Summary
Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs 'den MECs ve perikaytları yalıtır.
Abstract
Lakrimal bezi (LG) bir exokrin tubuloacinar bezidir gözyaşı sulu bir tabaka salgılayacağı. LG epitelyal ağacı acinar, duktal epitelyal ve miyoepitelyal hücrelerden (MECs) oluşur. MECs ekspres Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ve bir kontril fonksiyonu vardır. Onlar multipl glandüler organlarda bulunan ve ektodermal kökeni vardır. Buna ek olarak, LG içeren SMA + vasküler pürüzsüz Kas hücreleri endodermal kökeni perikayt denilen: damar tüpleri yüzeyini saran kontril hücreler. Yeni bir protokol bize yetişkin duvar LGs ve submandibular bezleri (SMGs) hem MECs ve perikayt izole sağlar. Protokol, SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare gerinliği kullanılarak MECS ve perikaytların genetik etiketlemesine dayanmaktadır, ardından floresan aktif hücre sıralama için LG tek hücreli süspansiyonun hazırlanması (FACS ). Protokol, MECs tarafından epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) ifadesine göre farklı Orijinler bu iki hücre nüfusu ayrılması için izin verir, perikayt EpCAM ifade etmez ise. İzole hücreler hücre ekimi veya gen ifadesi analizi için kullanılabilir.
Introduction
Miyoepitelyal hücreler (MECs) lakrimal, tükürük, harderian, ter, prostat ve meme dahil olmak üzere birçok exokrin bezinde bulunur. MECs bir epitelyal ve pürüzsüz bir kas fenotipi birleştiren benzersiz bir hücre türüdür. MECS Express α-pürüzsüz Kas aksini (SMA) ve bir kontril fonksiyonu1,2var. MECs ek olarak, lakrimal bezi (LG) ve submandibular bezi (SMG) içerir SMA + vasküler hücreler perikayt denilen, hangi vasküler tüpler yüzeyini saran endodermal orijinli hücreler3. MECS ve perikayt birçok işaretçileri ifade rağmen, SMA diğer LG ve SMG hücreler1,3ifade edilmez tek Marker.
Son 40 yıl içinde, çeşitli laboratuvarlarda farklı exokrin bezi dokularının dağılımını, enzimatik olmayan ve enzimatik yaklaşımlar uygulandığı bildirildi. 1980 yılında yayımlanan ilk raporlardan birinde, Fritz ve koyazarlar bir collagenase/tripsin çözüm4sıralı sindirim kullanarak kedi parotis acini yalıtmak için bir protokol nitelendirdi. 1989 yılında hann ve koyazarlar, collagenase, hyaluronidaz ve DNase5karışımı kullanılarak sıçan LGS 'den acini izolasyonu için bu protokolü ayarlamiş. 1990 yılında, Cripps ve meslektaşları lakrimal bezi acini6olmayan enzimatik ayrışma yöntemini yayınladı. Daha sonra, 1998 yılında, zoukhri ve koyazarlar CA2 +-LG ve SMG izole acini7üzerinde görüntüleme takip için bir enzimatik ayrışma protokol döndü. Son on yıl içinde, araştırmacılar exokrin bezlerinden kök/progenitor hücrelerin yalıtım üzerine odak döndü. Pringle ve koyazarlar fare SMG kök hücreleri8yalıtım için 2011 bir protokol nitelendirdi. Bu yöntem, kültürde tutulan kök hücre içeren salispheres yalıtımına dayanmaktadır. Yazarlar, kök hücre ilişkili işaretçileri ifade Proliferasyona hücrelerin bu salispheres izole olabilir iddia8. Shatos ve koyazarlar enzimatik sindirim ve toplama "Kurtarıcı" hücreleri9kullanarak yaralanmamış yetişkin sıçan LGS progenitör hücre yalıtım için protokol yayınladı. Daha sonra, 2015 yılında, Ackermann ve koyazarlar, birden fazla pasajlar10üzerinde mono katmanlı bir kültür olarak yayılabilen "murine lakrimal bezi kök hücreleri" ("mLGSCs") varsayımsal izole etmek için bu prosedürü ayarlandı. Ancak, önceden bahsedilen prosedürlerin hiçbiri hücresel alt türleri ve izole epitelyal hücrelerin bireysel nüfus ayırt etmek için izin. 2016 yılında, gromova ve yazarları FACS11kullanarak yetişkin murine LGS LG kök/progenitor hücrelerin yalıtım için bir prosedür yayınladı. Ancak, bu protokol MECs yalıtmak için tasarlanmamıştır.
