Summary
الغدة الدمعية (LG) لديها نوعين من الخلايا التعبير عن α-السلس العضلات الاكتين (αsma): الخلايا العضلية (mecs) و pericytes. MECs هي من أصل الجلد ، وجدت في العديد من الانسجه الغديه ، في حين بيريسيلات هي خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية من أصل باطن الجلد. هذا البروتوكول يعزل MECs و pericytes من murine LGs.
Abstract
الغدة الدمعية (LG) هي غده توبولواسينار التي تفرز طبقه مائية من فيلم المسيل للدموع. تتكون الشجرة الظهاريه من ال جي من اكينار ، الظهاريه الاقنيه ، والخلايا الظهاريه العضلية (MECs). Mecs صريح الفا العضلات الملساء الاكتين (αsma) ولها وظيفة مقلص. وهي موجودة في العديد من الأعضاء الغديه وهي من أصل الجلد الايكولوجي. الاضافه إلى ذلك ، ال جي يحتوي علي SMA + خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية من أصل اندوجلدي يسمي pericytes: مقلص الخلايا التي مغلف سطح أنابيب الاوعيه الدموية. بروتوكول جديد يسمح لنا لعزل كل من الmecs و pericytes من الكبار murine LGs والغدد فك (SMGs). ويستند البروتوكول علي وضع العلامات الوراثية من MECs و pericytes باستخدام SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl الماوس سلاله ، تليها اعداد ال جي تعليق خليه واحده لفرز الخلايا المنشطة فلوري (facs ). يسمح البروتوكول للفصل بين هذه الخلايا اثنين من السكان من أصول مختلفه استنادا إلى التعبير عن جزيء التصاق الخلية الظهاريه (EpCAM) من قبل MECs ، في حين pericytes لا تعبر عن EpCAM. ويمكن استخدام الخلايا المعزولة لزراعه الخلايا أو تحليل التعبير الجيني.
Introduction
الخلايا العضلية (MECs) موجودة في العديد من الغدد الدهنية بما في ذلك الدمعية ، اللعابية ، الحرديريان ، العرق ، البروستاتا ، والثدي. MECs هي نوع الخلية الفريدة التي تجمع بين الظهاريه والنمط الظاهري العضلات الملساء. Mecs اكسبرس α-السلس العضلات الاكتين (SMA) ولها وظيفة مقلص1،2. بالاضافه إلى MECs, الغدة الدمعية (LG) والغدة الفكه (SMG) يحتوي علي خلايا الاوعيه الدموية SMA + تسمي pericytes, وهي خلايا من أصل باطن الجلد التي مغلف سطح أنابيب الاوعيه الدموية3. علي الرغم من mecs و pericytes التعبير عن العديد من علامات ، SMA هو العلامة الوحيدة التي لم يتم التعبير عنها في الأخرى LG و smg الخلايا1،3.
خلال السنوات 40 الماضية ، أفادت عده مختبرات عن اختبارات لتفكك انسجه الغدد الطاردة المختلفة ، والتي تم فيها تطبيق النهج غير الانزيميه والانزيميه. في واحده من التقارير الاولي التي نشرت في 1980 ، ووصف فريتز والمؤلفين المشاركين بروتوكول لعزل نكفي اسيني القطط باستخدام الهضم متسلسلة في محلول كولاجيناز/التريبسين4. في 1989, hann والمؤلفين المشاركين تعديل هذا البروتوكول للعزل اسيني من lgs الفئران باستخدام خليط من كولاجيناز, حمض الهيالورونيك و dnase5. وفي 1990 ، نشرت الشركة العامة للمعاقين وزملاءها طريقه التفكك غير الانزيمي للغده الدمعية اسيني6. في وقت لاحق, في 1998, وعاد الزوكري والمؤلفين المشاركين إلى بروتوكول التفكك الانزيمي لمتابعه Ca2 +-التصوير علي LG و smg معزولة اسيني7. خلال العقد الماضي ، وقد تحولت الباحثين تركيزهم علي عزل الخلايا الجذعية/السلف من الغدد المستبدة. وصفت برينغل والمؤلفين المشاركين بروتوكول في 2011 لعزل الفئران SMG الخلايا الجذعية8. واستندت هذه الطريقة إلى عزل الساليسفيريس التي تحتوي علي الخلايا الجذعية ، والتي كانت محتفظ بها في الثقافة. وادعي أصحاب البلاغ ان تكاثر الخلايا التي تعبر عن العلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية يمكن ان يعزل عن هذه الساليسفيريس8. نشرت شاتوس والمؤلفين المشاركين البروتوكول لعزل الخلايا السلف من الفئران البالغين غير المصابين LGs باستخدام الهضم الانزيمي وجمع "المحررة" الخلايا9. في وقت لاحق, في 2015, أكرمان والمؤلفين المشاركين تعديل هذا الاجراء لعزل المفترض "الخلايا الجذعية الغدد الدمعية murine" ("mLGSCs") التي يمكن نشرها كثقافة أحاديه الطبقة علي عده مقاطع10. ومع ذلك ، لم يسمح اي من الإجراءات المذكورة أعلاه بالتمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية والسكان الفرديين للخلايا الظهاريه المعزولة. في 2016 ، نشرت جروبوفا والمؤلفين المشاركين اجراء لعزل الخلايا الجذعية/الprogenitor LG من الكبار murine LGs باستخدام FACS11. ومع ذلك ، لم يكن المقصود هذا البروتوكول لعزل MECs.
