Summary
A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.
Abstract
A glândula lacrimal (LG) é uma glândula tubuloacinar exócrina que secreta uma camada aquosa de filme lacrimogêneo. A árvore epitelial da LG é composta de células acinares, Ductais epiteliais e mioepiteliais (MECs). MECS expressam o actina do músculo liso alfa (αsma) e têm uma função contrátil. Eles são encontrados em múltiplos órgãos glandulares e são de origem ectodérmica. Além disso, o LG contém células do músculo liso vascular SMA + de origem endodérmica chamada pericytes: células contrátil que envolvem a superfície dos tubos vasculares. Um novo protocolo nos permite isolar ambos os MECS e pericitos de LGS murino adulto e glândulas submandibulares (SMGS). O protocolo baseia-se na rotulagem genética de MECS e pericitos usando a cepa smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse, seguida da preparação da suspensão de célula única LG para triagem de células ativadas por fluorescência (FACS ). O protocolo permite a separação destas duas populações da pilha de origens diferentes baseadas na expressão da molécula epithelial da adesão da pilha (epcam) por MECS, visto que os pericitos não expressam epcam. Células isoladas podem ser usadas para o cultivo de células ou análise de expressão gênica.
Introduction
As células mioepiteliais (MECs) estão presentes em muitas glândulas exócrinas, incluindo lacrimal, salivar, harderiana, suor, próstata e mamária. Os MECs são um tipo de célula único que combina um fenótipo epitelial e um músculo liso. MECS Express α-músculo liso actina (SMA) e tem uma função contrátil1,2. Além dos MECs, a glândula lacrimal (LG) e a glândula submandibular (SMG) contém células vasculares de SMA + denominadas pericytes, que são células de origem endodérmica que envolvem a superfície dos tubos vasculares3. Embora MECS e pericitos expressem muitos marcadores, SMA é o único marcador que não é expresso em outras células LG e SMG1,3.
Nos últimos 40 anos, vários laboratórios relataram ensaios para dissociação de diferentes tecidos da glândula exócrina, nos quais foram aplicadas abordagens não enzimáticas e enzimáticas. Em um dos primeiros relatórios publicados em 1980, Fritz e coautores descreveram um protocolo para isolar o ácinos felino do parotid usando a digestão seqüencial em uma solução do Collagenase/Trypsin4. Em 1989, Hann e os coautores ajustaram este protocolo para o isolamento do ácinos dos LGS do rato usando uma mistura do Collagenase, do hialuronidase e do DNase5. Em 1990, Cripps e colegas publicaram o método de dissociação não enzimática da glândula lacrimal ácinos6. Mais tarde, em 1998, zoukhri e coautores retornaram a um protocolo de dissociação enzimática para acompanhamento de CA2 +-imagem em LG e SMG isolado ácinos7. Na última década, os pesquisadores voltaram seu foco no isolamento de células-tronco/progenitoras de glândulas exócrinas. Pringle e coautores descreveram um protocolo em 2011 para isolamento de células-tronco SMG do mouse8. Este método foi baseado no isolamento de salispheres contendo células-tronco, que foram mantidos em cultura. Os autores reivindicaram que as pilhas proliferating que expressam marcadores pilha-associados da haste poderiam ser isoladas destes salispheres8. Shatos e coautores publicaram o protocolo para o isolamento de células progenitoras de LGs de ratos adultos não lesionados usando digestão enzimática e coletando células "liberadas"9. Mais tarde, em 2015, Ackermann e os coautores ajustaram este procedimento para isolar as "pilhas de haste murine da glândula lacrimal presuntivo" ("mlgscs") que poderiam ser propagadas como uma cultura da mono-camada sobre passagens múltiplas10. No entanto, nenhum dos procedimentos antes mencionados permitiu distinguir subtipos celulares e populações individuais de células epiteliais isoladas. Em 2016, gromova e coautores publicaram um procedimento para a isolação de pilhas da haste/progenitor de LG dos LGS murino adultos usando FACS11. Entretanto, este protocolo não foi pretendido isolar MECs.