Son zamanlarda, biz SMA + hücreleri yalıtmak mümkün olduğunu göstermiştir 3 hafta-eski SMA-GFP fareler12. Ancak, şu anda biz SMA + hücrelerin farklı nüfus ayrılmış değil. Burada, Yetişkin LGs ve SMGs 'den farklılaşmış MECs ve perikaytların doğrudan izolasyonu için yeni bir prosedür kurduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüsü (NıH) kurallarına göre yürütülmüştür ve Scripps Araştırma Enstitüsü kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm çabaları fare ve onların acı sayısını en aza indirmek için yapılmıştır. Tüm deneysel hayvanlar, musluk suyuna ücretsiz erişim ile standart bir diyet aldı.
Not: MEC ve perikayt izolasyonu için ana adımlar Şekil 1a-F' a şematik olarak özetlenmiştir. Bu prosedür için kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Tablo 1' de açıklanmıştır.
1. fare ve SMA hücrelerini etiketleme
- Kullanım yetişkin (2-4 ay eski) Tamoxifen-indüklenebilir, αSMA Driven muhabir fareler SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
Not: SMACreErt2 strain, Dr. Ivo kalajzic13tarafından temin edildi. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. CG-gt (ROSA) 26SorTM9 (CAG-tdTomato) Hze/j, AI9olarak da bilinir) gerinim (# 007909) Jackson Laboratuvarı (Sacramento, CA) satın alınmıştır. SMA + hücreler intraperitoneal Tamoksifen (TM) yönetim tarafından etiketlendi. -
Tamoksifen çözeltisi hazırlanması
- Filtrelenmiş Mısır yağı hazırlayın. Mısır yağı viskoz olduğundan 0,22 μm vakum filtresini kullanın.
- Bir 50 mL tüp içine şişe TM toz 1 g aktarın. Şişe, kap için etanol 1 mL ekleyin ve daha sonra bir 50 mL tüp eklemek durulama için sallayın. Bir kez daha başka 1 mL etanol ile tekrarlayın.
- 20 mg/mL TM çözeltisi 50 mL yapmak için süzülmüş Mısır yağı ekleyin. Tüp Vortex, folyoyla sarın ve 45 °C ' de titreyen su banyosuna veya sallama inküteköre koyun.
- Bu yaklaşık 12-24 h TM çözülmesine sürebilir. Zaman zaman, tüp çıkarın ve kalan kristaller için kontrol edin. TM tamamen çözülmüş bir kez, kısım ve mağaza-80 °c. Çözülmüş bir kısım yeniden kullanılabilir.
-
SMA + hücrelerini etiketlemek için, iki sıralı günde TM ile intraperitoneal (IP) fareler enjekte edilir.
- 3-4 hafta eski SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f , 100 μL/20 g (veya 2 mg/20 g) vücut ağırlığı ile TM ile herhangi bir cinsiyet faresi enjekte edilir (Şekil 1a). Fareler son TM enjeksiyon sonra 2-3 gün içinde hücre yalıtımı için kullanılmak üzere hazırdır. Gerekirse, enjekte fareler TM enjeksiyon sonra uzun süre feda edilebilir.
