). 밀리 그램 당 단위는 마우스의 수와 그에 따라 조정 되어야 하는 dispase의 농도에 따라 달라질 수 있다.
- 200 µ L ali쿠오 트를 준비 하 고 며칠 동안 최대 6 개월 또는 4°c까지-70 ° c에서 보관 하십시오. 효소 분해를 막기 위해 dispase의 취 액을 한 번 이상 동결/해 동 하지 마십시오.
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DNase 유형 I 재고 솔루션
- 5 mL 50% 글리세롤, 스 트리 스 버퍼 (pH 7.5) 및 1mm MgCl2 의 dnase 타입 I 분말 5 mg을 녹 이세요 (재고 농도는 약 2000 단위/m l). 밀리 그램 당 단위는 쥐의 수에 따라 다를 수 있고 따라서 DNase의 사격 량은 그에 따라 조정 되어야 합니다.
- 0.22 µm 필터 및 10ml 주사기를 사용 하 여 스톡 솔루션을 필터링 합니다.
- 200 µ L ali쿠오 트를 준비 하 고 며칠 동안 최대 6 개월 또는 4°c까지-70 ° c에서 보관 하십시오. 효소 분해를 막기 위해 한 번 이상 동결/해 동 하지 마십시오.
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소화 매체
- 글루타민이 없는 DMEM의 낮은 포도 당 10 mL에 100 µ L의 세포 배양 보조 제 (예: Glutamax 참조) 를 1:100의 희석 액에 첨가 하십시오.
- DMEM 저 포도 당 2 mL를 세포 배양 보조 제로 첨가 하 고, 콜라 게 나아 제 6 mg을 추가 하 고 (젖은 얼음에 있는 효소), 160 µ L의 디 카 나 제 원 액 (2.4의 최종 농도), 16 µ L의 DNase 타입 I 스톡 용액 (8u/mL 최종 농도) 및 1m CaCl 2(6mm 최종 농도) 의 12 µ.
참고: 칼슘은 효소 활성을 증가 시키기 위해 필요14,15. 모든 계산은 두 성인 마우스에서 네 개의 눈물 동맥에서 세포의 분리를 위해 제공 됩니다. 소화 배지의 부피는 조직 및 복제 수의 양에 따라 달라질 수 있다. 2 mL 배지 당 2-4 개월 된 마우스에서 4 개 이상의 눈물 샘을 사용 하지 마십시오.
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차단 매체 I
- DMEM의 25ml(15% 최종 농도), 250 µ의 희석에 대 한 세포 배양 보조 제 ( 재료 표참조) 1:100, 및 50 µ l의 0.5 M EDTA pH 8.0 (1mm 최종 농도)를 첨가 하였다.
참고: 이 프로토콜에 대해 비교 된 다른 유형의 매체 중 DMEM/F-12는 최상의 결과를 주었다. 이 배지는 다른 연구자 들이 상피 세포를 분리/배양 하는 데에도16,17을 사용 하 고 있다.
- DMEM의 25ml(15% 최종 농도), 250 µ의 희석에 대 한 세포 배양 보조 제 ( 재료 표참조) 1:100, 및 50 µ l의 0.5 M EDTA pH 8.0 (1mm 최종 농도)를 첨가 하였다.
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차단 매체 II
- PBS 50을 첨가 하 여 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 mM 최종 농도) µ를 추가 합니다.
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복구 매체
- 5Mmmgcl2로 보충 된 Hbss 2 ml에, 100의 µ l을 추가 하 고, 최종 농도 2 ml 당 100 U에 사용 합니다. 상대적으로 높은 농도의 DNase-타입 난 상피 세포의 응집을 감소 시키는 것이 요구 된다.
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형광 활성 세포 선별 (FACS) 완충 액
- 486.5 mL의 PBS를 첨가 하 여 12.5 mL의 세럼 (2.5% 최종 농도)과 18.0 0.5 Ml(1mm 최종 농도)를 추가 합니다.
