Summary
泪腺 (LG) 有两种细胞类型表达α平滑肌肌动蛋白 (αSMA): 肌上皮细胞 (Mec) 和周周细胞。Mec 是外胚层的起源, 发现在许多腺体组织, 而周围的血管平滑肌细胞的内皮起源。该协议将 Mec 和 pericytes 与小鼠 Lg 隔离开来。
Abstract
泪腺 (LG) 是一种外分泌的管状腺, 分泌一层泪膜水层。LG 上皮树由腺泡、导管上皮细胞和肌上皮细胞 (Mec) 组成。Mec 表达α平滑肌肌动蛋白 (αSMA), 并具有收缩功能。它们存在于多个腺体器官中, 属于外胚层。此外, LG 还含有 SMA + 内皮源血管平滑肌细胞, 称为周长: 包围血管管表面的收缩细胞。一项新的协议允许我们从成年小鼠 Lg 和下颌腺体 (Smg) 中分离出 Mec 和外周。该协议基于Mec 和 pericytes 的基因标记使用 smacret2\+: rosa26-tdtomaatofl/fl 小鼠菌株, 然后制备用于荧光活化细胞分选的 lg 单细胞悬浮液 (facs)).该协议允许根据 Mec 表达的上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 分离这两个不同来源的细胞群, 而 pericytes 不表示 EpCAM。分离细胞可用于细胞培养或基因表达分析。
Introduction
肌上皮细胞 (Mec) 存在于许多外分泌腺体中, 包括泪液、唾液、哈德里安、汗液、前列腺和乳房。Mec 是一种独特的细胞类型, 结合了上皮和平滑肌表型。Mec 表达α平滑肌肌动蛋白 (sma), 并具有收缩功能1,2。除 Mec 外, 泪腺 (LG) 和颌下腺 (SMG) 还含有称为外周的 SMA + 血管细胞, 它们是内皮源细胞, 包裹血管管表面3。虽然 mec 和 pericytes 表达了许多标记, 但 sma 是在其他 lg 和 smg 细胞1、3 中唯一没有表达的标记。
在过去40年中, 一些实验室报告了不同外分泌腺组织的离解检测方法, 其中采用了非酶法和酶法。在1980年发表的第一份报告中, 弗里茨和合著者描述了一种使用胶原蛋白/胰蛋白酶溶液中的顺序消化分离猫科动物腮腺的协议.1989年, Hann 和合著者使用胶原酶、透明质酸酶和 DNase5的混合物调整了该协议, 以便从大鼠 lg 中分离出 acini。1990年, 克里普斯和他的同事们公布了泪腺6的非酶解离方法。后来, 在 1998年, Zoukhri 和合著者回到了酶分离协议, 以跟踪 LG 和 SMG 隔离 acini 7 上的 Ca2 +成像.在过去的十年里, 研究人员将注意力转向了从外分泌腺体中分离干细胞祖细胞。普林格尔和合著者在2011年描述了一项分离小鼠 SMG 干细胞的协议。该方法是在分离培养中保持的含干细胞盐虫的基础上进行的。作者声称, 表达干细胞相关标记物的增殖细胞可以从这些盐球8中分离出来.Shatos 和合著者发布了利用酶消化和收集 "释放" 细胞9从未受伤的成年大鼠 Lg 中分离祖细胞的方案.后来, 在 2015年, 阿克曼和合著者调整了这一程序, 以分离推定的 "小鼠泪腺干细胞" ("Mlgsc"), 这些细胞可以作为单层培养在多个通道10上传播。然而, 上述程序都不允许区分细胞亚型和孤立上皮细胞的个体群。2016年, 格罗莫娃和合著者公布了利用流式细胞仪11从成年小鼠 lg 中分离 lg 干细胞的程序。但是, 此协议并不是为了隔离 Mec。
最近, 我们已经证明, 我们能够从3周大的 SMA-GFP 小鼠12只中分离出 SMA+ 细胞。然而, 在这个时候, 我们还没有分离不同的 SBA + 细胞的种群。在这里, 我们建立了一个新的程序, 直接隔离分化的 Mec 和 perictes 从成人 Lg 和 Smg。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物工作都是根据国家卫生研究所 (NIH) 的指导方针进行的, 并得到了斯克里普斯研究所动物护理和使用机构委员会的批准。尽一切努力尽量减少老鼠的数量和它们的痛苦。所有实验动物都接受了标准饮食, 可以免费获得自来水。
请注意:图 1A-F示意图概述了 mec 和周二叶隔离的主要步骤。表 1描述了用于此过程的所有试剂和设备。
1. 小鼠和贴标签的 SMA 细胞
- 使用成虫 (2-4 大) 他莫西芬诱导, αSMA 驱动的记者小鼠 Smacreert2+: Roma26-tdtocomatofl/fl.
