Summary
בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.
Abstract
בלוטת הדמעות (LG) היא בלוטת tubuloacexlayer האקסוקרינית אשר מפריש שכבה מימית של סרט דמעה. העץ האפיתל של LG מורכב של שכבתית, האפיתל ductal, ו מיואפיתל תאים (MECs). Mecs מבטא אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה. הם נמצאים באברים בבלוטות מרובים והם בעלי המקור העורי. בנוסף, LG מכיל את התאים SMA שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי הנקרא קרום הלב: תאים הקונאקטולה לעטוף את פני השטח של צינורות כלי דם. פרוטוקול חדש מאפשר לנו לבודד הן MECs ו-קרום הלב של LGs מבוגרים מורלין ובלוטות הלסת התחתונה (SMGs). הפרוטוקול מבוסס על התיוג הגנטי של MECs ו קרום הלב באמצעות SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל העכבר להתאמץ, ואחריו הכנה של LG תא יחיד ההשעיה עבור מיון התא המופעל פלואורסצנט (facs ). הפרוטוקול מאפשר הפרדה של שתי אוכלוסיות תאים אלה של מקורות שונים בהתבסס על הביטוי של המולקולה הדבקה תא האפיתל (EpCAM) על ידי MECs, ואילו קרום הלב לא לבטא EpCAM. ניתן להשתמש בתאים מבודדים לעיבוד תאים או לניתוח ביטוי גנטי.
Introduction
מיואפיתל תאים (MECs) נמצאים בבלוטות אקסוקרינית רבות כולל לקטמל, הרוק, הרדמי, זיעה, ערמונית, ופטמות. MECs הם סוג תא ייחודי המשלב האפיתל ואת שריר החלק פנוטיפים. Mecs express α-השריר החלקה אקטין (SMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה1,2. בנוסף ל-MECs, בלוטת lacrimal (LG) ואת בלוטת הלסת התחתונה (SMG) מכיל התאים SMA + כלי דם בשם קרום הלב, אשר הם תאים של מקור אנדועורי האופפים את פני השטח של צינורות וסקולרית3. למרות mecs ו קרום הלב לבטא סמנים רבים, SMA הוא הסמן היחיד שאינו מבוטא LG אחרים בתאי smg1,3.
בתוך 40 השנים האחרונות, מספר מעבדות שדווחו על הדיסוציאציה של רקמות בלוטת אקסוקרינית שונים, שבו הוחלו גישות לא אנזימטית ואנזימטית. באחד הדיווחים הראשונים שפורסמו בשנת 1980, פריץ ומחברים מתוארים בפרוטוקול לבודד את הפרוטריטיד החתול באמצעות עיכול רציף בתמיסה הקולגן/טריפסין פתרון4. ב 1989, Hann ומחברים הסתגלו פרוטוקול זה עבור בידוד acini מ-LGs חולדה באמצעות תערובת של הקולגן, hyaluronidase ו DNase5. ב 1990, Cripps ועמיתיו פרסמו את השיטה של דיסוציאציה לא אנזימטית של בלוטת לקטמל6. מאוחר יותר, בשנת 1998, Zoukhri ומחברים חוזרים לפרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית עבור הבאים Ca2 +-הדמיה ב-LG ו smg מבודדים acini7. בתוך העשור האחרון, החוקרים הפכו את המיקוד שלהם על בידוד של תאים גזע/מחולל קדמון בלוטות אקסוקרינית. Pringle ומחברים תיאר פרוטוקול ב 2011 לבידוד של העכבר בתאי גזע SMG8. שיטה זו התבססה על בידוד של תאי גזע המכילים כדורי סאליריים, אשר שמרו בתרבות. המחברים טענו כי תאים מתרבים המבטא תא גזע הקשורים סמנים יכול להיות מבודד אלה כדורי הערבה8. שטואים ומחברי החוליה פרסמו את הפרוטוקול עבור בידוד תא מחולל קדמון מידי מבוגרים שנפגעו LGs חולדה באמצעות עיכול אנזימטי ואיסוף "משוחרר" תאים9. מאוחר יותר, בשנת 2015, אקרמן ומחברים הסתגלו הליך זה כדי לבודד שוערת "מורין לקטמל תאי גזע בלוטת" ("mLGSCs") כי ניתן להפיץ כתרבות מונו שכבה על פני מספר מעברים10. עם זאת, אף אחד ההליכים לפני שהוזכר מותר להבדיל בין תת-סוגי הסלולר אוכלוסיות בודדות של תאים אפיתל מבודדים. בשנת 2016, מחלק מהגרובה והקוסופרים פרסמו הליך לבידוד של תאי גזע/מחולל בוגרים מ-LGs מבוגרים באמצעות FACS11. עם זאת, פרוטוקול זה לא נועד לבודד את MECs.
