Summary
La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.
Abstract
La glándula lagrimal (LG) es una glándula tubuloacinar exocrina que segrega una capa acuosa de película lagrimal. El árbol epitelial de LG se compone de acinar, epitelio ductal, y las células mioepiteliales (MECs). MECs expresan la actina del músculo liso alfa (αSMA) y tienen una función contráctil. Se encuentran en múltiples órganos glandulares y son de origen ectodérmico. Además, el LG contiene células de músculo liso vascular SMA + de origen endodérmico llamado pericytes: células contráctiles que envuelven la superficie de los tubos vasculares. Un nuevo protocolo nos permite aislar tanto los MECs como los pericitos de los LGS adultos y de las glándulas submandibulares (SMG). El protocolo se basa en el etiquetado genético de los MECs y pericitos utilizando la cepa SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse, seguida de la preparación de la suspensión de célula única LG para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS ). El protocolo permite la separación de estas dos poblaciones celulares de diferentes orígenes basadas en la expresión de la molécula de adhesión de células epiteliales (epcam) por los MECs, mientras que los pericitos no expresan epcam. Las células aisladas podrían utilizarse para el cultivo celular o el análisis de expresión génica.
Introduction
Las células mioepiteliales (MECs) están presentes en muchas glándulas exocrinas, incluyendo lagrimales, salivales, arderias, sudor, próstata y mamaria. Los MECs son un tipo de célula único que combina un epitelial y un fenotipo muscular liso. MECs Express α-actina del músculo liso (SMA) y tienen una función contráctil1,2. Además de los MECs, la glándula lagrimal (LG) y la glándula submandibular (SMG) contienen células vasculares SMA + denominadas pericytes, que son células de origen endodérmico que envuelven la superficie de los tubos vasculares3. Aunque los MECs y pericitos expresan muchos marcadores, SMA es el único marcador que no se expresa en otras células LG y SMG1,3.
En los últimos 40 años, varios laboratorios notificaron ensayos para la disociación de diferentes tejidos de la glándula exocrina, en los que se aplicaron enfoques no enzimáticos y enzimáticos. En uno de los primeros informes publicados en 1980, Fritz y coautores describieron un protocolo para aislar la parótida acinos felina utilizando la digestión secuencial en una solución de colagenasa/tripsina4. En 1989, Hann y coautores ajustaron este protocolo para el aislamiento acinos de los LGS de rata utilizando una mezcla de colagenasa, hialuronidasa y DNase5. En 1990, Cripps y colegas publicaron el método de disociación no enzimática de la glándula lagrimal acinos6. Más tarde, en 1998, zoukhri y coautores regresaron a un protocolo de disociación enzimática para el seguimiento de CA2 +-imágenes en LG y SMG aislado acinos7. En la última década, los investigadores han centrado su atención en el aislamiento de las células madre/progenitoras de las glándulas exocrina. Pringle y coautores describieron un protocolo en 2011 para el aislamiento de las células madre SMG del ratón8. Este método se basó en el aislamiento de las saliesferas que contenían células madre, que se mantuvieron en la cultura. Los autores afirmaron que las células proliferantes que expresaban marcadores asociados a células madre podían aislarse de estas saliesferas8. Shatos y coautores publicaron el protocolo para el aislamiento de células progenitoras de LGs de rata adulta no lesionada usando digestión enzimática y recogiendo células "liberadas"9. Más tarde, en 2015, Ackermann y coautores ajustaron este procedimiento para aislar presuntivas "células madre de la glándula lagrimal murina" ("mLGSCs") que podrían propagarse como una cultura Mono-capa a través de múltiples pasajes10. Sin embargo, ninguno de los procedimientos antes mencionados permitió distinguir subtipos celulares y poblaciones individuales de células epiteliales aisladas. En 2016, Gromova y coautores publicaron un procedimiento para el aislamiento de las células madre/progenitoras de LG de los LGs adultos de murina utilizando FACS11. Sin embargo, este Protocolo no pretendía aislar los MECs.