请注意:Ivo Kalajzic 博士提供了Smacreert2 菌株.Roasa26-tdtoatofl/fl (B6。Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-Tdtomto) Hze/j, 也被称为ai9) 菌株 (# 007909) 是从杰克逊实验室 (萨克拉门托加利福尼亚州) 购买的。SMA + 细胞用腹腔内他莫西芬 (TM) 给药贴上标签。 -
他莫西芬溶液的制备
- 准备经过过滤的玉米油。使用0.22μm 真空过滤器, 因为玉米油是粘性的。
- 将1克 TM 粉末从瓶子中转移到50毫升管中。在瓶子中加入1毫升乙醇, 盖上盖子后再摇一摇, 然后加入50毫升的试管。用另一种1毫升乙醇重复一次。
- 加入过滤后的玉米油, 制成 20 mg/mL tm 溶液的50毫升。涡流管, 用铝箔包裹, 然后在45°C 时放入晃动的水浴或晃动的孵化器中。
- 溶解 TM 可能需要12-24小时左右的时间。不时地取出管子, 检查是否有剩余的晶体。一旦 TM 完全溶解, 脂肪并存储在-80°c。解冻的脂肪可以重复使用。
-
要给 SMA + 细胞贴上标签, 请连续两天用 TM 腹腔 (IP) 注射小鼠。
- 注射3-4周大的 Smacreert2\ +: rosa26-tdtomaatofl2 任何性别小鼠的 tm 为 100μl/20 g (或 2 Mg/2 g) 体重 (图 1a)。在最后一次 TM 注射后的2-3天内, 老鼠就可以用于细胞隔离。如果需要, 注射的小鼠可以在 TM 注射后更长的时间内牺牲。
请注意:作为在流式细胞仪期间适当补偿的控制, 需要一种野生类型 (c57bl6) 鼠标和一种smacreert2\+: Roasa26-tdtomaofl/fl 小鼠未注射 tm (带 "未染色" mec)。使用为2只 smacreert2\ +: roasa26-tdtocotofl/fl 小鼠提供的相同计算。不注射sma creert2\ +: rosa26-tdtomatofl/fl 将允许评估 dsred 的背景。C57bl6 小鼠将作为一个负面的控制未染色的细胞。
- 注射3-4周大的 Smacreert2\ +: rosa26-tdtomaatofl2 任何性别小鼠的 tm 为 100μl/20 g (或 2 Mg/2 g) 体重 (图 1a)。在最后一次 TM 注射后的2-3天内, 老鼠就可以用于细胞隔离。如果需要, 注射的小鼠可以在 TM 注射后更长的时间内牺牲。
2. 解决方案和缓冲器
请注意:LG 是一个上皮来源腺体, 包含细胞外基质, 使细胞的分离变得困难。因此, 建议使用酶的特殊组合和下面描述的多步骤消化过程。
-
二类库存解决方案 (25x)
- 溶解120毫克的消解酶 ii 型粉末在2毫升 50 mm Hpes1, 150 mm Ncl, 以制备25x 的库存溶液 (最终浓度的溶解酶应为 30 Units/ml)。每毫克单位可能因小鼠数量而异, 并应相应调整消解酶的浓度。
- 准备200Μl 的等价物, 并将其存放在-70°c, 最长6个月或 4°c, 为期几天。不要将糖化酶的脂肪解冻一次以上, 以防止酶降解。
-
DNase i 型库存解决方案
- 在50% 甘油的5毫升溶液中溶解5毫克的 Dnase i 型粉末, 在 20 mM Tris 缓冲液 (pH 7.5) 和 1 mM MgCl2中溶解5毫克 dnmed 粉末 (库存浓度应约为 2000 Units/ml)。每毫克单位可能因小鼠数量而异, 因此 DNase 的浓度应相应调整。
- 使用0.22μm 过滤器和10毫升注射器对库存溶液进行过滤。
- 准备200Μl 的等价物, 并将其存放在-70°c, 最长6个月或 4°c, 为期几天。不要多次冷冻解冻, 以防止酶降解。
-
消化介质
- 在不含谷氨酰胺的 DMEM 低血糖中, 加入100Μl 的细胞培养补充剂 (如谷氨酸, 见材料表), 稀释为1:100。