לאחרונה, הראינו כי אנו מסוגלים לבודד את התאים SMA + מתוך 3 שבוע בן SMA-GFP עכברים12. עם זאת, בשלב זה לא הפרידו אוכלוסיות שונות של SMA + תאים. כאן הקמנו הליך חדש עבור הבידוד הישיר של MECs הבדיל, קרום הלב מבוגרים LGs ו-SMGs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשימוש של מכון המחקר סקריפס. כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר העכברים ואת סבלם. כל החיות הנסיוניות קיבלו תזונה סטנדרטית עם גישה חופשית למים מהברז.
הערה: השלבים העיקריים עבור בידוד של MEC וכלי הקרום מתוארים באופן שולי באיור 1A-F. כל החומרים הריאגנטים והציוד המשמשים להליך זה מתוארים בטבלה 1.
1. עכברים ותוויות התאים SMA
- השימוש מבוגר (2-4 חודשים בן) טמוקסיפן-inducible, αSMA עכברים כתבת מונחה SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
הערה: הזן SMACreErt2 היה באדיבות סיפק ד ר Ivo kalajzic13. Rosa26-TdTomatoחליל/חליל (B6. Cg-Gt (רוזה) 26Sortm9 (קאג-tdTomato) Hze/j, הידוע גם בשם Ai9) זן (007909) נרכשו מהמעבדה ג'קסון (סקרמנטו, CA). התאים SMA + היו מסומנים על ידי מינהל טמוקסיפן הצפק (TM). -
הכנת תמיסת טמוקסיפן
- הכינו שמן תירס מסונן. השימוש 0.22 יקרומטר מסנן ואקום מאז שמן תירס הוא צמיגי.
- העבר 1 גר' אבקת TM מהבקבוק לתוך צינור 50 mL. הוסף 1 מ ל של אתנול לבקבוק, כובע לנער אותו לשטוף ולאחר מכן להוסיף לצינור 50 mL. חזור שוב עם עוד 1 מ ל של אתנול.
- הוסף שמן תירס מסוננים כדי להפוך 50 mL של 20 מ"ג/mL TM פתרון. מערבולת הצינור, לעטוף אותו בנייר כסף, ולשים אותו באמבט מים רועד או לרעוד בחממה ב 45 ° c.
- זה עשוי לקחת כ 12-24 h כדי לפזר את TM. מפעם לפעם, הסר את השפופרת ובדוק אם יש קריסטלים נותרים. לאחר TM הוא התפרקה לחלוטין, סדרת מחלקים ו לאחסן ב-80 ° c. ניתן לעשות שימוש חוזר בליquot מופעד.
-
כדי לתייג את התאים SMA +, הכנס עכברים intraperitoneally (IP) עם TM בשני ימים רציפים.
- הכנס 3-4 שבועות הישן SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/f כל עכברים מגדר עם TM ב 100 μl/20 גרם (או 2 מ"ג/20 גרם) משקל הגוף (איור 1a). עכברים מוכנים לשמש לבידוד התא ב 2-3 ימים לאחר הזרקת TM האחרון. במקרה הצורך, עכברים מוזרק ניתן להקריב בפרקי זמן ארוכים יותר לאחר הזרקת TM.
הערה: כפקדים עבור פיצוי הולם במהלך FACS, סוג אחד פראי (C57Bl/6) עכבר אחד SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל עכבר לא הוזרק עם TM (עם "מוכתם" mecs) של אותו גיל יהיה צורך. השתמש באותם חישובים שסופקו עבור 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל עכברים. לא מוזרק SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל יאפשר הערכה של הרקע dsred. העכבר C57Bl/6 ישמש שליטה שלילית של תאים בלתי מוכתמים.
- הכנס 3-4 שבועות הישן SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/f כל עכברים מגדר עם TM ב 100 μl/20 גרם (או 2 מ"ג/20 גרם) משקל הגוף (איור 1a). עכברים מוכנים לשמש לבידוד התא ב 2-3 ימים לאחר הזרקת TM האחרון. במקרה הצורך, עכברים מוזרק ניתן להקריב בפרקי זמן ארוכים יותר לאחר הזרקת TM.