Recientemente, hemos demostrado que somos capaces de aislar las células SMA + de 3 ratones SMA-GFP de una semana de edad12. Sin embargo, en este momento no hemos separado diferentes poblaciones de células SMA +. Aquí establecimos un nuevo procedimiento para el aislamiento directo de MECs diferenciados y pericitos de LGS y SMG adultos.
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Protocol
Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de salud (NIH) y fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales del Instituto de investigación Scripps. Se realizaron todos los esfuerzos para minimizar el número de ratones y su sufrimiento. Todos los animales experimentales recibieron una dieta estándar con acceso gratuito al agua del grifo.
Nota: Los pasos principales para el aislamiento de MEC y de pericyte se describen esquemáticamente en la figura 1A-F. Todos los reactivos y equipos utilizados para este procedimiento se describen en la tabla 1.
1. ratones y etiquetado de las células SMA
- Uso adulto (2-4 meses de edad) tamoxifeno-inducible, αSMA conducido ratones reportero SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL.
Nota: La cepa SMACreErt2 fue amablemente proporcionada por el Dr. Ivo kalajzic13. Rosa26-TdTomatoFL/FL (B6. CG-gt (ROSA) 26SorTM9 (CAG-tdTomato) HZE/j, también conocido como Ai9) cepa (# 007909) fueron comprados en el laboratorio de Jackson (Sacramento, CA). Las células de SMA + fueron etiquetadas por la administración intraperitoneal de tamoxifeno (TM). -
Preparación de la solución de tamoxifeno
- Prepare aceite de maíz filtrado. Utilice el filtro de vacío de 0,22 μm ya que el aceite de maíz es viscoso.
- Transfiera 1 g de polvo TM de la botella a un tubo de 50 mL. Añadir 1 mL de etanol a la botella, tapar y agitar para enjuagar y luego añadir a un tubo de 50 mL. Repetir una vez más con otros 1 mL de etanol.
- Añadir aceite de maíz filtrado para hacer 50 mL de una solución TM de 20 mg/mL. Vórtice el tubo, envuélvalo en papel de aluminio y Pónlo en un baño de agua agitando o agitando la incubadora a 45 ° c.
- Puede tomar alrededor de 12-24 h para disolver la TM. De vez en cuando, retire el tubo y compruebe si hay cristales restantes. Una vez que la TM está completamente disuelto, alícuota y almacenar a-80 ° c. Una alícuota descongelada se puede reutilizar.
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Para etiquetar células SMA +, inyectar ratones intraperitonealmente (IP) con TM en dos días secuenciales.
- Inyectar 3-4 semanas de edad SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/f cualquier ratón de género con TM a 100 μl/20 g (o 2 mg/20 g) de peso corporal (figura 1A). Los ratones están listos para ser utilizados para el aislamiento celular en 2-3 días después de la última inyección TM. Si es necesario, los ratones inyectados pueden sacrificarse en periodos más prolongados después de la inyección de TM.
Nota: Como controles para la compensación adecuada durante FACS, un tipo salvaje (C57Bl/6) ratón y un SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL ratón no inyectado con TM (con "sin mancha" MECs) de la misma edad sería necesario. Utilice los mismos cálculos proporcionados para 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL ratones. No inyectado SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL permitirá la evaluación del fondo DsRED. El ratón C57Bl/6 servirá como un control negativo de las células no teñidas.
- Inyectar 3-4 semanas de edad SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/f cualquier ratón de género con TM a 100 μl/20 g (o 2 mg/20 g) de peso corporal (figura 1A). Los ratones están listos para ser utilizados para el aislamiento celular en 2-3 días después de la última inyección TM. Si es necesario, los ratones inyectados pueden sacrificarse en periodos más prolongados después de la inyección de TM.
2. soluciones y buffers
Nota: El LG es una glándula de origen epitelial que contiene una matriz extracelular que dificulta la disociación de las células. Por lo tanto, se recomienda utilizar una combinación especial de enzimas y un proceso de digestión multipaso descrito a continuación.