Recentemente, temos demonstrado que somos capazes de isolar as células SMA + de 3 semanas de idade SMA-GFP camundongos12. Entretanto, neste tempo nós não separamos populações diferentes de pilhas de SMA +. Aqui nós estabelecemos um procedimento novo para o isolamento direto de MECS e de pericitos diferenciados dos LGS e dos SMGs adultos.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do National Institute of Health (NIH) e foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do Scripps Research Institute. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de camundongos e seu sofrimento. Todos os animais experimentais receberam uma dieta padrão com acesso livre à água da torneira.
Nota: Os principais passos para o MEC e o isolamento de pericyte são delineados esquematicamente na Figura 1a-F. Todos os reagentes e equipamentos utilizados para este procedimento estão descritos na tabela 1.
1. camundongos e rotulagem das células SMA
- Use adulto (2-4 meses velho) tamoxifen-inducible, αSMA driven repórter camundongos smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL.
Nota: A cepa smaCreErt2 foi gentilmente cedido pelo Dr. Ivo kalajzic13. Rosa26-TdTomatofl/FL (B6. CG-gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/j, também conhecido como Ai9) estirpe (# 007909) foram comprados de Jackson Laboratory (Sacramento, CA). As pilhas de SMA + foram etiquetadas pela administração intraperitoneal de tamoxifeno (TM). -
Preparação da solução de tamoxifeno
- Prepare o óleo de milho filtrado. Use o filtro de vácuo de 0,22 μm desde que o óleo de milho é viscoso.
- Transfira 1 g de pó TM do frasco para um tubo de 50 mL. Adicione 1 mL de etanol ao frasco, tampe e agite-o para enxaguar, em seguida, adicione a um tubo de 50 mL. Repita mais uma vez com mais 1 mL de etanol.
- Adicione o óleo de milho filtrado para fazer 50 mL de uma solução de 20 mg/mL TM. Vortex o tubo, enrole-o na folha, e põr o em um banho de água de agitação ou em uma incubadora de agitação em 45 ° c.
- Pode demorar cerca de 12-24 h para dissolver o TM. De vez em quando, retire o tubo e verifique se há cristais restantes. Uma vez que a TM é completamente dissolvido, alíquota e armazenar em-80 ° c. Uma alíquota descongelada pode ser reutilizada.
-
Para etiquetar pilhas de SMA +, injete ratos via intraperitoneal (IP) com TM em dois dias sequenciais.
- Injetar 3-4 semanas de idade smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f qualquer rato de género com TM a 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de peso corporal (Figura 1a). Os camundongos estão prontos para serem usados para isolamento celular em 2-3 dias após a última injeção de TM. Se necessário, os camundongos injetados podem ser sacrificados em períodos mais longos de tempo após a injeção de TM.
Nota: Como controles para a compensação adequada durante FACS, um tipo selvagem (C57Bl/6) mouse e um smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse não injetado com TM (com "não manchado" MECS) da mesma idade seria necessário. Use os mesmos cálculos fornecidos para 2 smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL camundongos. Não injetado smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL permitirá a avaliação do fundo dsred. O C57Bl/6 mouse servirá como um controle negativo de células não manchadas.
- Injetar 3-4 semanas de idade smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f qualquer rato de género com TM a 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de peso corporal (Figura 1a). Os camundongos estão prontos para serem usados para isolamento celular em 2-3 dias após a última injeção de TM. Se necessário, os camundongos injetados podem ser sacrificados em períodos mais longos de tempo após a injeção de TM.
2. soluções e buffers
Nota: A LG é uma glândula de origem epitelial que contém uma matriz extracelular que dificulta a dissociação das células. Portanto, usando uma combinação especial de enzimas e um processo de digestão multistep descrito abaixo é recomendado.