참고: 완충 액은 최대 6 주 동안 4°c에서 보관할 수 있다.
- 486.5 mL의 PBS를 첨가 하 여 12.5 mL의 세럼 (2.5% 최종 농도)과 18.0 0.5 Ml(1mm 최종 농도)를 추가 합니다.
3. 성인 쥐 눈물 동맥 수확 및 현미 해 부
- 아이 소 루 레인 흡입에 의해 마우스를 마 취 (아이 소 루 레인의 유 속 또는 농도를 5% 이상으로 조절) 하 고 자 궁 경부 탈 구를 희생 한다. 기관 IACUCs 권고에 따라 마 취 및 안락사를 수행 합니다.
- 미세 집게와가 위를 사용 하 여 눈과 귀 사이의 피부를 제거 합니다 (그림 2a).
- Lg를 분해 하기 위해, 부드럽게 핀셋을 사용 하 여 LG를 당겨 하 고 동시에 그것을 무료로 작은가 위 날카로운 팁을 사용 하 여 LG 주위의 결합 조직을 긁어 (그림 2b).
- LG와 파 타 침 샘은 서로 매우 가깝게 위치 하 고 해 부 하기 전에 분리 해야 하므로가 위로 절단 하지 마십시오. LG와 파 글 땀 샘이 분리 되 면가 위를 사용 하 여 LG를 잘라냅니다. 땀 샘을 35 mm 접시에 넣고 차가운 PBS 2 mL를 넣습니다 (그림 1b).
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LG는 결합 조직 캡슐/봉투에 의해 덮여 있다, 하 부 현미경 아래 주위 지방과 결합 조직을 손질 하 고 두 개의 집게와 LG 캡슐을 제거.
- 모든 땀 샘에 대해이 단계를 반복 합니다.
- 세포 라벨링을 보장 하기 위해 형광 현미경 하에서 작은 조각의 조직을 확인 하십시오 (그림 1c).
4. LG 단일 셀 서 스 펜 션의 제조
- 모든 lgs를 35 mm의 접시에 넣어 실 온 (RT) 소화 매체와 다진 lgs를 사용 하 여 작은 0.5가 위를 매우 작은 조각 (약 µm2)으로 이동 합니다. 일반적으로 다진 4 LGs에 약 3 분이 걸립니다 (그림 2c).
- 넓은 보어 파이 펫 필터 팁을 사용 하 여 다진 조직을 2 mL 둥근 바닥 튜브에 옮겨 넣습니다. 팁이 절단 된 일반 크기의 파이 펫 팁을 사용 하십시오 (그림 2d).
- 최대 2 mL의 소화 배지를 넣고 튜브를 반전 시켜 섞어 줍니다.
- 37 ° c, 100-120 rpm에서 진 탕 부 화기 (또는 동요 수 욕)에 튜브를 놓고 90 분 동안.
- 1000 µ L 필터 팁 (그림 2d)을 사용 하 여 30 분 마다 천천히 글 랜드 조각 20-30 회를 피 펫 합니다. 인큐베이션/삼 투 화 후에, 10 µ L를 취하고 클러스터에 대 한 현미경 하에서 검사 합니다. 클러스터가 지속 되 면 소화를 계속 하십시오.
- 90 분 후, 인슐린 주사기 바늘 (331g)을 통해 시료 2-3 번을 전달 하 여 현 탁 액으로 세포를 방출 한다.
참고: 소화가 완료 되 면 눈에 띄는 눈물 샘 조각이 용액에 남아 있어야 합니다 (그림 1d). - 세포 현 탁 액을 15ml 튜브로 전송 하 고 차단 미디어 타입 I를 총 5Ml에 추가 합니다. 혼합 튜브 2-3 시간을 반전.