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Solución de stock de dispasa tipo II (25x)
- Disolver 120 mg de dispasa tipo II polvo en 2 mL de 50 mM HEPES/150 mM NaCl para preparar una solución de 25x (la concentración final de la dispasa debe ser 30 unidades/mL). Unidades por miligramo pueden variar dependiendo del número de ratones y la concentración de la dispasa debe ajustarse en consecuencia.
- Preparar los alícuts de 200 μL y almacenarlos a-70 ° c durante un máximo de 6 meses o 4 ° c durante varios días. No congele/descongelar la alícuota de la dispasa más de una vez para prevenir la degradación enzimática.
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La solución de stock de DNase Type I
- Disolver 5 mg de DNase en polvo tipo I en una solución de 5 mL de 50% de glicerol, 20 mM de tampón Tris (pH 7,5) y 1 mM MgCl2 (la concentración de las existencias debe ser de aproximadamente 2000 unidades/ml). Unidades por miligramo pueden variar dependiendo del número de ratones y por lo tanto la concentración de DNase debe ajustarse en consecuencia.
- Filtre la solución de papel utilizando un filtro de 0,22 μm y una jeringa de 10 mL.
- Preparar los alícuts de 200 μL y almacenarlos a-70 ° c durante un máximo de 6 meses o 4 ° c durante varios días. No congele/descongelar más de una vez para prevenir la degradación de las enzimas.
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Medio de digestión
- A 10 mL de baja glucosa DMEM sin glutamina, añadir 100 μL de suplemento de cultivo celular (por ejemplo, Glutamax, ver tabla de materiales) para una dilución de 1:100.
- A 2 mL de baja glucosa DMEM con suplemento de cultivo celular, añadir 6 mg de Collagenase tipo I y mezclar a fondo mediante pipeteo (enzima sobre hielo húmedo), 160 μL de solución de material de dispasa (2,4 U/mL de concentración final), 16 μL de solución de stock tipo I de DNase (concentración final de 8 U/mL) , y 12 μL de 1 M CaCl2 (6 mm de concentración final).
Nota: El calcio es necesario para aumentar la actividad enzimática14,15. Todos los cálculos se proporcionan para el aislamiento de las células de cuatro glándulas lagrimales de dos ratones adultos. El volumen de medio de digestión puede variar dependiendo de la cantidad de tejido y el número de réplicas. No utilice más de 4 glándulas lagrimales de ratones de 2-4 meses de edad por cada 2 mL de medio.
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Medio de bloqueo que
- A 25 mL de DMEM/F-12, añadir FBS (15% de concentración final), 250 μL de suplemento de cultivo celular (ver tabla de materiales) para una dilución de 1:100, y 50 μl de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentración final).
Nota: De los diferentes tipos de medios que se compararon para este protocolo DMEM/F-12 dio los mejores resultados. Este medio también ha sido utilizado por otros investigadores para aislar/cultivo de células epiteliales16,17.
- A 25 mL de DMEM/F-12, añadir FBS (15% de concentración final), 250 μL de suplemento de cultivo celular (ver tabla de materiales) para una dilución de 1:100, y 50 μl de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentración final).
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Medio de bloqueo II
- A 25 mL de PBS, añadir 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentración final).
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Medio de recuperación
- A 2 mL de HBSS complementado con MgCl2de 5 mm, añadir 100 μl de solución de stock de DNase tipo I a 100 U por 2 ml de concentración final. Se requieren concentraciones relativamente altas de DNase-tipo I para reducir la agregación de células epiteliales.
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Búfer de ordenación celular activada por fluorescencia (FACS)
- A 486,5 mL de PBS, añadir 12,5 mL de suero (2,5% concentración final) y 1 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentración final).
Nota: El buffer puede almacenarse a 4 ° c durante un máximo de 6 semanas.
- A 486,5 mL de PBS, añadir 12,5 mL de suero (2,5% concentración final) y 1 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentración final).
3. la cosecha y la microdisección de la glándula lagrimal del ratón adulto
- Anestesiar el ratón por inhalación de isoflurano (ajustar el caudal de isoflurano o concentración a 5% o mayor) y sacrificar por luxación cervical. Realice la anestesia y la eutanasia según las recomendaciones institucionales de la IACUCs.