2. פתרונות ומאגרים
הערה: LG היא מקור האפיתל בלוטת המכילה מטריצה מתוך החילוץ שהופך את הדיסוציאציה של תאים קשה. לכן, מומלץ להשתמש בשילוב מיוחד של אנזימים ובתהליך עיכול מרובה צעדים המתואר להלן.
-
מניות הקלד מניה סוג II (25x)
- התמוססות 120 מ ג של מסוג dispase 2 מ מ של 50 mM HEPES/150 מ"מ הנאקל להכין פתרון מניות 25x (הריכוז הסופי של dispase צריך להיות 30 יחידות/mL). יחידות לכל מיליגרם עשויות להשתנות בהתאם למספר העכברים והריכוז של ה-dispase להתאמה בהתאם.
- הכינו 200 μL ואחסן אותם ב-70 ° צ' עד 6 חודשים או 4 ° c למשך מספר ימים. לא להקפיא/להפשיר את סדרת מחלקים של dispase יותר מפעם אחת כדי למנוע השפלה אנזימים.
-
מניות סוג DNase I
- לפזר 5 מ"ג של DNase סוג אני אבקת בתמיסה 5 mL של 50% גליצרול, 20 מ"מ מאגר Tris (pH 7.5), ו 1 מ"מ MgCl2 (ריכוז במלאי צריך להיות כ 2000 יחידות/mL). יחידות לכל מיליגרם עשויות להשתנות בהתאם למספר העכברים ולכן יש לכוונן את הריכוז של DNase בהתאם.
- סנן את פתרון המניה באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ומזרק 10 מ"ל.
- הכינו 200 μL ואחסן אותם ב-70 ° צ' עד 6 חודשים או 4 ° c למשך מספר ימים. אין להקפיא/להפשיר יותר מפעם אחת כדי למנוע השפלה אנזימים.
-
מדיום לעיכול
- עד 10 מ ל של גלוקוז נמוך Dמאמ ללא גלוטמין, להוסיף 100 μL של תוסף תרבות התא (למשל, גלוטמקס, ראה טבלת חומרים) עבור דילול של 1:100.
- כדי 2 mL של גלוקוז נמוך dמאמ עם תוספת של תרבות התא, להוסיף 6 מ"ג של קולגן הסוג אני ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף (אנזים על קרח רטוב), 160 μl של פתרון מניות dispase (2.4 u/ml הריכוז הסופי), 16 μl של dnase סוג I מניות פתרון (8 u/ml הריכוז ה , ו 12 μL של 1 M CaCl2 (6 מ"מ ריכוז סופי).
הערה: סידן נדרש כדי להגדיל את פעילות אנזימטית14,15. כל החישובים ניתנים לבידוד של תאים מארבע בלוטות לקונות משני עכברים מבוגרים. הנפח של מדיום העיכול עשוי להשתנות בהתאם לכמות הרקמה ומספר השכפל. אין להשתמש ביותר מ 4 בלוטות lacrimal מ 2-4 חודשים של עכברים ישנים למדיום 2 mL.
-
חסימת בינונית I
- כדי 25 מ ל של DMEM/F-12, להוסיף FBS (15% הריכוז הסופי), 250 μL של תוסף תרבות התא (ראה טבלת חומרים) עבור דילול של 1:100, ו 50 μl של 0.5 M Edta pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
הערה: מבין הסוגים השונים של המדיום ששושוו לפרוטוקול זה/F-12 נתן את התוצאות הטובות ביותר. בינונית זו שימש גם חוקרים אחרים כדי לבודד/תרבות תאים אפיתל16,17.
- כדי 25 מ ל של DMEM/F-12, להוסיף FBS (15% הריכוז הסופי), 250 μL של תוסף תרבות התא (ראה טבלת חומרים) עבור דילול של 1:100, ו 50 μl של 0.5 M Edta pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
-
חסימת בינונית 2
- כדי 25 מ ל של PBS, להוסיף 50 μL של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
-
מדיום שחזור
- כדי 2 mL של HBSS בתוספת עם 5 mM MgCl2, להוסיף 100 μl של dnase סוג אני מניות פתרון 100 U לכל 2 mL ריכוז סופי. ריכוזים גבוהים יחסית של DNase-סוג אני נדרש כדי להפחית את הצבירה של תאים אפיתל.