في الاونه الاخيره ، لقد أظهرنا اننا قادرون علي عزل SMA + الخلايا من الفئران SMA-GFP القديمة الأسبوع12. ومع ذلك ، في هذا الوقت لم نكن فصل السكان مختلفه من الخلايا SMA +. هنا انشانا اجراء جديد للعزل المباشر لل MECs المتمايزة و pericytes من LGs الكبار و SMGs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لمعهد سكريبس للبحوث. وبذلت جميع الجهود للتقليل إلى ادني حد من عدد الفئران ومعاناتهم. تلقت جميع الكائنات التجريبية نظاما غذائيا قياسيا مع امكانيه الوصول المجاني إلى مياه الصنبور.
ملاحظه: وترد الخطوات الرئيسية لل MEC والعزلة pericyte مخططه في الشكل 1A-F. ويرد في الجدول 1وصف لجميع الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا الاجراء.
1. الفئران ووسم الخلايا SMA
- استخدام الكبار (2-4 أشهر من العمر) تاموكسيفين-محبلي ، αSMA مدفوعة مراسل الفئران SmaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
ملاحظه: وقد تكرمت سلاله SMACreErt2 التي قدمها الدكتور ايفو كالاجزيتش13. Rosa26 الطماطمfl/fl (B6. تم شراؤها Cg-Gt (روزا) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/J، المعروف أيضا باسم Ai9) سلاله (# 007909) من مختبر جاكسون (ساكرامنتو ، كاليفورنيا). ووصفت الخلايا SMA + من قبل الاداره تاموكسيفين (TM) داخل الشركة. -
اعداد الحل تاموكسيفين
- تحضير زيت الذرة المصفي. استخدام فلتر فراغ 0.22 μm منذ زيت الذرة لزج.
- نقل 1 غرام من مسحوق TM من الزجاجة إلى أنبوب 50 mL. أضافه 1 مل من الايثانول إلى زجاجه, غطاء ويهز لشطف ثم أضافه إلى أنبوب 50 mL. كرر مره أخرى مع 1 مل آخر من الايثانول.
- أضافه زيت الذرة المصفاة لجعل 50 مل من محلول 20 ملغ/مل TM. دوامه الأنبوب ، والتفاف عليه في إحباط ، ووضعها في حمام المياه الاهتزاز أو الاهتزاز الحاضنة في 45 درجه مئوية.
- قد يستغرق حوالي 12-24 h لحل TM. من وقت لأخر ، وأزاله الأنبوب والتحقق من وجود اي بلورات المتبقية. مره واحده يتم حل TM تماما ، قسامه وتخزين في-80 درجه مئوية. ويمكن أعاده استخدامها في أذابه الجليد.
-
لتسميه الخلايا SMA + ، حقن الفئران داخل الصفاق (IP) مع TM في يومين متسلسلة.
- حقن 3-4 أسابيع SMA القديمةCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f اي الفئران الجنس مع TM في 100 μl/20 ز (أو 2 مغ/20 ز) وزن الجسم (الشكل1a). الفئران علي استعداد لاستخدامها لعزل الخلايا في 2-3 أيام بعد حقن TM الماضي. إذا لزم الأمر ، يمكن التضحية الفئران المحقونة في فترات أطول من الوقت بعد حقن TM.