- 加入2毫升 DMEM 低葡萄糖与细胞培养补充, 加入6毫克的胶原酶 i 型, 通过移液 (湿冰上的酶)、166μl 的溶解酶库存溶液 (2.4 U\ ml 最终浓度)、16μl 的 dnase i 型库存溶液 (8 U\ ml 最终浓度) 彻底混合和12μl 的 1 m Ccl2 (6 mm 最终浓度)。
请注意:钙需要增加酶活性14,15。提供了从两个成年小鼠的四个泪腺中分离细胞的所有计算。消化介质的体积可能因组织数量和复制次数的不同而不同。每2毫升培养基不要使用2-4 大小鼠的4个泪腺。
-
阻塞介质 I
- 在 DMEMCSEF-12 的25毫升中, 加入 FBS (15% 的最终浓度)、250μl 的细胞培养补充剂 (见材料表), 稀释为 1:100, 0.5 m edta ph 8.0 (1 mm 最终浓度) 为50μl。
请注意:在该协议的不同类型的介质中, DMEMCSEF-12 给出了最好的结果。这种培养基也被其他研究人员用于分离培养上皮细胞16,17。
- 在 DMEMCSEF-12 的25毫升中, 加入 FBS (15% 的最终浓度)、250μl 的细胞培养补充剂 (见材料表), 稀释为 1:100, 0.5 m edta ph 8.0 (1 mm 最终浓度) 为50μl。
-
阻塞介质 II
- 在 PBS 的25毫升, 加入 50μl 0.5 m Edta pH 8.0 (1 mM 最终浓度)。
-
恢复介质
- 以2毫升 HBSS 为补充, 加入100μl 的 dnase i 型库存溶液, 使其达到每2毫升最终浓度 100 U.需要相对较高浓度的 dnase i 型, 以减少上皮细胞的聚集。
-
荧光活化细胞分选 (流式细胞仪) 缓冲液
- 在 486.5 mL 的 PBS 中, 加入 12.5 mL 的血清 (2.5% 的最终浓度) 和1毫升的 0.5 m EDTA ph 8.0 (1 mM 最终浓度)。
请注意:缓冲液可在4°c 下存储, 最长6周。
- 在 486.5 mL 的 PBS 中, 加入 12.5 mL 的血清 (2.5% 的最终浓度) 和1毫升的 0.5 m EDTA ph 8.0 (1 mM 最终浓度)。
3. 成年小鼠泪腺收获和显微解剖
- 通过吸入异氟醚 (将异氟醚流量或浓度调整到5% 或更高) 和宫颈脱位牺牲小鼠。根据机构内的 Iacoc 建议进行麻醉和安乐死。
- 使用精细的钳子和剪刀, 去除眼睛和耳朵之间的皮肤 (图 2a)。
- 要解剖 LG, 用推子轻轻拉 LG, 同时用小剪刀尖尖划伤 LG 周围的结缔组织, 以释放它 (图 2B)。
- 避免用剪刀切割, 因为 LG 和腮腺唾液腺彼此非常接近, 在解剖前必须分开。当 LG 和腮腺分离时, 用剪刀将 LG 剪掉。将腺体放入一个35毫米的盘子中, 中间有2毫升的冷 PBS (保持在冰上) (图 1 b)。
-
由于 LG 被结缔组织包膜包覆着, 在解剖显微镜下修剪周围的任何脂肪和结缔组织, 并用两个钳子取出 LG 胶囊。
- 对所有腺体重复此步骤。
- 在荧光显微镜下检查一小块组织, 以确保细胞标记 (图 1c)。
4. LG 单细胞悬浮液的制备
- 将所有 Lg 转移到一个35毫米的盘子与0.5 毫升的室温 (RT) 消化介质和薄荷 Lg 使用小剪刀成非常小的件 (约 0.2-1 微米2)。通常情况下, 大约需要3分钟的时间来切碎 4 Lg (图 2c)。
- 使用宽孔移液器滤嘴将碎组织转移到2毫升的圆底管中。使用正常尺寸的移液器尖端, 将吸头切断 (图 2d)。
- 将高达2毫升的消化介质混合, 倒置管。
- 将管子放置在晃动的孵化器 (或晃动的水浴) 中, 在 37°c, 10-120 转每分钟90分钟。
- 每30分钟缓慢移液器压盖块20-30 次, 使用 1, 000Μl 滤嘴与减小孔尺寸 (图 2d)。孵育后, 取 10Μl aliquot, 并在显微镜下检查团簇。如果集群持续存在, 继续消化。
- 90分钟后, 通过胰岛素注射器针 (31G) 将样品通过2-3 次, 以进一步将细胞释放到悬浮液中。
请注意:消化完成后, 溶液中不应残留明显的泪腺块 (图 1d)。 - 将细胞悬浮液转移到15毫升管, 并将 i 型阻滞介质添加到总共5毫升。反转管2-3 次混合。