- 50 mL 튜브에 놓인 70 μ m 세포 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 통과 시켰다. 여과기는 1 mL의 블로킹 미디어 타입 I를 씻어 주세요. 4.8 단계를 다시 반복 합니다.
- RT에서 5 분 동안 0.4 x g 에서 원심 분리기 샘플.
- 상층 액을 흡입. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 2 mL의 블로킹 매체 타입 II에서 세포를 재 중단 하 고 2 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 세포 현 탁 액을 옮깁니다.
- 0.4 x g (24 x 1.5/2.0ml로 터에서 셀을 원심 분리 하 고 RT에서 3 분간 재료 표참조)
- 상층 액을 흡 인 하 고 1 mL의 세포 분리 용액으로 세포를 재 부유 시킵니다 ( 재료 표참조).
참고: 여기서, 세포 박 리 액은 세포 표면 마커의 분석을 위해 세포를 분리/해리 하는 단백질 분해 및 collagenolytic 활성을 갖는 해양 유래 효소 인 Accutase 이다. - 37 ° c에서 세포 배양, 100-120 rpm에서 2-3 분의 세포 분리 용액을 사용 하면 세포 막이 손상 될 수 있습니다.
- 세포 현 탁 액을 50 mL 튜브에 넣고, 10 mL의 블로킹 미디엄 타입을 추가 합니다. 원심 분리기 튜브에서 0.4 x g (24 x 1.5/2.0ml로 터; 5 분간 재료 표참조)
- 상층 액을 버리고 6 mL의 회복 배지에서 세포를 재 중단 하 고 RT에서 30 분 동안 세포를 배양 한다.
- 현미경으로 세포 현 탁 액의 10 µ L을 확인 하 여 완전 한 세포 해리를 보장 합니다 (그림 3).
- 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 파랑을 트리 판. 일반적으로 4 개의 LGs (하나의샘플)로 4x105x10 x6 셀을 예상 합니다.
- 0.4 x g (24 x 1.5/2.0ml로 터에서 원심 분리 세포; RT에서 3 분 동안 재료 표참조) 항 체 염색을 진행 한다.
5. 항 체 염색
- 400 µ L의 FACS 완충 액을 포함 한 2 ml 튜브에 최대 5 x105 세포를 추가 합니다. 화려한 보라색 421 안티 마우스 CD326 (EpCAM) 및 0.5 µ L의 고스트 레드 780 (생존 염료)의 5 µ L을 추가 합니다.
- 병렬로 FACS 보정을 조정 하는 컨트롤을 준비 합니다.
네거티브 컨트롤-1 (야생 형 마우스의 셀)
배경 제어 SMA CreErt2에서 염색 되지 않은 세포 /+: Rosa26-tdtomatofl/fl
Cy7-780 염색 세포 (야생 형 마우스 로부터의 세포는 고스트 레드 780 생존 염료로 염색)
EpCAM-브 릴리 언 트 바이올렛 421 (야생 형 마우스 로부터의 세포는 EpCAM-브 릴리 언 트 바이올렛 421 항 체).
참고: 각 제어 샘플에 대해 FACS 버퍼의 400 µ L 당 최소 1 x 105 셀을 사용 하십시오. - 각 시 약을 첨가 한 후 피 펫 팅 하 여 세포를 철저히 섞는다.
- 튜브 (들)를 랩으로 감싸고 4°c에서 45 분 동안 튜브를 돌립니다.
- 원심 분리기 샘플을 0.4 x g (24 x 1.5/2.0ml로 터; 4 ° c에서 3 분 동안 재료 표참조).
- FACS 버퍼의 1 mL에 있는 세포를 다시 중단 하십시오. 보상 하는 동안 배경을 줄이기 위해 세포를 씻는 것이 중요 합니다.
6. 형광 활성 세포 선별
- 세포 현 탁 액을 5 mL FACS 튜브로 전달 하 고 FACS 분석을 진행 하십시오. 얼음에 세포를 유지.