-
מיון תאים מופעל מפני קרינה פלואורסצנטית (FACS)
- כדי 486.5 mL של PBS, להוסיף 12.5 mL של סרום (2.5% הריכוז הסופי) ו 1 mL של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
הערה: ניתן לאחסן את המאגר ב -4 ° c במשך 6 שבועות לכל היותר.
- כדי 486.5 mL של PBS, להוסיף 12.5 mL של סרום (2.5% הריכוז הסופי) ו 1 mL של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
3. העכבר למבוגרים לקציר קצירת בלוטת מיקרודיסקציה
- התקן את העכבר על-ידי אינהלציה של שאיפה (כוונן את קצב הזרימה של isofלאנה או את הריכוז ל-5% או יותר) והקרבת הקורבן באמצעות נקע בצוואר הרחם. לבצע הרדמה והמתת חסד על פי המלצות IACUCs מוסדיים.
- באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, להסיר את העור בין העין והאוזן (איור 2A).
- כדי לנתח LG, בעדינות למשוך LG באמצעות מספריים באותו זמן לשרוט את רקמת החיבור סביב LG באמצעות קצה חדה של מספריים קטנים כדי לשחרר אותו (איור 2B).
- הימנע חיתוך עם מספריים, כמו LG בלוטות הרוק הפרוטיד ממוקמים קרוב מאוד זה לזה ויש להפריד לפני ניתוח. כאשר בלוטות הפרוטיד LG ו מופרדים, לחתוך את LG החוצה באמצעות מספריים. מניחים בלוטות לתוך צלחת 35 מ"מ עם 2 מ ל של ה-PBS קר (לשמור על הקרח) (איור 1B).
-
כמו LG מכוסה על ידי כמוסה רקמת חיבור/מעטפה, לקצץ כל שומן סביב רקמת החיבור תחת מיקרוסקופ מבתר ולהסיר את הקפסולה LG עם שני מלקחיים.
- חזור על שלב זה עבור כל הבלוטות.
- בדוק פיסת רקמה קטנה תחת מיקרוסקופ פלורסנט כדי להבטיח תיוג תאים (איור 1C).
4. הכנת מתלה חד תאי LG
- העבר את כל lgs לתוך צלחת 35 mm עם 0.5 mL של טמפרטורת החדר (RT) מדיה העיכול ו lgs האוהב באמצעות מספריים קטנים לתוך חתיכות קטנות מאוד (כ 0.2-1 יקרומטר2). בדרך כלל, זה לוקח בערך 3 דקות כדי האוהב 4 LGs (איור 2C).
- העברת רקמות כתוש לתוך הצינור התחתון 2 מ ל בתוך התחתית באמצעות מסנן לרוחב מנשא צינורות. השתמש בעצה בגודל רגיל של פיפטה כאשר הקצה נחתך (איור 2D).
- הוסיפו עד 2 מדיום לעיכול וערבבו על ידי היפוך הצינורית.
- מניחים צינור באינקובטור רועד (או אמבט מים מטלטל), ב 37 ° c, 100-120 סל"ד עבור 90 דקות.
- כל 30 דקות לאט בלוטת פיפטה חתיכות 20-30 פעמים באמצעות טיפ 1,000 μL מסנן עם הגודל היורד (איור 2D). לאחר דגירה/trituration, לקחת 10 μl סדרת מחלקים ולבדוק תחת מיקרוסקופ עבור אשכולות. אם האשכולות ממשיכים להתמיד, המשיכו בעיכול.
- לאחר 90 דקות, לעבור את המדגם 2-3 פעמים דרך מחט מזרק אינסולין (31G) כדי לשחרר עוד תאים לתוך השעיה.
הערה: אין לראות חתיכות בלוטת לפני ה, צריך להישאר בפתרון לאחר השלמת העיכול (איור 1D). - העברת תא הבולם לצינור 15 מ"ל ולהוסיף חסימת סוג המדיה אני עד סך של 5 מ ל. היפוך הצינור 2-3 פעמים כדי לערבב.
- להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר ממוקם על שפופרת 50 mL. שטוף את מסננת עם 1 mL של חסימת סוג מדיה I. חזור על שלב 4.8 שנית.
- דגימות צנטריפוגה ב 0.4 x g עבור 5 דקות ב RT.
- . ומכה את הסופרנטאנט Re-להשעות תאים ב 2 מ ל של חסימת בינונית סוג II באמצעות קצה הצינור 1 mL ולהעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
- צנטריפוגה את התאים ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 מ ל רוטור; ראה טבלה של חומרים) עבור 3 דקות ב RT.