ملاحظه: كضوابط للتعويض المناسب خلال FACS ، واحد نوع البرية (C57Bl/6) الماوس وواحد SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl الماوس لا حقن مع TM (مع "غير ملطخ" mecs) من نفس العمر سيكون مطلوبا. استخدام نفس الحسابات المقدمة ل 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl الفئران . لا حقن SMACreErt2/+: Rosa26 الطماطمfl/fl سوف تسمح بتقييم الخلفية dsred. سيكون الماوس C57Bl/6 بمثابه السيطرة السلبية علي الخلايا غير الملونة.
- حقن 3-4 أسابيع SMA القديمةCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f اي الفئران الجنس مع TM في 100 μl/20 ز (أو 2 مغ/20 ز) وزن الجسم (الشكل1a). الفئران علي استعداد لاستخدامها لعزل الخلايا في 2-3 أيام بعد حقن TM الماضي. إذا لزم الأمر ، يمكن التضحية الفئران المحقونة في فترات أطول من الوقت بعد حقن TM.
2. الحلول والمخازن المؤقتة
ملاحظه: ال LG هو الغدة الأصل الظهاريه التي تحتوي علي مصفوفة خارج الخلية التي تجعل التفكك من الخلايا الصعبة. لذلك ، ينصح باستخدام مزيج خاص من الانزيمات وعمليه الهضم متعددة الخطوات الموصوفة أدناه.
-
حل الأسهم من النوع الثاني (25x)
- ذوب 120 ملغ من مسحوق النوع الثاني في 2 مل من 50 mM HEPES/150 mM NaCl لاعداد حل الأسهم 25x (يجب ان يكون التركيز النهائي من الاستغناء 30 وحده/مل). وحدات لكل مليغرام قد تختلف تبعا لعدد من الفئران وتركيز الاستغناء ينبغي تعديل وفقا لذلك.
- اعداد 200 μl القسامات وتخزينها في-70 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أشهر أو 4 درجه مئوية لعده أيام. لا تجمد/أذابه الجليد من الاستغناء أكثر من مره لمنع تدهور الانزيم.
-
DNase نوع I الأسهم الحل
- حل 5 ملغ من نوع DNase مسحوق I في محلول 5 مل من 50 ٪ الجلسرين ، 20 مم تريس العازلة (pH 7.5) ، و 1 مم MgCl2 (يجب ان يكون تركيز المخزون حوالي 2000 وحده/مل). وحدات لكل مليغرام قد تختلف تبعا لعدد من الفئران ، التالي ينبغي تعديل تركيز DNase وفقا لذلك.
- تصفيه حل الأسهم باستخدام فلتر 0.22 μm وحقنه 10 مل.
- اعداد 200 μl القسامات وتخزينها في-70 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أشهر أو 4 درجه مئوية لعده أيام. لا تجمد/ذوبان أكثر من مره لمنع تدهور الانزيم.
-
الهضم المتوسطة
- إلى 10 مل من الجلوكوز المنخفض DMEM دون الجلوتامين ، أضافه 100 μL من تكمله ثقافة الخلية (علي سبيل المثال ، جلوساماكس ، انظر جدول المواد) لتخفيف 1:100.
- إلى 2 مل من الجلوكوز المنخفض DMEM مع تكمله ثقافة الخلية ، أضافه 6 ملغ من نوع كولاجيناز الأول وتخلط جيدا عن طريق التغليف (الانزيم علي الجليد الرطب) ، 160 μL من حل الأسهم ديداز (2.4 U/mL التركيز النهائي) ، 16 μL من نوع DNase الأسهم الحل (8 U/مل تركيز النهائي) ، و 12 μL من 1 M CaCl2 (6 مم التركيز النهائي).
ملاحظه: الكالسيوم مطلوب لزيادة النشاط الانزيمي14،15. يتم توفير جميع الحسابات لعزل الخلايا من أربعه الغدد الدمعية من اثنين من الفئران الكبار. حجم متوسط الهضم قد تختلف تبعا لكميه الانسجه وعدد من النسخ المتماثلة. لا تستخدم أكثر من 4 الغدد الدمعية من 2-4 أشهر الفئران القديمة لكل 2 مل المتوسطة.