Not: FACS sırasında uygun tazminat kontrolleri olarak, bir vahşi tip (C57Bl/6) fare ve bir SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare TM ile enjekte edilmez (Ile "lekelenmiş" MECS) aynı yaşta gerekli olacaktır. 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fareler için sağlanan hesaplamaları kullanın. Değil enjekte SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl DSRed arka plan değerlendirilmesi sağlayacaktır. C57Bl/6 fare, lekelenmiş hücrelerin olumsuz bir kontrolü olarak hizmet verecektir.
- 3-4 hafta eski SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f , 100 μL/20 g (veya 2 mg/20 g) vücut ağırlığı ile TM ile herhangi bir cinsiyet faresi enjekte edilir (Şekil 1a). Fareler son TM enjeksiyon sonra 2-3 gün içinde hücre yalıtımı için kullanılmak üzere hazırdır. Gerekirse, enjekte fareler TM enjeksiyon sonra uzun süre feda edilebilir.
2. çözümler ve arabellekler
Not: LG, hücrelerin dağılması zor kılan bir hücre dışı matris içeren bir epitelyal kökeni bezidir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan enzimlerin ve çok adımlı sindirim sürecinin özel bir kombinasyonu kullanılarak tavsiye edilir.
-
Dispase tip II stok çözümü (25x)
- Çözülür 120 mg dispaz tip II toz 2 mL 50 mM HEPES/150 mM NaCl bir 25x stok solüsyonu hazırlamak için (son konsantrasyon dispaz 30 adet/mL olmalıdır). Miligram başına birimler fare sayısına bağlı olarak değişebilir ve dispase konsantrasyonu buna göre ayarlanması gerekir.
- 200 μL alquots hazırlayın ve onları-70 °C ' ye kadar 6 aya veya 4 °C ' ye kadar birkaç gün saklayın. Enzim bozulması önlemek için birden fazla dispase kısım dondurmak/çözülme yok.
-
DNase tip ı stok eriyik
- Çözülür 5 mg DNase tipi ı tozu 5 mL çözeltisi 50% gliserol, 20 mM Tris tampon (pH 7,5), ve 1 mM MgCl2 (stok konsantrasyonu yaklaşık olmalıdır 2000 birimler/ml). Miligram başına birimler fareler sayısına bağlı olarak değişebilir ve böylece DNase konsantrasyonu buna göre ayarlanması gerekir.
- 0,22 μm filtre ve 10 mL şırıngayı kullanarak stok çözümünü filtreleyin.
- 200 μL alquots hazırlayın ve onları-70 °C ' ye kadar 6 aya veya 4 °C ' ye kadar birkaç gün saklayın. Enzim bozulmasını önlemek için birden fazla dondurmayın/çözüleymeyin.
-
Sindirim orta
- İçin 10 mL DMEM düşük glikoz glutamin olmadan, eklemek 100 μL hücre kültürü takviyesi (örn., Glutamax, bkz. malzeme tablosu) bir seyreltme için 1:100.
- Hücre kültürü takviyesi ile DMEM düşük glikoz 2 mL için, eklemek 6 collagenase tipi mg ve pipetleme ile iyice karıştırın (ıslak buz üzerinde enzim), 160 μL dispase stok çözeltisi (2,4 U/mL final konsantrasyonu), 16 μL DNase tipi ı stok çözümü (8 U/mL final konsantrasyonu) ve 12 μL 1 M CaCl2 (6 mm final konsantrasyonu).
Not: Enzimatik aktivite artırmak için kalsiyum gereklidir14,15. Tüm hesaplamalar iki yetişkin fareler dört lakrimal bezleri hücrelerin yalıtım için sağlanır. Sindirim orta hacmi doku miktarına ve çoğaltır sayısına bağlı olarak değişebilir. 2 mL orta başına 2-4 ay eski farelerden 4 ' ten fazla lakrimal bezi kullanmayın.
-
Engelleme orta ı
- 25 mL DMEM/F-12 için FBS (% 15 Final konsantrasyonu), 250 μL hücre kültürü takviyesi (bkz. malzeme tablosu) 1:100 ve 50 μl 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm final konsantrasyonu) için bir seyreltme.