- 通过放置在 50 mL 管上的70μm 电池过滤器将细胞悬浮液通过。用1毫升的阻塞介质清洗过滤器 i. 再次重复步骤4.8。
- 在 rt 以 0.4 x g 离心样品5分钟。
- 吸收上清液。使用 1 mL 移液器尖端在2毫升的堵塞介质 ii 中重新悬浮细胞, 并将细胞悬浮液转移到2毫升的微离心管中。
- 以 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL 转子; 见材料表) 离心电池 3分钟.
- 在细胞分离溶液的1毫升中吸收上清液和再悬浮细胞 (见材料表)。
请注意:在这里, 细胞分离溶液是依赖酶, 一种具有蛋白溶解和胶原蛋白溶解活性的海洋源酶, 分离分离细胞, 用于分析细胞表面标记物。 - 在37°c、10-120 转的温度下培养细胞 2-3分钟, 通过细胞分离溶液过度消化可能会损害细胞膜。
- 将细胞悬浮液转移到50毫升管中, 以 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 的速度将堵塞介质 10 ml 的离心管添加5分钟。
- 在 RT 中丢弃上清液并在6毫升的恢复培养基中重新悬浮细胞, 并孵育细胞30分钟。
- 在显微镜下检查10Μl 的细胞悬浮液, 以确保完全的细胞离解 (图 3)。
- 使用单元格计数器和 Trypan blue 对单元格进行计数。通常情况下, 我们期望 4 x10 5-6x10 6 细胞从四个 lg (一个样本)。
- 离心细胞在 0.4 x克(24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 3分钟在 rt, 并进行抗体染色。
5. 抗体染色
- 将最多 5x105个细胞添加到含有400ΜL 流式细胞仪缓冲液的2毫升管中。加入5μl 的明亮紫罗兰421抗鼠 CD326 (EpCAM) 和0.5μl 的幽灵红色 780 (活力染料)。
- 同时, 准备调整流式细胞仪补偿的控制:
负对照-1 (野生型小鼠的细胞)
从smaCreert2\ +: rosa26-tdmatofl/fl 的背景控制未染色的细胞
Cy7-780 染色细胞 (细胞从野生类型老鼠染色与幽灵红色780活力染料)
Epcam-明亮的紫罗兰 421 (细胞从野生类型的小鼠染色与 Epcam-辉煌紫罗兰421抗体)。
请注意:对于每个控制样品, 每400μl 的流式细胞仪缓冲液至少使用 1 x 10 5个电池。 - 加入每种试剂后, 通过移液彻底混合细胞。
- 用铝箔包裹管, 在4°C 下旋转管45分钟。
- 离心机样品在 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 在4°C 下3分钟。
- 在 FACS 缓冲液的1毫升中重新悬浮细胞。在补偿过程中清洗细胞以减少背景是很重要的。
6. 荧光活化细胞分选
- 将细胞悬浮液转移到5毫升的流式细胞仪管中, 并进行流式细胞仪分析。让细胞保持在冰上。
- 使用单色控件调整补偿。
- 使用适当的流式细胞仪 (见材料表), 通过100微米的喷嘴对 20 psi 的细胞进行排序。Go型策略18如图 1e和图 4所示。
- 根据下游程序将分类的细胞收集到介质、rna 后期、流式细胞仪或溶解缓冲液中 (图 1E,F)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
鼠标模型隔离 SMA + Mec 和 perices
既定协议允许将两个纯种群隔离: Mec 和 perictes 与 Lg 和 Smg (见表 1)。这两种类型的细胞具有不同的大小和外观。微血管周长, 在毛细血管壁周围发展 (图 5a), 并有一个平方状 (图 5A), 而 mec 围绕 lg 分泌阿奇尼, 有很长的过程, 并占据一个相对较大的区域 (图 5a, b).所描述的过程是基于基因细胞标记Sma+ 在Tm 诱导 sma Cret2\ +: rosa26-tdtomatofl/fl 小鼠株。此外, EpCAM 抗体使研究人员能够区分上皮 SMA+: 外胚层源 (MEC) 和 sma+epcam-内皮源细胞 (周生细胞)的 epcam + 细胞。