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Dispase tipo II solução de ações (25x)
- Dissolver 120 mg de Dispase tipo II em pó em 2 mL de 50 mM HEPES/150 mM NaCl para preparar uma solução de stock de 25x (a concentração final de Dispase deve ser de 30 unidades/mL). As unidades por miligrama podem variar dependendo do número de camundongos e a concentração do Dispase deve ser ajustada em conformidade.
- Prepare 200 μL de alíquotas e guarde-os a-70 ° c por até 6 meses ou 4 ° c durante vários dias. Não congele/descongelar a alíquota de Dispase mais de uma vez para evitar a degradação da enzima.
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DNase tipo I solução de estoque
- Dissolver 5 mg de DNase tipo I em pó numa solução de 5 mL de 50% de glicerol, 20 mM de tampão Tris (pH 7,5) e 1 mM de MgCl2 (a concentração de ações deve ser de aproximadamente 2000 unidades/ml). As unidades por miligrama podem variar dependendo do número de camundongos e, assim, a concentração de DNase deve ser ajustada em conformidade.
- Filtre a solução de estoque usando um filtro de 0,22 μm e uma seringa de 10 mL.
- Prepare 200 μL de alíquotas e guarde-os a-70 ° c por até 6 meses ou 4 ° c durante vários dias. Não congele/descongelar mais de uma vez para evitar a degradação da enzima.
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Meio de digestão
- Para 10 mL de DMEM baixa glicose sem glutamina, adicionar 100 μL de suplemento de cultura celular (por exemplo, Glutamax, ver tabela de materiais) para uma diluição de 1:100.
- Para 2 mL de DMEM baixa glicose com suplemento de cultura celular, adicionar 6 mg de Collagenase tipo I e misture bem com pipetagem (enzima em gelo molhado), 160 μL de solução de estoque Dispase (2,4 U/mL de concentração final), 16 μL de DNase tipo I solução de estoque (8 U/mL de concentração final) e 12 μL de 1 M de CaCl2 (6 mm de concentração final).
Nota: O cálcio é necessário para aumentar a atividade enzimática14,15. Todos os cálculos são fornecidos para a isolação das pilhas de quatro glândulas lacrimal de dois ratos adultos. O volume de meio de digestão pode variar dependendo da quantidade de tecido e número de repetições. Não use mais de 4 glândulas lacrimais de 2-4 meses de ratos velhos por 2 mL de meio.
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Meio de bloqueio I
- Para 25 mL de DMEM/F-12, adicionar FBS (15% concentração final), 250 μL de suplemento de cultura celular (ver tabela de materiais) para uma diluição de 1:100, e 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentração final).
Nota: Dos diferentes tipos de médias que foram comparados para este protocolo DMEM/F-12 deu os melhores resultados. Este meio também tem sido utilizado por outros pesquisadores para isolar/cultura células epiteliais16,17.
- Para 25 mL de DMEM/F-12, adicionar FBS (15% concentração final), 250 μL de suplemento de cultura celular (ver tabela de materiais) para uma diluição de 1:100, e 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentração final).
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Bloqueio médio II
- Para 25 mL de PBS, adicionar 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentração final).
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Meio de recuperação
- Para 2 mL de HBSS suplementado com 5 mM MgCl2, adicionar 100 ΜL de DNase tipo I solução de ações para 100 U por 2 ml de concentração final. As concentrações relativamente elevadas de DNase-tipo I são exigidas para reduzir a agregação de pilhas epithelial.
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Buffer de triagem de célula ativada por fluorescência (FACS)
- Para 486,5 mL de PBS, adicionar 12,5 mL de soro (2,5% concentração final) e 1 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentração final).
Nota: O tampão pode ser armazenado em 4 ° c por um máximo de 6 semanas.
- Para 486,5 mL de PBS, adicionar 12,5 mL de soro (2,5% concentração final) e 1 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentração final).