- Usando fórceps finos y tijeras, retire la piel entre el ojo y el oído (figura 2A).
- Para diseccionar un LG, tire suavemente de LG usando pinzas y al mismo tiempo raye el tejido conectivo alrededor del LG usando la punta afilada de pequeñas tijeras para liberarlo (figura 2B).
- Evite cortar con tijeras, ya que las glándulas salivales LG y parótida se encuentran muy cerca unas de otras y deben separarse antes de la disección. Cuando se separan las glándulas parótidas y LG, cortar el LG con tijeras. Colocar las glándulas en un plato de 35 mm con 2 mL de PBS frío (mantener en hielo) (figura 1B).
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Como el LG está cubierto por una cápsula/sobre del tejido conjuntivo, recorte cualquier grasa circundante y tejido conjuntivo bajo un microscopio de disección y retire la cápsula LG con dos fórceps.
- Repite este paso para todas las glándulas.
- Revise un pequeño trozo de tejido bajo el microscopio fluorescente para asegurar el etiquetado celular (figura 1C).
4. preparación de la suspensión de célula única de LG
- Transfiera todos los LGS a un plato de 35 mm con 0,5 ml de medios de digestión de temperatura ambiente (RT) y LGS de picar usando pequeñas tijeras en trozos muy pequeños (aproximadamente 0,2-1 μm2). Normalmente, se tarda aproximadamente 3 minutos a picar 4 LGS (figura 2C).
- Transfiera el tejido picado a un tubo inferior redondo de 2 mL utilizando una punta de filtro de pipetas de diámetro ancho. Utilice una punta de pipetas de tamaño normal con la punta cortada (Figura 2D).
- Añadir hasta 2 mL de medio de digestión y mezclar invirtiendo el tubo.
- Colocar el tubo en una incubadora (o baño de agua agitando), a 37 ° c, 100-120 RPM para 90 min.
- Cada 30 min pipetear lentamente las piezas de la glándula 20-30 veces utilizando una punta de filtro de 1.000 μL con el tamaño de taladro decreciente (Figura 2D). Después de la incubación/trituración, tomar una alícuota de 10 μL e inspeccionar bajo un microscopio para los racimos. Si los clústeres persisten, continúe la digestión.
- Después de 90 min, pase la muestra 2-3 veces a través de una aguja de jeringa de insulina (31G) para liberar más células en suspensión.
Nota: Ninguna pieza visible de la glándula lagrimal debe permanecer en la solución una vez completada la digestión (Figura 1D). - Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL y añada un medio de bloqueo tipo I a un total de 5 mL. Invierta el tubo 2-3 veces para mezclar.
- Pasar la suspensión celular a través de un colador de células de 70 μm colocado en un tubo de 50 mL. Lavar el colador con 1 mL de medio de bloqueo tipo I. Repita el paso 4,8 de nuevo.
- Centrifugar muestras a 0,4 x g durante 5 min en RT.
- Aspiran el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 2 mL de medio de bloqueo de tipo II utilizando una punta de pipetas de 1 mL y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Centrifugar las células a 0,4 x g (rotor de 24 x 1.5/2,0 ml; ver tabla de materiales) durante 3 min en RT.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 mL de solución de desprendimiento celular (ver tabla de materiales).
Nota: Aquí, la solución de desprendimiento celular es la Accutasa, una enzima de origen marino con actividad proteolítica y colagenolítica que separa/disocia las células para el análisis de marcadores de superficie celular. - Incubar las células a 37 ° c, a 100-120 RPM para 2-3 min. la Sobredigestión con solución de desprendimiento celular puede dañar las membranas celulares.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL y añada 10 mL de medio de bloqueo tipo I. tubo de centrifugación a 0,4 x g (rotor de 24 x 1.5/2,0 ml; ver tabla de materiales) durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 6 mL de medios de recuperación e incubar las células durante 30 min en RT.
- Comprobar 10 μL de suspensión celular bajo el microscopio para asegurar la disociación celular completa (figura 3).