-
حجب المتوسطة I
- إلى 25 مل من DMEM/F-12 ، أضافه (15 ٪ التركيز النهائي) ، 250 μL من تكمله ثقافة الخلية (انظر جدول المواد) لتخفيف 1:100 ، و 50 μl من 0.5 M أدتا pH 8.0 (1 مم تركيز النهائي).
ملاحظه: من الأنواع المختلفة من المتوسطة التي تمت مقارنتها لهذا البروتوكول DMEM/F-12 اعطي أفضل النتائج. وقد استخدمت هذه الوسيلة أيضا من قبل الباحثين الآخرين لعزل/الثقافة الظهاريه الخلايا16,17.
- إلى 25 مل من DMEM/F-12 ، أضافه (15 ٪ التركيز النهائي) ، 250 μL من تكمله ثقافة الخلية (انظر جدول المواد) لتخفيف 1:100 ، و 50 μl من 0.5 M أدتا pH 8.0 (1 مم تركيز النهائي).
-
حجب المتوسطة الثانية
- إلى 25 مل من تلفزيوني ، أضافه 50 μL من 0.5 M أدتا الأس الهيدروجيني 8.0 (1 مم التركيز النهائي).
-
الانتعاش المتوسطة
- إلى 2 مل من HBSS تستكمل مع 5 مم MgCl2، أضافه 100 μl من نوع dnase I الحل الأسهم إلى 100 U لكل 2 مل تركيز النهائي. تركيزات عاليه نسبيا من نوع DNase الأول مطلوب للحد من تراكم الخلايا الظهاريه.
-
مضان الخلية المنشطة الفرز (FACS) المخزن المؤقت
- إلى 486.5 mL من تلفزيوني ، أضافه 12.5 mL من المصل (2.5 ٪ التركيز النهائي) و 1 مل من 0.5 م أدتا الأس الهيدروجيني 8.0 (1 مم تركيز النهائي).
ملاحظه: يمكن تخزين المخزن المؤقت في 4 درجه مئوية لمده أقصاها 6 أسابيع.
- إلى 486.5 mL من تلفزيوني ، أضافه 12.5 mL من المصل (2.5 ٪ التركيز النهائي) و 1 مل من 0.5 م أدتا الأس الهيدروجيني 8.0 (1 مم تركيز النهائي).
3. حصاد الغدة الدمعية الماوس الكبار والتشريح المجهري
- تخدير الماوس عن طريق استنشاق ايزوفلواني (ضبط معدل تدفق ايزوفلواني أو تركيز إلى 5 ٪ أو أكبر) والتضحية بخلع عنق الرحم. اجراء التخدير والقتل الرحيم وفقا لتوصيات المؤسسة.
- باستخدام ملقط دقيق ومقص ، وأزاله الجلد بين العين والاذن (الشكل 2A).
- لتشريح LG ، سحب بلطف LG باستخدام ملاقط وفي الوقت نفسه خدش النسيج الضام حول LG باستخدام غيض حاد من مقص صغير لتحريره (الشكل 2B).
- تجنب قطع مع مقص ، كما تقع LG والغدد اللعابية نكفي قريبه جدا من بعضها البعض ، ويجب ان تكون منفصلة قبل تشريح. عندما يتم فصل ال جي والغدد نكفي ، وقطع LG باستخدام مقص. ضع الغدد في طبق 35 ملم مع 2 مل من الباردة تلفزيوني (الحفاظ علي الجليد) (الشكل 1B).
-
كما يتم تغطيه LG من قبل كبسوله النسيج الضام/المغلف ، وتقليم اي الدهون المحيطة والنسيج الضام تحت تشريح المجهر وأزاله كبسوله LG مع اثنين من ملقط.
- كرر هذه الخطوة لجميع الغدد.
- تحقق من قطعه صغيره من الانسجه تحت المجهر الفلورسنت لضمان وضع العلامات الخلية (الشكل 1C).
4. اعداد نظام التعليق الأحادي الخلية من ال جي
- نقل جميع LGs في صحن 35 ملم مع 0.5 mL من درجه حرارة الغرفة (RT) وسائل الهضم واللحم المفروم LGs باستخدام مقص صغير في قطع صغيره جدا (حوالي 0.2-1 μm2). عاده ، يستغرق حوالي 3 دقائق إلى اللحم المفروم 4 LGs (الشكل 2C).