- 단색 컨트롤을 사용 하 여 보정을 조정 합니다.
- 적절 한 유 세포 측정기를 사용 하 여 20psi에서 100 μ m 노즐을 통해 셀을 정렬 합니다 ( 재료 표참조). 게이팅 strategy18도 1e 와 도 4에 도시 되어 있다.
- 다운스트림 절차에 따라 FACS 또는 용 해 완충 액으로 정렬 된 세포를 수집 합니다 (그림 1e, F).
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Representative Results
SMA + MECs 및 연골을 분리 하는 마우스 모델
확립 된 프로토콜은 LGs와 SMGs에서 MECs와 심 낭의 두 가지 순수한 인구를 분리 하는 것을 허용 합니다 ( 표 1참조). 이 두 종류의 세포는 다른 크기와 모양을가지고 있습니다. 미세 혈관은 모세 혈관의 벽 주위에 개발 (도 5a) 및 MECS LG 분 비 acini 둘러싸고 있는 동안 제곱 모양 (그림5b)을가지고, 긴 공정을가지고 상대적으로 큰 면적을 차지 한다 (도 5a, B ). 설명 된 절차는 TM-유도성 Sma CreErt2에서 SMA +의 유전 세포 라벨링을 기반으로 합니다 : Rosa26-TdTomatofl/fl 마우스 스트레인. 부가적으로, EpCAM 항 체는 연구자 들이 상피 SMA를구별할 수 있도록 합니다: epcam+ 세포 내 피 기원 (MECS) 및 SMA+epcam 세포 (심 막 유래).
단일 세포 서 스 펜 션의 제조
LG는 철저히 소화 되어야 하는 필 체 세포 외 기질을 포함 하 고 있습니다. 제공 된 프로토콜을 통해 FACS 분석 및 추가 어플리케이션을 위한 단일 셀 솔루션을 준비할 수 있습니다. 해리 된 세포의 예는 그림 3에 나와 있습니다.
FACS에의 한 MEC 및 연골 분리
MECs를 심 낭 으로부터 구별 하기 위해, 단일 세포는 상피 세포만을 검출 하는 EpCAM 항 체로 염색 되었습니다. 세포의 주요 집단은 전방 및 측면 산란 영역 게이팅에 의해 결정 되었다 (도 4a). 의심은 전방 산포 면적 대 폭과 측면 산란 면적 대 폭 (그림 4b)을 플로팅하여 제외 되었습니다. 죽은 세포 배제는 고스트 레드 780 (생존 염료)를 통해 이루어졌다. 표지 되지 않은 대조 군 (도 4e), 배경 제어 및 단일 일차 항 체로 표지 된 항 체 제어는 배경 잡음 (비 특이 적 항 체 결합)을 결정 하 고 최적의 분리를 위한 적절 한 보상을 확립 하기 위해 사용 되었다 신호 사이에 (그림 4d). 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었습니다.
MECs 및 심 낭은 DsRed 라벨링에 의해 제어 되었습니다. DsRed+ dim (표시 되지 않음) 및 두 개의 MEC 및 심 막 세포 집단 내에 있는 dsred+ 밝은 세포가 검출 되었다 (그림 4d). 표지 된 세포의 밝기는 TM 주입19시에 SMA 발현 또는 리포터 활성화 정도에 의존할 수 있다. 오직 DS Red+ 밝은 세포 집단만이 완전히 분화 된 세포가 요구 되었기 때문에 수집 되었다. DS 빨간색+ 희미 한 세포 집단은 추가 조사가 필요 합니다.