Not: Bu protokol için karşılaştırıldığında orta farklı türde DMEM/F-12 en iyi sonuçları verdi. Bu orta Ayrıca diğer araştırmacılar tarafından izole/kültür epitelyal hücreler için kullanılmıştır16,17.
- 25 mL DMEM/F-12 için FBS (% 15 Final konsantrasyonu), 250 μL hücre kültürü takviyesi (bkz. malzeme tablosu) 1:100 ve 50 μl 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm final konsantrasyonu) için bir seyreltme.
-
Engelleme orta II
- 25 mL PBS 'ye 50 μL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM son konsantrasyon) ekleyin.
-
Kurtarma ortamı
- 5 mM MgCl2ile takviye edilen HBSS 2 ml 'ye, 100 μL DNase türü ı hisse senedi çözüm 100 U başına 2 ml son konsantrasyon ekleyin. Epitel hücrelerinin toplanması azaltmak için DNase-tip ı nispeten yüksek konsantrasyonlarda gereklidir.
-
Floresans aktif hücre sıralama (FACS) tampon
- PBS 486,5 mL için, 12,5 mL serum (% 2,5 son konsantrasyon) ve 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM son konsantrasyon) ekleyin.
Not: Tampon maksimum 6 hafta boyunca 4 °C ' de depolanabilir.
- PBS 486,5 mL için, 12,5 mL serum (% 2,5 son konsantrasyon) ve 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM son konsantrasyon) ekleyin.
3. yetişkin fare lakrimal bezi hasat ve mikrodiseksiyon
- Isoflurane inhalasyonu ile fareyi anestezize (Isoflurane akış hızını veya konsantrasyonunu% 5 veya daha büyük olarak ayarlayın) ve servikal dislocation tarafından feda edilir. Kurumsal IACUCs tavsiyelerine göre anestezi ve ötenazi gerçekleştirin.
- İnce forseps ve makas kullanarak, göz ve kulak arasında cildi çıkarın (Şekil 2a).
- Bir LG incelemek için, nazikçe Cımbız kullanarak LG çekin ve aynı zamanda sıfırdan küçük makas keskin ucu kullanarak LG etrafında bağ dokusu çizilmeye (Şekil 2B).
- LG ve parotis tükürük bezleri birbirlerine çok yakın ve diseksiyon öncesinde ayrılmış olması gerekir gibi, makas ile kesme kaçının. LG ve parotis bezleri ayrıldığı zaman, makas kullanarak LG dışarı kesti. 2 mL soğuk PBS (buz üzerinde tutun) (Şekil 1B) ile 35 mm 'lik bir çanak içine bezler yerleştirin.
-
LG bir bağ dokusu kapsül/zarf ile kaplıdır gibi, bir diseksiyon mikroskop altında herhangi bir çevreleyen yağ ve bağ dokusu trim ve iki forseps ile LG kapsül çıkarın.
- Tüm bezleri için bu adımı tekrarlayın.
- Hücre etiketleme sağlamak için floresan mikroskop altında küçük bir doku parçasını kontrol edin (Şekil 1C).
4. LG tek hücreli süspansiyon hazırlanması
- Tüm LG 'Leri 0,5 mL oda sıcaklığında (RT) sindirim ortamına ve küçük makasları çok küçük parçalara (yaklaşık 0.2-1 μm2) kullanan lgs 'ye 35 mm 'lik bir çanak içine aktarın. Normalde 4 LGs (Şekil 2C) için yaklaşık 3 dakika sürer.
- Geniş çap pipet filtre ucu kullanarak kıyılmış dokusu 2 mL yuvarlak alt tüpüne aktarın. Ucu kesilmiş (Şekil 2D) ile normal boyutta bir pipet ucu kullanın.
- En fazla 2 mL sindirim orta ekleyin ve tüp tersine çevirme ile karıştırın.
- 37 °C ' de, 100-120 rpm, 90 dakika için bir sallayarak inkübörü (veya su banyosu sallayarak) yerleştirin tüp.