3. colheita e microdissecção da glândula lacrimal do rato adulto
- Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (ajustar a taxa de fluxo de isoflurano ou a concentração para 5% ou maior) e sacrificar por luxação cervical. Realize anestesia e eutanásia de acordo com as recomendações institucionais do IACUCs.
- Usando pinças finas e tesouras, retire a pele entre o olho e a orelha (Figura 2a).
- Para dissecar um LG, puxe suavemente LG usando pinças e, ao mesmo tempo arranhar o tecido conjuntivo em torno da LG usando a ponta afiada de pequenas tesouras para liberá-lo (Figura 2b).
- Evite cortar com tesouras, porque as glândulas salivares do LG e do parotid são situadas muito perto de se e devem ser separadas antes da dissecção. Quando a LG e as glândulas parótidas são separadas, cortar o LG fora usando tesouras. Coloque as glândulas em um prato de 35 mm com 2 mL de PBS frio (manter no gelo) (Figura 1b).
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Como a LG é coberta por uma cápsula do tecido conjuntivo/envelope, aparar qualquer tecido adiposo e conjuntivo circundante um microscópio de dissecação e remover a cápsula LG com dois fórceps.
- Repita este passo para todas as glândulas.
- Verifique um pequeno pedaço de tecido microscópio fluorescente para garantir a rotulagem celular (Figura 1C).
4. preparação da suspensão de célula única LG
- Transfira todos os LGs para um prato de 35 mm com 0,5 mL de meios de digestão de temperatura ambiente (RT) e mince LGs usando pequenas tesouras em pedaços muito pequenos (aproximadamente 0,2-1 μm2). Normalmente, demora cerca de 3 min para mince 4 LGs (Figura 2C).
- Transfira o tecido picado para um tubo inferior redondo de 2 mL usando uma ponta de filtro de pipeta de furo largo. Use uma ponta de pipeta de tamanho normal com a ponta cortada (Figura 2D).
- Adicione até 2 mL de meio de digestão e misture invertendo o tubo.
- Coloque o tubo em uma incubadora de agitação (ou agitando o banho de água), em 37 ° c, 100-120 rpm para 90 minutos.
- Cada 30 min lentamente pipeta glândula peças 20-30 vezes usando uma ponta de filtro 1.000 μL com o tamanho do furo decrescente (Figura 2D). Após a incubação/trituração, tome uma alíquota de 10 μL e inspecione um microscópio para aglomerados. Se os clusters persistirem, continue a digestão.
- Após 90 min, passe a amostra 2-3 vezes através de uma agulha de seringa de insulina (31G) para liberar as células em suspensão.
Nota: Nenhuma peça de glândula lacrimal visível deve permanecer na solução após a conclusão da digestão (Figura 1D). - Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL e adicione o tipo de mídia de bloqueio I a um total de 5 mL. Inverta o tubo 2-3 vezes para misturar.
- Passe a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 μm colocado em um tubo de 50 mL. Lave o filtro com 1 mL de tipo de mídia de bloqueio I. Repita o passo 4,8 novamente.
- Centrifugue amostras em 0,4 x g por 5 minutos em RT.
- Aspirar o sobrenadante. Re-suspender as células em 2 mL de bloqueio médio tipo II usando uma ponta de pipeta de 1 mL e transferir a suspensão da célula em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Centrifugar as células a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) durante 3 min em RT.
- Aspirar sobrenadante e re-suspender as células em 1 mL de solução de descolamento celular (ver tabela de materiais).
Nota: Aqui, a solução do destacamento da pilha é accutase, uma enzima da marinho-origem com atividade proteolíticas e gelatinolitica que separa/dissociates pilhas para a análise de marcadores de superfície da pilha. - Incubar células a 37 ° c, a 100-120 rpm por 2-3 min. excesso de digestão com solução de descolamento celular pode danificar as membranas celulares.