- انقل الانسجه المفرومة إلى أنبوب سفلي مستدير بحجم 2 مل باستخدام طرف فلتر ماصه واسع التجويف. استخدم طرف ماصه عادي الحجم مع قطع الطرف (الشكل 2D).
- أضافه ما يصل إلى 2 مل الهضم المتوسطة وتخلط عن طريق عكس الأنبوب.
- وضع أنبوب في حاضنه الاهتزاز (أو الاهتزاز حمام المياه) ، في 37 درجه مئوية ، 100-120 دوره في الدقيقة لمده 90 دقيقه.
- كل 30 دقيقه ببطء الغدة الماصة قطع 20-30 مرات باستخدام تلميح فلتر 1,000 μL مع انخفاض حجم تتحمل (الشكل 2D). بعد الحضانة/تريلورييشن ، واتخاذ 10 μl قسامه وتفتيش تحت المجهر للمجموعات. إذا استمرت التكتلات ، استمر في الهضم.
- بعد 90 دقيقه ، تمرير عينه 2-3 مرات من خلال ابره حقنه الانسولين (31G) لمزيد من الإفراج عن الخلايا في التعليق.
ملاحظه: لا ينبغي ان تبقي قطع الغدة الدمعية المرئية في الحل بمجرد اكتمال عمليه الهضم (الشكل 1D). - نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل وأضافه نوع وسائل الاعلام حظر I إلى ما مجموعه 5 مل. عكس الأنبوب 2-3 مرات لخلط.
- تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية 70 μm وضعت علي أنبوب 50 mL. اغسل المصفاة باستخدام 1 مل من نوع الوسائط المانعة. كرر الخطوة 4.8 مره أخرى.
- عينات الطرد المركزي في 0.4 x g لمده 5 دقائق في RT.
- يستنشق العملاق. أعاده تعليق الخلايا في 2 مل من حجب المتوسطة النوع الثاني باستخدام طرف ماصه 1 مل ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL الدوار ؛ انظر جدول المواد) لمده 3 دقائق في RT.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 1 مل من حل مفرزه الخلية (انظر جدول المواد).
ملاحظه: هنا ، حل مفرزه الخلية هو Accutase ، وهو انزيم المنشا البحرية مع النشاط البروتيني والكولاجين الذي يفصل/ينفصل الخلايا لتحليل علامات سطح الخلية. - احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، في 100-120 rpm لمده 2-3 دقيقه. الإفراط في الهضم مع حل مفرزه الخلية قد يضر الاغشيه الخلوية.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 mL وأضافه 10 مل من حجب نوع المتوسطة ط. أنبوب الطرد المركزي في 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL الدوار ؛ انظر جدول المواد) لمده 5 دقائق.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 6 مل من وسائل الاعلام الانتعاش واحتضان الخلايا لمده 30 دقيقه في RT.
- تحقق 10 μL من تعليق الخلية تحت المجهر لضمان التفكك الخلية الكاملة (الشكل 3).
- عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا و التريكان الأزرق. عاده ، نتوقع 4 x 105-6 x 106 خلايا من أربعه lgs (عينه واحده).
- خلايا الطرد المركزي في 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL الدوار ؛ انظر جدول المواد) لمده 3 دقائق في RT والمضي قدما إلى تلطيخ الأجسام المضادة.
5. تلطيخ الأجسام المضادة
- أضافه ما يصل إلى 5 x105 الخلايا إلى أنبوب 2 مل تحتوي علي 400 μl من المخزن المؤقت facs. أضافه 5 μL من البنفسج الرائعة 421 المضادة للماوس CD326 (EpCAM) و 0.5 μL من شبح الأحمر 780 (صبغ القدرة علي البقاء).
- بالتوازي ، اعداد عناصر التحكم لضبط تعويضات الأصول الخاصة:
السيطرة السلبية-1 (الخلايا من الماوس نوع البرية)
التحكم في الخلفية الخلايا غير الملونة من SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl
Cy7-780 الخلايا الملونة (الخلايا من الفار نوع البرية الملطخة مع الشبح الأحمر 780 صبغ القدرة علي البقاء)
EpCAM-البنفسجي الرائعة 421 (الخلايا من النوع البرية الماوس الملون مع EpCAM-الرائعة البنفسج 421 الأجسام المضادة).