单细胞悬浮液的制备
LG 包含一个丝状的细胞外基质, 必须彻底消化。所提供的协议允许为流式细胞仪分析和进一步应用准备单个单元解决方案。离解单元格的示例如图3所示。
流式细胞仪的 MEC 和果皮分离
为了区分 Mec 和周细胞, 单个细胞被测得 EpCAM 的抗体, epcam 只检测上皮细胞。细胞的主要数量是由向前和侧面散射区域门控来确定的 (图 4 a)。通过绘制正向散射区域与宽度的图以及侧面散射区域与宽度的关系, 排除了双人 (图 4b)。死细胞排除是通过幽灵红色 780 (可行性染料) 完成的 (图 4C)。使用未标记的对照 (图 4e)、背景控制和带有单一原代抗体标记的抗体控制来确定背景噪声 (非特异性抗体结合), 并为最佳分离建立适当的补偿(图 4d)。数据分析是使用 FlowJo 软件进行的。
Mec 和 pericytes 是通过 DsRed 标记的。Mec和周细胞群中的 dsred + 暗淡 (未显示) 和 dsred+明亮细胞被检测到 (图 4d)。标记细胞的亮度可能取决于 SMA 表达的水平或 tm 注射19时的报告激活程度。只收集 ds 红色+明亮的细胞群, 因为只需要完全分化的细胞。DS 红色+暗淡细胞群需要进一步调查。
下游应用程序
众所周知, Mec 在外分泌腺体中发挥着重要的收缩功能。此外, 它们是非常塑料的细胞, 具有干细胞的特征。因此, 隔离的 Mec 可用于多个应用程序。例如, 细胞可以被培养, 用于 rna 分离或移植 (图 1f)12、20、21、22。
| 参数 | 泪腺 | 颌下腺 |
| 每个样本的鼠标数 | 2 | 1 |
| 每个样本的腺体数 | 4个 | 2 |
| 解剖腺体 | 与腮腺分离 | 与舌下腺分离 |
| 每个样品中胶原酶的浓度 | 6 mg/2 毫升 | 9毫升 |
| 酶解离后的近似细胞数 | 4x105-6x105 | 9x105-1.5x106 |
| 恢复步骤 (参见 "成年小鼠泪液腺体单细胞分离" 一节, 第15点) | 在6毫升恢复介质中重新悬浮细胞 | 在12毫升的恢复介质中重新悬浮细胞 |
| 抗体染色过程中的流式细胞仪缓冲液量 | 400μl | 2管 400μl;最好把细胞分成两管或三管, 每个管的管不超过 6x105 |
表 1: 从颌下腺 (smg) 分离细胞的协议的修改.该表描述了与小鼠 LG 的手术方法相比, 从小鼠 SMG 中分离 Mec 和 pericytes 所需的主要修改。
图 1: 实验的示意图表示.(A) smacreert2\ +:rosa26-tdtocotofl/fl 小鼠的 ip 注射 tm。(B) lg 或 smg 的隔离和切碎。(C) 用荧光显微镜分析细胞标记。(D) 多步酶消化制备单细胞溶液。在光镜下检查消化步骤以确保细胞从集群中释放是至关重要的。(E) 显示 sma + 明亮 ds red +/epcam + (mec) 和 Ds red + Bright\ Epcam-(pericytes) 的门控示例。(F) 收集的 mec 和周周细胞可接受不同的下游程序, 包括细胞培养、rna 分离和基因表达分析以及细胞移植。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: LG 隔离/粉碎的关键步骤.(A) 去除眼睛和耳朵之间的皮肤, 解剖 Lg, 染红的黄色圆圈表示 lg 的位置。(B) lg 解剖。黄色箭头指出泪腺和腮腺之间的区域。(C) lg 在消化介质中使用弯曲、钝器的剪刀切割。(D) 将碎组织转移到2毫升管中。黄色箭头描绘了转移所需的宽孔大小1毫升。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 共聚焦和差分干涉对比度 (dic)图片, 说明从小鼠 LG 离解的单细胞.(A-c) 单细胞从一个4个月大的smaCreert2\ +: rosa26-tdtousFl/fl 小鼠的两个 lg 中分离出来。