- Her 30 dakika yavaş pipet bezi parçaları 20-30 kez bir 1.000 μL filtre ucu ile azalan delik boyutu (Şekil 2D) kullanarak. Kuluçkay/triturasyon sonrası 10 μL kısım alın ve kümeler için mikroskop altında inceleyin. Kümeleri devam ederse, sindirimi sürdürüyor.
- 90 dakika sonra, örnek 2-3 kez bir insülin şırınga iğne (31G) üzerinden daha fazla askıya hücreleri serbest bırakmak için geçirin.
Not: Sindirim tamamlandığında hiçbir görünür lakrimal bezi parçaları çözelti içinde kalmalı (Şekil 1D). - Hücre süspansiyonunu 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve engelleme ortamı türü ı toplam 5 mL 'ye ekleyin. Karıştırmak için tüp 2-3 kez tersine çevirin.
- Bir 50 mL tüp üzerine yerleştirilen bir 70 μm hücre süzgeci ile hücre süspansiyon geçirin. Süzgeci 1 mL engelleyici ortam tipi ile yıkayın ı. 4,8 tekrar adım.
- 0,4 x g 'de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri
- Süpernatant aspirate. 1 mL pipet ucu kullanarak 2 mL engelleme orta tip II 'de hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 0,4 x g (24 x 1,5/2.0 ml rotor) ' da hücreleri santrifüjler (bkz. malzeme tablosu) RT 'de 3 dakika.
- Aspirate süpernatant ve yeniden askıya hücreleri 1 ml hücre dekolmanı çözeltisi (bkz. malzeme tablosu).
Not: Burada, hücre dekolmanı çözeltisi Accutase, proteolitik ve kolagenolitik aktivite ile bir deniz kökenli enzim hücre yüzey işaretçileri analizi için hücreleri ayırır/dissociates. - 37 °C ' de, 100-120 RPM 'de, 2-3 dk. boyunca hücreleri kulyın. hücre dekolmanı çözeltisi ile aşırı sindirim hücresel zarlara zarar verebilir.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL tüpüne aktarın ve 10 mL engelleme orta tip ı. 0,4 x g (24 x 1,5/2.0 ml rotor; bkz. malzeme tablosu) 5 dakika için Santrifüjü tüp.
- 6 ml kurtarma ortamına süpernatant ve yeniden askıya hücreleri atın ve RT 'de 30 dakika boyunca hücreleri inküt.
- Tam hücre dağılmasından emin olmak için mikroskop altında 10 μL hücreli süspansiyonu kontrol edin (Şekil 3).
- Hücre sayacı ve tripan mavisi kullanarak hücreleri saymak. Normalde, dört LGs (bir örnek) 4 x 105-6 x 106 hücreler bekliyoruz.
- 0,4 x g (24 x 1,5/2.0 ml rotor) ' da santrifüjler, RT 'de 3 dakika için malzeme tablosunabakın ve antikor boyama işlemine devam edin.
5. antikor boyama
- 400 μL FACS tampon içeren 2 ml tüp 5 x105 hücre ekleyin. 5 μL parlak menekşe 421 Anti-fare CD326 (EpCAM) ve 0,5 μL hayalet kırmızı 780 (viability boya) ekleyin.
- Paralel olarak, FACS telafisini ayarlamak için kontrolleri hazırlayın:
Negatif kontrol-1 (vahşi tip fareye ait hücreler)
Arka plan kontrolü SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl dan lekelenmiş hücreler
Cy7-780 lekeli hücreler (vahşi tip fare hücreleri Ghost Red 780 viability boya ile lekelenmiş)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (vahşi tip fare hücreleri EpCAM-Brilliant Violet 421 antikor ile lekelenmiş).
Not: Her denetim örneği için en az 1 x 105 hücre 400 ΜL FACS arabelleği başına kullanın. - Her reaktif karışımı hücrelerini pipetleme ile iyice ekledikten sonra.
- 4 °C ' de 45 dk için folyo ve döndürme tüpleri ile sarma tüp (ler).