ملاحظه: لكل نموذج التحكم استخدام الحد ادني من 1 × 105 خلايا لكل 400 μl من المخزن المؤقت facs. - بعد أضافه كل كاشف الخلايا مزيج جيدا عن طريق التنضيد.
- التفاف أنبوب (ق) مع إحباط وتدوير أنابيب ل 45 دقيقه في 4 درجه مئوية.
- عينات الطرد المركزي في 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL الدوار ؛ انظر جدول المواد) لمده 3 دقائق في 4 ° c.
- أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. من المهم غسل الخلايا لتقليل الخلفية اثناء التعويض.
6. الفلورية الخلية المنشطة الفرز
- نقل تعليق الخلية في أنابيب FACS 5 مل والمضي قدما في تحليل FACS. إبقاء الخلايا علي الجليد.
- اضبط التعويض باستخدام عناصر تحكم أحاديه اللون.
- فرز الخلايا في 20 رطل من خلال فوهه 100 μm باستخدام التدفق الخلوي المناسب (انظر جدول المواد). ويرد strategy18 النابض في الشكل 1 هاء والشكل 4.
- جمع الخلايا المفروزة في المتوسطة ، RNA-في وقت لاحق ، FACS أو تحلل المخازن المؤقتة اعتمادا علي إجراءات المصب (الشكل 1E ، F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج الماوس لعزل SMA + MECs و pericytes
ويسمح البروتوكول المعمول به بعزل اثنين من السكان النقيين هما: MECs و pericytes من LGs و SMGs (انظر الجدول 1). هذان النوعان من الخلايا لهما حجم ومظهر مختلفين. Pericytes الاوعيه الدموية المجهرية ، وتطوير حول جدران الشعيرات الدموية (الشكل 5A) ولها شكل التربيعية (الشكل5a) ، في حين ان mecs تحيط acini LG سيكريتوري ، لديها عمليات طويلة وتحتل مساحة كبيره نسبيا (الشكل5a، B ). ويستند الاجراء الموصوف علي وضع العلامات الخلية الوراثية من SMA + في TM-المحرض SmaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl سلاله الماوس. Additonally, الأجسام المضادة EpCAM تسمح للباحثين لتمييز الظهاريهsma +: epcam + خلايا المنشا الجلدي (mecs) و sma + epcam- خلايا المنشا الجلدي الباطن (بيريسيلات).
اعداد تعليق الخلية الواحدة
ال جي يحتوي علي مصفوفة خارج الخلية الخيطية التي يجب ان يهضم جيدا. يسمح البروتوكول المتوفر باعداد حل خليه واحده لتحليل FACS والتطبيقات الأخرى. ويرد مثال الخلايا المنفصلة في الشكل 3.
العزلة والعزل pericyte من قبل FACS
للتمييز MECs من pericytes ، كانت ملطخه خلايا واحده مع الأجسام المضادة ل EpCAM ، الذي يكتشف فقط الخلايا الظهاريه. تم تحديد السكان الرئيسيين من الخلايا عن طريق الامام والجانب مبعثر المنطقة النابضة (الشكل 4A). استثنيت [دوليتس] كان ب يخطط ال إلى الامام مبعثر منطقه مقابل عرض ومع الجانب مبعثر منطقه مقابل عرض (شكل [4 ب]). وقد تم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق الشبح الأحمر 780 (صبغ القدرة علي البقاء) (الشكل 4C). تم استخدام عنصر تحكم غير مسمي (الشكل 4E) ، والتحكم في الخلفية والتحكم في الأجسام المضادة المسمية بجسم أساسي واحد لتحديد الضوضاء في الخلفية (ربط الأجسام المضادة غير المحددة) ولتحديد التعويض المناسب للفصل الأمثل بين الإشارات (الشكل 4D). وأجريت تحليلات للبيانات باستخدام برنامج FlowJo.
وقد بوابات ميكا و pericytes بواسطة الوسم DsRed. تم الكشف عن DsRed + dim (لا يظهر) و DsRed + الخلايا الساطعة داخل كل من MEC و pericyte الخلايا السكانية ( الشكل4d). سطوع الخلايا المسمية قد تعتمد علي مستوي التعبير SMA أو درجه التنشيط مراسل علي الحقن TM19. فقط [دس ] حمراء + ساطعه خليه تجميع كان جمعت بما ان فقط تماما يميز خلايا كانوا مطلوبه. الأحمرDS + الخلايا dim السكان تتطلب المزيد من التحقيق.