细胞核被染成了 DAPI (蓝色)。白色箭头表示 SMA + (DS 红色) 细胞: Mec 或 pericytes。刻度杆 = 15μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 使用流式细胞仪鉴定小鼠 lg Mec 和果皮.(A) 通过正向和侧面散射区门控法测定 lg 细胞的主要种群。(B) 通过正向散射区域与宽度排除双片。(C) 通过幽灵红色 780 (活力染料) 排除死亡细胞。(D) mec (sma+ bridtcam+) 和 pericyte (sma+ brigtk\ EpCAM-) 种群, 基于 epcam 抗体染色而区分。(E) 未标记的控件 (来自野生类型鼠标的单元格)。在每个图形上提供了门控单元的%。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 显示从小鼠 LG 中分离的 mec 和果皮分布和形状差异的共聚焦图像.(A) 全贴装 lg, 贴有标记的细胞, 显示 mec 和果皮之间的分布差异。(B) mec 和果皮的形状不同。Pericyte 相对较小, 形状良好, 而 MEC 较大, 形状不规则, 工艺长。箭头 = Mec 和 pericytes。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这份手稿描述了一个协议的 MEC 和过氧化物隔离从 LG 和 SMG。该程序是基于 SMA 的遗传标记, 这是唯一可靠的 mec 和果皮生物标志物。
制定这一议定书的紧迫性是由于几乎完全没有文献强调 Mec 与小鼠 Lg 和 Smg 的隔离。虽然以前使用过基因标记, 使用 SMA-GFP 小鼠从3周大的年轻 lg 12 中分离 sma + 细胞, 但由于成年小鼠信号的部分丢失, 不允许使用这些年龄较大的小鼠进行细胞隔离。此外, gfp 标记的细胞在流式细胞仪应用23 中具有相对较高的背景, 并需要额外的补偿。相反, SMAcreert2\ +: rosa26-tdtocotoflocet 小鼠线显示没有或低背景和高水平的 sma 标记激活整个小鼠出生后的发展, 成年和老化。使用 Smacreert2\ +: rosa26-tdtomacotofl/fl 小鼠对于关注疾病进展或衰老的研究特别重要, 因为这些小鼠中的 sma + 细胞可以在疾病发展之前贴上标签, 以后再研究疾病的进展。该协议的另一个关键步骤是彻底的 LG 切碎和以下消化。此步骤可能会减少在流式细胞仪分析过程中获得的细胞数。总体而言, 分离和立即分析原代细胞也很重要, 因为在培养 24中保持的细胞的转录谱发生了重大变化。
此外, 所描述的 MEC 和从小鼠 Lg 中分离的过氧化物协议支持不同的下游程序。蛋白质、RNA 和 DNA 提取是可能的从两个单细胞群体, 虽然几个微生物样本需要处理平行或顺序增加细胞的数量。综合来看, 所获得的结果表明, 从不同的小鼠腺体组织中分离 MEC 和果皮是一种有效且相对简单的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明没有相互竞争的金融利益, 也没有任何其他利益的冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Ivo Kalajzic 博士为我们提供了 Smacreert2 小鼠株, Takeshi umazume 为小鼠尾随和基因分型, 马克雪莱获取了图2的专业图片。我们还感谢斯克里普斯科学编辑委员会和马克·雪莱的科学英语编辑。我们感谢斯克里普斯研究所流式细胞仪核心协助细胞分类, 并感谢罗宾·威伦布林博士就流式细胞仪数据分析提供的多次讨论建议。
这项工作得到了国家卫生研究院、国家眼科研究所的支持, 该研究所向 h. p. m. 提供了 5 R01 EY026202 和 1 R01 EY028983 至 h. p. m。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