- 0,4 x g (24 x 1,5/2.0 ml rotor), 4 °c ' de 3 dakika Için malzeme tablosunabakın.
- 1 mL FACS arabelleğinde hücreleri yeniden askıya alın. Telafisi sırasında arka planı azaltmak için hücreleri yıkamak önemlidir.
6. floresans aktif hücre sıralama
- Hücre süspansiyonunu 5 mL FACS tüplerine aktarın ve FACS analizine devam edin. Hücreleri buzda tutun.
- Tek renk kontrolleri kullanarak telafisi ayarlayın.
- Uygun akış sitometresi kullanarak bir 100 μm nozul ile 20 psi cinsinden sıralama hücreleri (bkz. malzeme tablosu). Gating strategy18 Şekil 1E ve Şekil 4' te gösterilir.
- Sıralı hücreleri orta, RNA-daha sonra, FACS veya liziz arabelleklerini aşağı doğru prosedürlere bağlı olarak toplayın (Şekil 1E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SMA + MECs ve perikayt yalıtmak için fare modeli
Kurulan protokol iki saf nüfusun yalıtımına izin verir: LGs ve SMGs 'den MECs ve perikayt (bkz. Tablo 1). Bu iki hücre türü farklı bir boyut ve görünüme sahiptir. Mikrovasküler perikayt, kapiller duvarları etrafında geliştirmek (Şekil 5A) ve bir kare şekli var (Şekil 5B), MECS LG salgı acini çevreleyen iken, uzun süreçlere sahip ve nispeten büyük bir alan işgal (Şekil 5A, B ). Açıklanan prosedür, TM-indüklenebilir SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare gerininde SMA + ' nın genetik hücre etiketlemesine dayanmaktadır. Ek olarak, EpCAM antikorları araştırmacılar epitelyal SMA+ayırt etmek için izin: EpCAM+ ektodermal Orijin hücreleri (MECS) ve SMA+EpCAM- endodermal Orijin hücreleri (perikayt).
Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
LG iyice sindirilmiş olmalıdır bir filaentous ekstrellüler matris içerir. Sağlanan protokol, FACS Analizi ve diğer uygulamalar için tek hücreli bir çözümün hazırlanması sağlar. Ayrılmış hücreler örneği Şekil 3' te gösterilir.
FACS tarafından MEC ve perikayt yalıtımı
Perikaytlardan MECs ayırt etmek için, tek hücreler EpCAM, sadece epitelyal hücreleri algılar antikor ile lekelenmiş. Hücrelerin ana nüfusu ileri ve yan dağılım alanı ile tespit edildi (Şekil 4A). İleri dağılım alanı genişliğe karşı ve yan dağılım alanı genişliğe karşı (Şekil 4b) çizerek, çiftlerin hariç tutuldu. Ölü hücre dışlama Ghost Red 780 (viability boya) (Şekil 4c) ile yapıldı. Arka plan gürültüsünü (spesifik olmayan antikor bağlama) belirlemek ve optimum ayırma için uygun telafisi sağlamak amacıyla etiketli olmayan bir kontrol (Şekil 4E), arka plan kontrolü ve tek bir primer antikor ile etiketlenmiş antikor kontrolü kullanılmıştır. (Şekil 4d). Veri analizleri FlowJo yazılımı kullanılarak yapılmıştır.
DsRed etiketleme ile MECs ve perikaytlarca yer aldı. Hem MEC hem de perikayt hücre nüfusu içinde DsRed+ Dim (gösterilmez) ve DSRed+ parlak hücreler algılandı (Şekil 4d). Etiketli hücrelerin parlaklığı, SMA ifadesinin düzeyine veya TM enjeksiyonu19üzerine muhabir aktivasyonuna bağlı olabilir. Sadece tamamen farklılaşmış hücreler gerekli olduğundan sadece DS Red+ parlak hücre popülasyon toplandı. DS Red+ Dim hücre nüfusu daha fazla soruşturma gerektirir.