تطبيقات المصب
ومن المعروف جيدا ان mecs تلعب وظيفة مقلص مهمة في الغدد إفرازات. وعلاوة علي ذلك ، فهي خلايا بلاستيكية جدا ولها ملامح من الخلايا الجذعية. لذلك ، يمكن استخدام MECs معزولة في تطبيقات متعددة. مثلا, خلايا يستطيع كنت مثقفه, يستعمل ل [رنا] عزل أو ازدراع (شكل 1 [ف])12,20,21,22.
| المعلمه | الغدة الدمعية | الغدة فك |
| عدد الفئران لكل عينه | 2 | 1 |
| عدد الغدد لكل عينه | 4 | 2 |
| تشريح الغدد | منفصلة عن الغدة نكفي | منفصلة عن الغدة تحت اللسان |
| تركيز كولاجيناز لكل عينه | 6 مغ/2 مل | 9 مغ/2 مل |
| رقم الخلية التقريبي بعد التفكك الانزيمي | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| خطوه الانتعاش (انظر القسم "الكبار الفار الدمعية الغدة خليه واحده التفكك" ، النقطة 15) | أعاده تعليق الخلايا في 6 مل من وسائط الاسترداد | أعاده تعليق الخلايا في 12 مل من وسائط الاسترداد |
| حجم العازلة FACS اثناء تلطيخ الأجسام المضادة | 400 μL | 2 أنابيب بواسطة 400 μL; فمن الأفضل لتقسيم الخلايا إلى اثنين أو ثلاثه أنابيب ان كل أنبوب ليس أكثر من مساحة 6x105 |
الجدول 1: تعديلات بروتوكول عزل الخلايا من الغدة الفكه (SMG). يصف الجدول التعديلات الرئيسية المطلوبة لعزل MECs و pericytes من murine SMG بالمقارنة مع الاجراء ل murine LG.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للتجربة. (ا) حقن الملكية الفكرية من SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/flالفئران مع TM. (ب) العزلة والفرم لل LG أو smg. (ج) تحليل وضع العلامات الخلوية باستخدام المجهر الفلوري. (د) الهضم الانزيمي متعدد الخطوات لاعداد حل خليه واحده. من الضروري التحقق من خطوات الهضم تحت المجهر الضوئي لضمان الإفراج عن الخلايا من التكتلات. (ه) مثال علي النابضة تظهر SMA + مشرق Ds الأحمر +/epcam + (mecs) و Ds الأحمر + مشرق/epcam-(pericytes). (و) يمكن ان تخضع المجموعات التي تم جمعها من mecs و pericytes لإجراءات مختلفه في المصب بما في ذلك زراعه الخلايا وعزل الحمض الريبي النيبالي وتحليل التعبير الجيني وزرع الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات الحاسمة من ال جي العزلة/الفرم. (ا) أزاله الجلد بين العين والاذن لتشريح ال جي. الدائرة الصفراء المتقطعة تشير إلى موقع lg. (ب) تشريح ال جي. يشير راس السهم الأصفر إلى المنطقة بين الغدد الدمعية والنكفية. (ج) LG الانحناء في الهضم المتوسطة باستخدام مقص مع المنحني ، نهايات حاده. (د) نقل الانسجه المفرومة إلى أنبوب 2 مل. راس السهم الأصفر يصور حجم التجويف واسعه 1 مل المطلوبة لنقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تنسيق و تباين التداخل التفاضلي (DIC) صور توضح الخلايا المفردة المنفصلة من murine LG. (A-C) خلايا واحده معزولة من اثنين من lgs من واحد 4 الشهر القديم SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl الماوس. النوى ملطخه DAPI (الأزرق). الأبيض نصال دلاله SMA + (DS الأحمر) الخلايا: MECs أو pericytes. شريط مقياس = 15 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد الmurine LG mecs و pericytes باستخدام facs. (ا) تحديد السكان الرئيسيين في خلايا ال جي من خلال المناطق الاماميه والمبعثرة الجانبية. (ب) استبعاد المشككين عبر منطقه مبعثرة إماميه مقابل العرض. (ج) استبعاد الخلايا الميتة عن طريق الشبح الأحمر 780 (صبغ القدرة علي البقاء). (د) MEC (sma + برايت/epcam +) و pericyte (sma + مشرق/epcam-) السكان متميزة علي أساس تلطيخ مع الأجسام المضادة epcam. (ه) التحكم غير المسمي (الخلايا من الفاره من النوع البري). في كل مؤامرة يتم توفير% من الخلايا المسورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الصور المنسقة التي تظهر فرقا في التوزيع والشكل بين الmecs و pericytes المعزولة عن murine LG. (ا) جبل كامل اعداد LG مع الخلايا المسمية تبين الفرق في التوزيع بين MEC و pericytes. (ب) يختلف شكل MEC و pericyte. Pericyte صغيره نسبيا ولها شكل ترافق ، في حين ان MEC كبيره ولها شكل غير منتظم والعديد من العمليات الطويلة. نصال = MECs و pericytes. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت هذه المخطوطة بروتوكولا للعزل والعزلة الفوقية من LG و SMG. واستند هذا الاجراء علي وضع العلامات الوراثية من SMA ، الحيوية الوحيدة الموثوقه من MECs و pericytes.