- Transfira a suspensão da pilha em um tubo de 50 mL e adicione-o acima de 10 mL do tipo médio de bloqueio I. tubo de centrifugação a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) por 5 min.
- Descarte o sobrenadante e Resuspenda as células em 6 mL de meios de recuperação e incubar células por 30 min em RT.
- Verificar 10 μL de suspensão celular o microscópio para garantir a dissociação completa da célula (Figura 3).
- Contagem de células usando um contador de células e azul de trypan. Normalmente, esperamos 4 x 105-6 x 106 células de quatro LGS (uma amostra).
- Células centrífugas a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) durante 3 min em RT e proceder à coloração de anticorpos.
5. coloração do anticorpo
- Adicione até 5 x105 células a um tubo de 2 ml contendo 400 μL de tampão FACS. Adicionar 5 μL de violeta brilhante 421 anti-mouse CD326 (EpCAM) e 0,5 μL de Ghost Red 780 (viabilidade corante).
- Em paralelo, prepare os controles para ajustar a compensação FACS:
Negativo Control-1 (células do tipo Wild mouse)
Controle de fundo células não manchadas de smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL
Cy7-780 células manchadas (células do tipo Wild mouse manchado com o Ghost Red 780 viabilidade corante)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (células do rato tipo selvagem coradas com o anticorpo EpCAM-Brilliant Violet 421).
Nota: Para cada amostra de controle, use um mínimo de 1 x 105 células por 400 μL de tampão FACS. - Após a adição de cada reagente misturar as células completamente por pipetagem.
- Enrole o tubo (s) com a folha e gire os tubos para 45 min a 4 ° c.
- Amostras de centrifugação a 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; ver tabela de materiais) durante 3 min a 4 ° c.
- Resuspender células em 1 mL do buffer FACS. É importante para lavar as células para diminuir o fundo durante a compensação.
6. fluorescência ativada célula de triagem
- Transfira a suspensão da pilha em 5 tubos de mL FACS e prossiga com a análise de FACS. Mantenha as células no gelo.
- Ajuste a compensação usando controles de cor única.
- Classifique as células a 20 psi através de um bocal de 100 μm usando o citometro de fluxo apropriado (ver tabela de materiais). A gating strategy18 é mostrada na Figura 1e e na Figura 4.
- Colete células classificadas em meio, RNA-mais tarde, FACS ou buffers de Lise dependendo dos procedimentos downstream (Figura 1e, F).
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Representative Results
Modelo do rato para isolar sma + MECS e pericitos
O protocolo estabelecido permite o isolamento de duas populações puras: MECS e pericitos de LGS e SMGs (ver tabela 1). Esses dois tipos de células têm um tamanho e aparência diferentes. Os pericytes microvasculares, desenvolvem-se em torno das paredes dos capilares (Figura 5a) e têm uma forma quadrada (Figura 5b), enquanto os MECS cercam o acini secretora da LG, têm processos longos e ocupam uma área relativamente grande (Figura 5a, B ). O procedimento descrito baseia-se na rotulagem de células genéticas de SMA + no TM-inducible smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL estirpe do rato. Additonally, os anticorpos de EpCAM permitem que os investigadores distingam o SMA+: epcam+ pilhas de origem ectodérmica (MECS) e sma+epcam- pilhas da origem endodermal (pericytes).
Preparação da suspensão de uma única célula
O LG contém uma matriz extracelular filamentosa que deve ser digerida completamente. O protocolo fornecido permite a preparação de uma única solução da pilha para a análise de FACS e umas aplicações mais adicionais. O exemplo de células dissociadas é mostrado na Figura 3.