다운스트림 응용 프로그램
MECs가 외 분 비선에서 중요 한 수축 기능을 하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 또한, 그들은 매우 플라스틱 세포와 줄기 세포의 특징을가지고 있다. 따라서 격리 된 MECs를 여러 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어 세포는 배양 될 수 있고, RNA 분리 또는 이식에 사용 된다 (도 1 층)12,21,22.
| 매개 변수 | 눈물 샘 | 턱 밑 샘 |
| 샘플 당 생쥐 수 | 2 | 1 |
| 샘플 당 땀 샘의 수 | 4 | 2 |
| 해 부 땀 샘 | 파와 선 분리 | 설 선 으로부터 분리 |
| 시료 당 콜라 게 나아 제 농도 | 6 밀리 그램/2 mL | 9 밀리 그램/2 mL |
| 효소 해리 후의 대략적인 세포 수 | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| 복구 단계 ("성인 쥐 눈물 동맥 단일 세포 해리" 섹션 참조) | 복구 미디어 6 ml의 셀을 다시 일시 중지 합니다. | 12 mL의 복구 미디어에서 셀을 다시 일시 중지 합니다. |
| 항 체 염색 중 FACS 완충 액의 부피 | 400 µ L | 2 튜브 400 µ L; 그것은 각 튜브가 6x105 이상 하지 않은 두 개 또는 세 개의 튜브로 세포를 분할 하는 것이 좋습니다 |
표 1: 턱 밑 동맥 으로부터 세포를 분리 하기 위한 프로토콜의 변형 (기관단총). 이 표에서는 뮤 린 LG에 대 한 절차에 비해 뮤 린 기관단총에서 MECs 및 심 낭을 분리 하는 데 필요한 주요 수정 사항을 설명 합니다.
그림 1: 실험의 개략적인 표현입니다. (A) SMA CreErt2의 IP 주사: Rosa26-tdtomatofl/fl마우스 TM. (B) LG 또는 기관단총의 고립 및 미 싱 (C) 형광 현미경을 이용한 세포 라벨링 분석. (D) 단일 세포 용액을 제조 하는 다단계 효소 분해 방법. 세포가 군집에서 풀어 지는 것을 확인 하기 위하여 가벼운 현미경으로 소화 단계를 확인 하는 것이 중요 합니다. (E) SMA + 밝은 ds 적색 +/epcam + (mecs) 및 ds 적색 + 브라이트/epcam (연골)을 보여주는 게이팅의 예 (F) 수집 된 mecs 및 심 낭은 세포 배양, RNA 분리 및 유전자 발현 분석과 세포 이식 등 다양 한 하류 절차를 거치게 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: LG 분리/정지의 중요 단계 (A) 눈과 귀 사이에 피부를 제거 하 여 lg를 분석할 수 있습니다. 노란색 파선은 lg 위치를 나타냅니다. (B) LG 해 부. 노란색 화살촉은 눈물과 파 선 땀 샘 사이의 영역을 가리킵니다. (C) 곡선의 무딘 끝이 있는가 위를 사용 하 여 소화 매체에 LG. (D) 다진 조직을 2 mL 튜브로 옮기는 것. 노란색 화살촉은 전송에 필요한 넓은 보어 크기 1ml 팁을 묘사 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 공초점 및 차동 간섭 대비 (DIC) 뮤 린 LG에서 해리 된 단일 세포를 보여주는 이미지. (A-C) 하나의 4 개월의 2 개의 LGs에서 분리 된 단일 셀 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스. 핵은 DAPI (청색)로 염색 됩니다. 흰색 화살표는 SMA + (DS 빨간색) 셀 (MECs 또는 연골)을 나타냅니다. 스케일 바 = 15 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: FACS를 사용 하 여 뮤 린 LG MECs 및 심 낭의 식별. (A) 전방 및 측면 산란 영역 게이팅에의 한 LG 셀의 주요 모집단의 결정. (B) 전방 산란 면적 대 폭을 통한 의심의 배제. (C) 고스트 레드 780 (생존 염료)을 통한 죽은 세포 배제. (Sma + 브라이트/epcam) 및 심 낭 인구는 epcam 항 체로 염색을 기반으로 구별됩니다. (E) 레이블이 없는 컨트롤 (야생 형 마우스의 셀). 각 플롯에는 게이트 셀의%가 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 뮤 린 LG에서 분리 된 MECs와 심 낭 사이의 분포 및 모양 차이를 보여주는 공초점 이미지. (A) MEC와 심 낭 사이의 분포 차이를 나타내는 표지 된 세포가 있는 LG의 전체 마운트 준비. (B) MEC와 심 낭의 형태가 다르다. 심 낭은 상대적으로 작고 한 모양을가지고 있지만, MEC는 크고 불규칙 한 모양과 여러 가지 긴 공정이 있습니다. 화살촉 = MECs 및 연골. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고는 LG와 기관단총의 MEC 및 심 낭 분리의 프로토콜을 설명 했습니다. 이 절차는 SMA의 유전 라벨링, MECs 및 심 낭의 유일한 신뢰할 수 있는 바이오 마커를 기반으로 했습니다.