وكان الدافع وراء الحاجة الملحة لوضع هذا البروتوكول هو الغياب التام تقريبا للأدب الذي يسلط الضوء علي عزله MECs من murine LGs و SMGs. علي الرغم من ان وضع العلامات الوراثية كانت تستخدم سابقا ، وذلك باستخدام الفئران SMA-GFP لعزل SMA + الخلايا من الشباب لمده ثلاثه أسابيع LGs12، فانه لم يسمح باستخدام هذه الفئران القديمة لعزل الخلية بسبب فقدان جزئي للاشاره في الفئران الكبار. الاضافه إلى ذلك ، تعطي الخلايا المسمية GFP خلفيه عاليه نسبيا في تطبيقات FACS23 وتتطلب تعويضات اضافيه. وعلي النقيض من ذلك ، CreErt2 sma/+: Rosa26-tdtomatofl/fl خط الماوس يظهر اي أو خلفيه منخفضه ومستويات عاليه من التنشيط الوسم sma عبر الماوس التنمية بعد الولادة ، والبلوغ والشيخوخة. استخدام SmaCreErt2/+: Rosa26 الطماطمfl/fl الماوس مهم بشكل خاص للدراسات التي تركز علي تطور المرض أو الشيخوخة ، منذ SMA + الخلايا في هذه الفئران يمكن وصفها قبل التنمية المرض ودرست في وقت لاحق عندما يتطور المرض/الشيخوخة. خطوه حاسمه أخرى من البروتوكول هي دقيقه LG التنميق والهضم التالية. قد تقلل هذه الخطوة رقم الخلية التي تم الحصول عليها اثناء تحليل FACS. وعموما ، فان العزلة والتحليل الفوري للخلايا الاوليه مهم أيضا بسبب التغيرات الكبيرة في الملامح الجانبية للخلايا المحتفظ بها في الثقافة24.
بالاضافه إلى ذلك ، البروتوكول الموصوف ل MEC و pericyte العزلة من murine LGs تمكن إجراءات المصب مختلفه. البروتين, الحمض النووي الريبي واستخراج الدنا ممكنة من كل من السكان خليه واحده, علي الرغم من ان العديد من الفئران/عينات تحتاج إلى معالجتها بالتوازي أو بالتتابع لزيادة عدد الخلايا. معا ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها طريقه فعاله ومباشره نسبيا ل MEC والعزلة pericyte من الانسجه الغديه المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح المالية ولا تنازع اي مصالح أخرى.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ايفو كالاجزيتش لتزويدنا بسلاله الماوس SMACreErt2 ، تاكيشي umazume لتعقب الماوس والتنميط الجيني ، مارك شيلي للحصول علي صور احترافية لشكل 2. ونشكر أيضا مجلس سكريبس للمحررين العلميين ومارك شيلي للتحرير العلمي للانجليزيه. ونحن ممتنون لمعهد البحوث سكريبس التدفق الخلوي الاساسيه للمساعدة في فرز الخلايا والدكتور روبن ويلينجلب لمناقشات متعددة/المشورة بشان تحليل البيانات FACS.
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، والمنح معهد العين الوطنية 5 R01 EY026202 و 1 R01 EY028983 إلى H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