MEC e pericyte isolamento por FACS
Para distinguir MECs dos pericytes, as únicas pilhas foram manchadas com o anticorpo a EpCAM, que detecta somente pilhas epithelial. A população principal das células foi determinada pela área de dispersão frente e lateral (figura 4a). Os doublets foram excluídos por plotar a área de dispersão direta versus largura e com a área de dispersão lateral versus largura (Figura 4B). A exclusão de células mortas foi feita via Ghost Red 780 (corante de viabilidade) (Figura 4C). Um controle sem rótulo (Figura 4E), controle de fundo e controle de anticorpos rotulados com um único anticorpo primário foram usados para determinar o ruído de fundo (ligação de anticorpos não específicos) e para estabelecer uma compensação adequada para a separação ideal entre os sinais (Figura 4D). As análises de dados foram realizadas com o uso do software FlowJo.
Os MECS e os pericitos foram fechados pela rotulagem de dsred. DsRed+ Dim (não mostrado) e dsred+ células brilhantes em ambas as populações de células de pericyte e MEC foram detectadas (Figura 4D). O brilho das células rotuladas pode depender do nível de expressão da SMA ou grau de ativação do repórter na injeção TM19. Somente DS Red+ população de células brilhantes foram coletadas, uma vez que apenas células totalmente diferenciadas foram necessárias. As populações DS Red+ Dim Cell necessitam de investigação adicional.
Aplicações a jusante
É bem sabido que os MECs desempenham uma importante função contrátil nas glândulas exócrinas. Além disso, são pilhas muito plásticas e têm características de pilhas de haste. Portanto, os MECs isolados podem ser usados em várias aplicações. Por exemplo, as células podem ser cultivadas, utilizadas para o isolamento ou transplante de RNA (Figura 1F)12,20,21,22.
| Parâmetro | Glândula lacrimal | Glândula submandibular |
| Número de camundongos por amostra | 2 | 1 |
| Número de glândulas por amostra | 4 | 2 |
| Glândulas de dissecção | Separe da glândula de parotid | Separar da glândula sublingual |
| Concentração de colagenase por amostra | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Número aproximado de células após dissociação enzimática | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Etapa de recuperação (consulte a seção "dissociação de células simples do rato adulto da glândula lacrimal", ponto 15) | Resuspender células em 6 ml de mídia de recuperação | Resuspender células em 12 mL de mídia de recuperação |
| Volume do tampão de FACS durante a mancha do anticorpo | 400 μL | 2 tubos por 400 μL; é melhor dividir as células em dois ou três tubos que cada tubo não tem mais do que 6x105 |
Tabela 1: modificações do protocolo para isolamento de células da glândula submandibular (SMG). A tabela descreve as modificações principais exigidas para isolar MECS e pericitos do SMG murino em comparação com o procedimento para o LG murino.
Figura 1: uma representação esquemática do experimento. (A) injeções de IP dos ratos smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FLcom TM. (B) isolamento e picar da LG ou SMG. (C) análise de rotulagem celular utilizando microscópio de fluorescência. (D) digestão enzimática de várias etapas para preparar uma solução de célula única. É crítico verific etapas da digestão um microscópio claro para assegurar-se de que as pilhas estejam liberadas dos conjuntos. (E) exemplo de gating mostrando sma + Bright DS vermelho +/epcam + (MECS) e DS Red + Bright/epcam-(pericytes). F) os MECS e os pericitos recolhidos podem ser submetidos a diferentes procedimentos a jusante, incluindo cultivo celular, isolamento de RNA e análise da expressão gênica e transplante de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas críticas do isolamento/picagem da LG. (A) remoção da pele entre o olho e a orelha para dissecar a LG. círculo amarelo tracejado indica a localização da LG. (B) dissecção LG. A Arrowhead amarela aponta a área entre as glândulas lacrimal e do parotid. (C) LG picar no meio da digestão usando tesouras com extremidades curvadas, Blunt. D) transferência do tecido picado para o tubo de 2 ml. A seta amarela retrata o tamanho de furo largo 1 ml de ponta exigida para transferir. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: confocal e contraste de interferência diferencial (DIC) imagens ilustrando células individuais dissociadas da LG murino. (A-C) únicas células isoladas de dois LGS de um 4 meses de idade smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse. Os núcleos são manchados com DAPI (azul). As pontas de seta brancas denotam as células SMA + (DS Red): MECs ou pericytes. Barra de escala = 15 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: identificação do LG MECS murino e pericitos utilizando FACS. (A) determinação da população principal de células LG por gating frente e área de dispersão lateral. (B) exclusão de doublets através da área de dispersão direta versus largura. (C) exclusão de células mortas via Ghost Red 780 (corante de viabilidade). (D) populações de MEC (SMA+ Bright/epcam+) e de pericyte (SMA+ Bright/epcam-) distinguidas com base na coloração com anticorpo epcam. (E) controle sem rótulo (células do mouse tipo selvagem). Em cada parcela, o% de células bloqueadas é fornecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens confocais mostrando diferença na distribuição e na forma entre os MECS e os pericitos isolados da LG murina. (A) montagem inteira preparação da LG com células rotuladas mostrando diferença na distribuição entre MEC e pericytes. (B) a forma do MEC e do pericyte é diferente. O pericyte é relativamente pequeno e tem a forma destruídos, visto que o MEC é grande e tem a forma irregular e diversos processos longos. ARROWHEADS = MECs e pericytes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este manuscrito descreveu um protocolo de isolamento MEC e pericyte da LG e SMG. Este procedimento foi baseado na rotulagem genética de SMA, o único biomarcador de confiança de MECs e pericytes.
A urgência de desenvolver este protocolo foi motivada pela ausência quase total de literatura destacando o isolamento de MECs de LGs murino e SMGs. Embora a rotulagem genética fosse usada previamente, usando ratos de SMA-GFP para isolar pilhas de SMA + dos jovens três-week-old LGs12, não permitiu o uso estes ratos mais velhos para a isolação da pilha devido à perda parcial de sinal em ratos adultos. Além disso, as células rotuladas por GFP dão um fundo relativamente alto em aplicativos FACS23 e exigem compensações adicionais. Em contraste, o smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse linha mostra não ou um fundo baixo e altos níveis de ativação de rotulagem sma ao longo do mouse pós-natal desenvolvimento, idade adulta e envelhecimento. O uso do smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse é especialmente importante para estudos focados na progressão da doença ou no envelhecimento, uma vez que as células sma + nesses camundongos podem ser rotuladas antes do desenvolvimento da doença e estudadas mais tarde, quando progressão da doença/envelhecimento. Outra etapa crítica do protocolo é completa LG picar ea digestão seguinte. Esta etapa pode reduzir o número de célula obtido durante a análise de FACS. Globalmente, o isolamento e a análise imediata das células primárias também são importantes devido a mudanças significativas nos perfis transcricional das células mantidas na cultura24.
Adicionalmente, o protocolo descrito para o MEC e o isolamento do pericyte dos LGS murino permitem procedimentos a jusante diferentes. As extrações da proteína, do RNA e do ADN são possíveis de ambas as populações da único-pilha, embora diversos ratos/amostras precisem de ser processados paralelamente ou seqüencialmente para aumentar o número de pilhas. Tomados conjuntamente, os resultados obtidos demonstram uma maneira eficaz e relativamente direta para o MEC e o isolamento do pericyte do tecido glandular murino diferente.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes e nenhum conflito de outros interesses.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Ivo kalajzic por nos fornecer a estirpe smaCreErt2 mouse, Takeshi umazume para rejeito mouse e genotipagem, Mark Shelley para adquirir fotos profissionais para a Figura 2. Agradecemos também ao Conselho de editores científicos da Scripps e Mark Shelley pela edição de inglês científico. Estamos gratos ao núcleo de citometria de fluxo do Scripps Research Institute para assistência com triagem celular e ao Dr. Robin Willenbring para múltiplas discussões/conselhos sobre a análise de dados FACS.
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde, National Eye Institute concede 5 R01 EY026202 e 1 R01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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