Aşağı akım uygulamaları
MECs 'in exokrin bezlerinde önemli bir kontril fonksiyonu olduğu bilinmektedir. Dahası, onlar çok plastik hücreler ve kök hücreler özellikleri vardır. Bu nedenle, yalıtılmış MECs birden çok uygulamada kullanılabilir. Örneğin, hücreler kültürlü olabilir, RNA yalıtım veya transplantasyon için kullanılır (Şekil 1F)12,20,21,22.
| Parametre | Lakrimal bezi | Submandibular bezi |
| Örnek başına fareler sayısı | 2 | 1 |
| Numune başına bezlerin sayısı | 4 | 2 |
| Diseksiyon bezleri | Parotis bezinden ayrı | Dilli bezden ayrı |
| Numune başına kolajenaz konsantrasyonu | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Enzimatik ayrışma sonra yaklaşık hücre numarası | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Kurtarma adımı ("yetişkin fare lakrimal bezi tek hücreli dissociation" bölümüne bakın, nokta 15) | 6 ml kurtarma medyasında hücreleri yeniden askıya alma | 12 mL kurtarma medyasında hücreleri yeniden askıya alma |
| Antikor boyama sırasında FACS tampon hacmi | 400 (μL) | 400 tarafından 2 tüpler μL; Her tüp 6x105 daha fazla değil iki veya üç tüpler içine hücreleri bölmek daha iyidir |
Tablo 1: submandibular bezinden (SMG) hücrelerin yalıtımına ilişkin protokolün değiştirilmesi. Tablo duvar LG için prosedür ile karşılaştırıldığında murine SMG MECs ve perikayt yalıtmak için gerekli büyük değişiklikler açıklar.
Şekil 1: denemenin şematik gösterimi. (A) SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/flfareler TM ile IP enjeksiyonları. (B) LG veya SMG 'nin yalıtım ve kıyma. (C) Floresan Mikroskobu kullanarak hücre etiketleme analizi. (D) tek hücreli bir çözüm hazırlamak için çok adımlı enzimatik sindirim. Hücrelerin kümelerden serbest bırakıldığından emin olmak için hafif mikroskop altında sindirim adımlarını kontrol etmek önemlidir. (E) SMA + parlak DS kırmızı +/EpCAM + (MECS) ve DS kırmızı + parlak/EpCAM-(perikayt) gösteren gating örneği. (F) toplanan MECS ve perikaytlar hücre EKIMI, RNA yalıtım ve gen ifadesi Analizi ve hücre nakli gibi farklı aşağı işleme prosedürlerine maruz kalabilirdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: LG yalıtım/mincing kritik adımlar. (A) LG incelemek için göz ve kulak arasında cilt kaldırılması. kesikli sarı daire LG konumunu gösterir. (B) LG diseksiyon. Sarı ok ucu, lakrimal ve parotis bezleri arasındaki alanı işaret ediyor. (C) LG eğri, künt uçları ile makas kullanarak sindirim orta kıyma. (D) 2 ml tüp içine kıyılmış doku transferi. Sarı ok ucu geniş delik boyutu 1 ml ucu aktarmak için gerekli tasvir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Konfokal ve diferansiyel parazit kontrastı (DıC) resimler duvar LG 'den ayrılmış tek hücreleri gösteren. (A-C) tek hücreler Iki LGS bir 4 ay eski SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare izole. Çekirdekler DAPı ile lekelenmiş (mavi). Beyaz ok uçları SMA + (DS Red) hücrelerini gösterir: MECs veya perikayt. Ölçek çubuğu = 15 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: FACS kullanarak murine LG MECs ve perikaytların tanımlanması. (A) ileri ve yan dağılım alanı gating tarafından LG hücrelerinin ana nüfusun belirlenmesi. (B) ileri dağılım alanı ile genişliğe karşı ceketleri dışlama. (C) hayalet kırmızı 780 (viability boya) ile ölü hücre dışlama. (D) MEC (SMA+ parlak/EpCAM+) ve perikayt (SMA+ parlak/EpCAM-) nüfus EpCAM antikor ile boyama dayalı ayırt. (E) etiketli olmayan denetim (vahşi tip fareye ait hücreler). Her arsa üzerinde Gated hücrelerin% sağlanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: murine LG 'den izole edilmiş MECs ve perikayt arasında dağılım ve şekil farkını gösteren Konfokal görüntüler. (A) MEC ve perikayt arasındaki dağılımın farkını gösteren etiketli HÜCRELERLE LG 'nin hazırlanması. (B) MEC ve perikayt şekli farklıdır. Perikayt nispeten küçüktür ve MEC büyüktür ve düzensiz şekli ve birçok uzun süreçlere sahiptir. Ok uçları = MECs ve perikaytlarla. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, LG ve SMG 'den MEC ve perikayt izolasyonunun bir protokolü tanımlanmıştır. Bu prosedür, MECs ve perikaytların tek güvenilir biyomarker SMA, genetik etiketleme dayanmaktadır.