- Cuente las celdas usando un contador de celdas y el azul de Tripan. Normalmente, esperamos 4 x 105-6 x 106 células de cuatro LGS (una muestra).
- Células centrífugas a 0,4 x g (rotor de 24 x 1.5/2,0 ml; ver tabla de materiales) durante 3 min en RT y proceder a la tinción de anticuerpos.
5. tinción de anticuerpos
- Añadir hasta 5 x105 células a un tubo de 2 ml que contenga 400 μL de tampón FACS. Añadir 5 μL de violeta brillante 421 anti-ratón CD326 (EpCAM) y 0,5 μL de fantasma rojo 780 (colorante de viabilidad).
- En paralelo, prepare los controles para ajustar la compensación de FACS:
Control negativo-1 (celdas de ratón de tipo salvaje)
Control de fondo de las células no teñidas de SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL
Cy7-780 células manchadas (células del tipo de ratón silvestre manchadas con el tinte de viabilidad fantasma rojo 780)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (células de tipo Wild Mouse manchado con el EpCAM-Brilliant Violet 421 anticuerpo).
Nota: Para cada muestra de control, utilice un mínimo de 1 x 105 celdas por 400 μL de búfer FACS. - Después de agregar completamente las células de mezcla de reactivos mediante pipeteo.
- Envolver el tubo (s) con papel de aluminio y rotar los tubos durante 45 min a 4 ° c.
- Centrifugadora de muestras a 0,4 x g (rotor de 24 x 1.5/2,0 ml; ver tabla de materiales) durante 3 min a 4 ° c.
- Vuelva a suspender las celdas en 1 mL de búfer FACS. Es importante lavar las células para disminuir el fondo durante la compensación.
6. clasificación celular activada por fluorescencia
- Transfiera la suspensión celular en tubos FACS de 5 mL y proceda con el análisis de FACS. Mantenga las células en hielo.
- Ajuste la compensación mediante controles de color único.
- Ordene las células a 20 psi a través de una boquilla de 100 μm utilizando un CITOMETRO de flujo apropiado (ver tabla de materiales). La compuerta strategy18 se muestra en la Figura 1E y la figura 4.
- Recoja las celdas clasificadas en buffers medios, ARN-posteriores, FACS o lisis dependiendo de los procedimientos descendentes (Figura 1E, F).
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Representative Results
Modelo de ratón para aislar SMA + MECs y pericitos
El protocolo establecido permite el aislamiento de dos poblaciones puras: MECs y pericitos de LGS y SMG (ver tabla 1). Estos dos tipos de células tienen un tamaño y apariencia diferentes. Pericytes microvasculares, se desarrollan alrededor de las paredes de los capilares (figura 5A) y tienen una forma cuadrada (figura 5b), mientras que los MECs rodean el ACINI secretor de LG, tienen procesos largos y ocupan un área relativamente grande (figura 5A, B ). El procedimiento descrito se basa en el etiquetado de células genéticas de SMA + en la cepa TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL . Adicionalmente, los anticuerpos EpCAM permiten a los investigadores distinguir el epitelial SMA+: las células epcam+ de origen ectodérmico (MECs) y las células de SMA+epcam de origen endodérmico (pericytes).
Preparación de la suspensión de una sola célula
El LG contiene una matriz extracelular filamentosa que debe ser digerida a fondo. El protocolo proporcionado permite la preparación de una solución de célula única para el análisis de FACS y otras aplicaciones. El ejemplo de celdas disociadas se muestra en la figura 3.
MEC y el aislamiento de pericytes por FACS
Para distinguir los MECs de los pericytes, las células individuales se teñían con anticuerpos de EpCAM, que sólo detecta células epiteliales. La población principal de las células fue determinada por la compuerta de la zona de dispersión hacia adelante y hacia el lado (figura 4a). Los dobletes se excluyeron trazando el área de dispersión hacia delante frente a la anchura y con el área de dispersión lateral frente a la anchura (Figura 4B). La exclusión de células muertas se realizó a través de Ghost red 780 (colorante de viabilidad) (figura 4C). Se utilizó un control sin etiquetar (figura 4E), control de fondo y control de anticuerpos etiquetados con un único anticuerpo primario para determinar el ruido de fondo (Unión de anticuerpos no específicos) y para establecer una compensación adecuada para una separación óptima entre las señales (Figura 4D). Los análisis de datos se realizaron utilizando el software FlowJo.