이 프로토콜을 개발 하는 긴급 한 뮤 린 LGs 및 SMGs에서 MECs의 고립을 강조 하는 문학의 거의 총 부재에 의해 동기 부여 했다. 유전 라벨링을 이전에 사용 했지만, SMA-GFP 쥐를 사용 하 여 젊은 3 주 된 LGs에서 SMA + 세포를 분리 하지만,이는 성인 마우스에서 신호의 부분적인 손실로 인해 세포 격리를 위해 이러한 구형 마우스를 사용 하는 것을 허용 하지 않았다. 또한, GFP 표지 된 세포는 FACS 신청23 에 있는 상대적으로 높은 배경을 주고 추가 보상을 요구 합니다. 대조적으로, SmaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스 선은 마우스 출생 후 발달, 성년 및 노후화를 통해 아무 또는 낮은 배경과 SMA 라벨링 활성화의 높은 수준을 보여줍니다. Sma CreErt2의 사용/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스는 질병 진행 또는 노화에 초점을 맞춘 연구를 위해 특히 중요 하다,이 쥐의 SMA + 세포는 질환 개발 전에 표시 될 수 있기 때문에 나중에 연구 질병/노화 진행. 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계는 철저 한 LG 민 및 다음 소화. 이 단계는 FACS 분석 동안 얻어진 세포 수를 감소 시킬 수 있다. 전반적으로, 일차 세포의 분리 및 즉각적인 분석은 또한 배양24에서 유지 되는 세포의 전사 프로 파일의 현저한 변화로 인해 중요 하다.
또한 뮤 린 LGs에서 MEC 및 심 막 분리에 대해 설명 된 프로토콜은 다른 다운스트림 절차를 가능 하 게 합니다. 단백질, RNA 및 DNA 추출은 둘 다 단일 세포 집단에서 가능 합니다, 몇몇 쥐/견본은 세포의 수를 증가 시키기 위하여 병렬로 또는 순차적으로 처리 될 필요가 있더라도. 함께 촬영 된 결과는 다른 뮤 린 선 조직 으로부터 MEC 및 심 낭 분리를 위한 효과적이 고 상대적으로 간단한 방법을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 하는 재정적 이해관계와 다른 이해관계의 상충을 선언 하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 SMACreErt2 마우스 스트레인을 우리에 게 제공 하는 Dr. Ivo kalajzic 감사 합니다, 마우스 꼬리와 유전형에 대 한 마 누 즈 메,도 2에 대 한 전문적인 사진을 얻기 위한 마크 셸리. 우리는 또한 과학적인 영어 편집을 위한 과학 편집자와 마크 셸리의 스 크립 스 위원회 감사 합니다. 우리는 셀 선별 및 FACS 데이터 분석에 대 한 여러 토론/조언에 대 한 닥터 로빈 윌 렌에 도움을 위한 스 크립 스 연구 기관 유 세포 분석 코어에 감사 드립니다.
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다, 국가 안과 연구소 보조금 5 R01 EY026202 및 1 R01 EY028983 H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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