Bu protokolü geliştirmeye yönelik aciliyet, edebiyatın neredeyse toplam yokluğunda, murine LGs ve SMGs 'den MECs izolasyonunu vurgulayarak motive oldu. Genetik etiketleme daha önce kullanılmış olsa da, SMA + hücreleri genç üç haftalık LGs12' den izole etmek için SMA-Gfp fareler kullanarak, bu eski fareler yetişkin farelerde sinyal kısmi kaybı nedeniyle hücre yalıtımı için kullanmak izin vermedi. Buna ek olarak, GFP etiketli hücreler FACS uygulamalarında nispeten yüksek bir arka plan verir23 ve ek Telafiler gerektirir. Buna karşılık, SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare hattı hiçbir veya düşük arka plan ve fare postnatal geliştirme, yetişkinlik ve yaşlanma boyunca SMA etiketleme aktivasyon yüksek düzeyde gösterir. SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare kullanımı özellikle hastalık ilerlemesi veya yaşlanmaya odaklanan çalışmalar için önemlıdır, çünkü bu farelerde SMA + hücreleri hastalık gelişiminin öncesinde etiketlenebilir ve daha sonra incelendiğinde hastalık/yaşlanma ilerledikçe. Protokolün başka bir kritik adım ayrıntılı LG kıyma ve aşağıdaki sindirim olduğunu. Bu adım, FACS analizi sırasında elde edilen hücre numarasını azaltabilir. Genel olarak, yalıtım ve primer hücrelerin hemen analizi de kültür24tutulan hücrelerin transkripsiyon profillerinde önemli değişiklikler nedeniyle önemlidir.
Ayrıca, murine LGs 'den MEC ve perikayt yalıtımı için açıklanan protokol farklı aşağı işlem prosedürlerini sağlar. Çeşitli fareler/numunelerin hücre sayısını artırmak için paralel veya ardışık olarak işlenmesi gerektiğinden, protein, RNA ve DNA ekstrışmaları her iki tek hücreli nüfusdan da mümkündür. Birlikte alındığında, elde edilen sonuçlar farklı murine glandüler dokudan MEC ve perikayt yalıtımı için etkili ve nispeten kolay bir yol göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir rekabet mali çıkarları ve herhangi bir başka ilgi herhangi bir çatışma ilan.
Acknowledgments
Biz SMACreErt2 fare gerilme, fare takip ve genotyping için Takeshi umazume, Şekil 2 için profesyonel resimler elde etmek için Mark Shelley bize sağlamak için Dr Ivo kalajzic teşekkür ederiz. Ayrıca Scientific Ingilizce düzenleme için bilimsel editörler ve Mark Shelley Scripps Konseyi teşekkür ederiz. Biz hücre sıralama ve Dr Robin Willenbring için birden fazla tartışma/FACS veri analizi tavsiyeler için yardım için Scripps Research Institute Flow cytometry çekirdek minnettar.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen, Ulusal göz Enstitüsü hibe 5 R01 EY026202 ve 1 R01 EY028983 H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