Los MECs y los pericitos fueron cercada por el etiquetado DsRED. Se detectaron las células DsRed+ DIM (no mostrada) y DsRED+ Bright dentro de las poblaciones de MEC y de células de pericyte (Figura 4D). El brillo de las células etiquetadas puede depender del nivel de la expresión SMA o del grado de activación del reportero tras la inyección de TM19. Sólo se recolectan las células de DS red+ Bright, ya que solo se requerían celdas completamente diferenciadas. Las poblaciones de células de DS rojo+ DIM requieren una mayor investigación.
Las aplicaciones descendentes
Es bien sabido que los MECs desempeñan una función contráctil importante en las glándulas exocrina. Por otra parte, son células muy plásticas y tienen características de las células madre. Por lo tanto, los MECs aislados podrían utilizarse en varias aplicaciones. Por ejemplo, las células pueden cultivarse, utilizarse para el aislamiento o trasplante de ARN (Figura 1F)12,20,21,22.
| Parámetro | La glándula lagrimal | La glándula submandibular |
| Número de ratones por muestra | 2 | 1 |
| Número de glándulas por muestra | 4 | 2 |
| Las glándulas disección | Separado de la glándula parótida | Separado de la glándula sublingual |
| Concentración de colagenasa por muestra | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Número celular aproximado después de la disociación enzimática | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Paso de recuperación (ver la sección "adulto de la glándula lagrimal del ratón de la disociación de una sola célula", punto 15) | Vuelva a suspender las células en 6 ml de medios de recuperación | Vuelva a suspender las celdas en 12 mL de medios de recuperación |
| Volumen del tampón FACS durante la tinción de anticuerpos | 400 μL | 2 tubos por 400 μL; es mejor dividir las células en dos o tres tubos que cada tubo no tiene más de 6x105 |
Tabla 1: modificaciones del protocolo para el aislamiento de las células de la glándula submandibular (SMG). La tabla describe las principales modificaciones requeridas para aislar los MECs y los pericitos de SMG murino en comparación con el procedimiento para el murino LG.
Figura 1: una representación esquemática del experimento. (A) inyecciones IP de la SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FLratones con TM. (B) aislamiento y picado del LG o SMG. (C) análisis del etiquetado celular mediante microscopio de fluorescencia. (D) digestión enzimática de varios pasos para preparar una solución de una sola célula. Es fundamental comprobar los pasos de digestión bajo un microscopio de luz para asegurar que las células se liberan de los racimos. (E) ejemplo de compuerta mostrando SMA + Bright DS red +/epcam + (MECs) y DS red + Bright/epcam-(pericytes). (F) los MECs y los pericitos recogidos podrían someterse a diferentes procedimientos intermedios, como el cultivo celular, el aislamiento de ARN y el análisis de la expresión génica y el trasplante celular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pasos críticos del aislamiento/mincing de LG. (A) eliminación de la piel entre el ojo y el oído para DISECCIONAR LG. el círculo amarillo discontinuo indica la ubicación de LG. (B) disección de LG. La punta de flecha amarilla señala el área entre las glándulas lagrimales y parótidas. (C) el picado de LG en medio de digestión usando tijeras con extremos curvados y romos. (D) transferencia de tejido picado en tubo de 2 ml. Punta de flecha amarilla representa el tamaño de agujero ancho 1 ml de punta necesaria para la transferencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: confocal y contraste de interferencia diferencial (Dic) imágenes que ilustran las células individuales disociadas de murino LG. (A-C) celdas individuales aisladas de dos LGS de un 4 meses de edad SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse. Los núcleos están manchados con DAPI (azul). Las puntas de flecha blancas denotan las células SMA + (DS red): MECs o pericytes. Barra de escala = 15 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: identificación de la murina LG MECs y pericitos utilizando FACS. (A) determinación de la población principal de células LG por compuerta de área de dispersión delantera y lateral. (B) exclusión de los dobletes a través del área de dispersión hacia adelante versus anchura. (C) exclusión de células muertas a través de Ghost red 780 (tinte de viabilidad). (D) las poblaciones de MEC (SMA+ Bright/epcam+) y pericyte (SMA+ Bright/epcam-) se distinguen por las manchas con anticuerpos epcam. (E) control sin etiquetar (celdas de tipo Wild mouse). En cada parcela se proporciona el% de las celdas cerradas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: imágenes confocales que muestran la diferencia en la distribución y la forma entre los MECs y los pericitos aislados de murino LG. (A) preparación de montaje integral de LG con células etiquetadas que muestran la diferencia en la distribución entre MEC y pericytes. (B) la forma de MEC y pericyte es diferente. Pericyte es relativamente pequeño y tiene forma de squired, mientras que MEC es grande y tiene forma irregular y varios procesos largos. Puntas de flecha = MECs y pericytes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este manuscrito describió un protocolo de MEC y aislamiento de pericytes de LG y SMG. Este procedimiento se basó en el etiquetado genético de SMA, el único biomarcador confiable de MECs y pericytes.
La urgencia de desarrollar este protocolo estaba motivada por la ausencia casi total de literatura que destacaba el aislamiento de los MECs de los LGs murinos y los SMG. Aunque el etiquetado genético fue utilizado previamente, utilizando ratones SMA-GFP para aislar las células SMA + de jóvenes de tres semanas de edad LGs12, no permitía el uso de estos ratones más viejos para el aislamiento celular debido a la pérdida parcial de la señal en ratones adultos. Además, las células etiquetadas con GFP dan un fondo relativamente alto en las aplicaciones de FACS23 y requieren compensaciones adicionales. Por el contrario, la línea SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse no muestra ni un fondo bajo y altos niveles de activación de etiquetado SMA a lo largo del desarrollo postnatal del ratón, la edad adulta y el envejecimiento. El uso de la SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL Mouse es especialmente importante para los estudios centrados en la progresión de la enfermedad o el envejecimiento, ya que las células SMA + en estos ratones podrían ser etiquetados antes del desarrollo de la enfermedad y estudiadas más tarde cuando enfermedad/envejecimiento progresa. Otro paso crítico del protocolo es la minuciosa picado de LG y la siguiente digestión. Este paso puede reducir el número de celda obtenido durante el análisis de FACS. En general, el aislamiento y el análisis inmediato de las células primarias también son importantes debido a cambios significativos en los perfiles transcripcionales de las células mantenidas en la cultura24.
Además, el protocolo descrito para el MEC y el aislamiento del pericyte de los LGs murinos permite los diversos procedimientos descendentes. Las extracciones de proteínas, ARN y ADN son posibles tanto de las poblaciones de una sola célula, aunque varios ratones/muestras deben procesarse en paralelo o secuencialmente para aumentar el número de células. Tomados en conjunto, los resultados obtenidos demuestran una forma eficaz y relativamente directa para el MEC y el aislamiento de los pericocitos de diferentes tejidos glandulares murinos.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún interés financiero competidor y no hay conflictos de ningún otro interés.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Ivo Kalajzic por proporcionarnos la cepa SMACreErt2 mouse, Takeshi umazume para el ratón de cola y genotipado, Mark Shelley para la adquisición de imágenes profesionales para la figura 2. También agradecemos al Consejo de editores científicos de Scripps y a Mark Shelley por la edición de inglés científico. Estamos agradecidos con el núcleo de citometría de flujo de Scripps Research Institute para la asistencia con la clasificación celular y para el Dr. Robin Willenbring para múltiples discusiones/consejos sobre el análisis de datos de FACS.
Este trabajo fue apoyado por los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de ojos otorga 5 r01 EY026202 y 1 r01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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