- משוף מחדש את התאים בתוך 1 מ ל של פתרון ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים).
הערה: כאן, הפתרון לניתוק התא הוא Accutase אנזים מקור ימיים עם פרוטנוגד חרדה ו הקולגן פעילות הניתוק/התנתק תאים לניתוח של סמני פני השטח התא. - התאים הדגירה ב 37 ° צ', ב 100-120 rpm עבור 2-3 דקות. העיכול עם פתרון ניתוק תאים עלול להזיק לקרומים הסלולריים.
- העברת תא הבולם לתוך צינור 50 mL ולהוסיף 10 מ ל של חסימת סוג בינוני I. צנטריפוגה הצינור ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 הרוטור מ ל; ראה לוח חומרים) עבור 5 דקות.
- להיפטר supernatant ו-להשעות מחדש תאים ב 6 מ ל של מדיית התאוששות ותאי דגירה עבור 30 דקות ב RT.
- בדוק 10 μL של השעיית תא מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את הדיסוציאציה המלאה של התא (איור 3).
- ספירת תאים באמצעות מונה תאים וטריבין כחול. בדרך כלל, אנו מצפים 4 x 105-6 x 106 תאים מארבע lgs (מדגם אחד).
- בתאי צנטריפוגה ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 הרוטור mL; ראה טבלה של חומרים) עבור 3 דקות ב RT ולהמשיך לצביעת נוגדנים.
5. מכתים את הנוגדן
- הוסף עד 5 x105 תאים לצינור 2 מ ל המכיל 400 μl של מאגר facs. להוסיף 5 μL של סגול מבריק 421 נגד עכבר CD326 (EpCAM) ו 0.5 μL של Ghost אדום 780 (הכדאיות צבען).
- במקביל, הכן פקדים להתאמת הפיצוי של FACS:
שליטה שלילית -1 (תאים מעכבר סוג פראי)
בקרת רקע תאים בלתי מוכתמים מתוך SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל
Cy7-780 תאים ויטראז (תאים מן העכבר סוג פראי ומוכתם עם Ghost אדום 780 הכדאיות צבען)
EpCAM-מבריק סגול 421 (תאים מעכבר סוג פראי מוכתם עם EpCAM-מבריק ויולט 421 נוגדן).
הערה: עבור כל מדגם פקד להשתמש לפחות 1 x 105 תאים לכל 400 μl של מאגר facs. - לאחר הוספת כל לערבב תאים מגיב ביסודיות על ידי ליטוף.
- לעטוף שפופרת (s) עם נייר כסף ולסובב צינורות עבור 45 דקות ב 4 ° c.
- דגימות צנטריפוגה ב 0.4 x g (הרוטור 24 x 1.5/2.0 mL; ראה לוח חומרים) עבור 3 דקות ב 4 ° c.
- השהה מחדש תאים ב-1 mL של מאגר FACS. חשוב לשטוף תאים כדי להקטין את הרקע במהלך הפיצוי.
6. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל
- העברת תא ההשעיה לתוך 5 מ ל FACS צינורות ולהמשיך עם ניתוח FACS. . לשמור על התאים בקרח
- התאם פיצוי באמצעות פקדי צבע יחיד.
- מיון תאים ב 20 psi דרך זרבובית 100 יקרומטר באמצעות הזרימה המתאימה cytometer (ראה טבלת חומרים). Strategy18 מוצג באיור 1E ובאיור 4.
- לאסוף תאים ממוינים לתוך בינונית, RNA-מאוחר יותר, FACS או מאגרי הליזה בהתאם להליכי המטה (איור 1E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל העכבר כדי לבודד SMA + MECs ו קרום הלב
הפרוטוקול הוקם מאפשר בידוד של שתי אוכלוסיות טהורות: MECs ו קרום הלב מ-LGs ו-SMGs (ראה שולחן 1). לשני סוגי תאים אלה יש גודל ומראה שונים. קרום הלב מיקרוציטים, לפתח סביב קירות נימים (איור 5A) ויש להם צורת בריבוע (איור 5a), בעוד mecs להקיף את הפרשה LG acini, יש תהליכים ארוכים לכבוש שטח גדול יחסית (איור 5a, B ). ההליך המתואר מבוסס על תוויות תא גנטי של SMA + ב-TM inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל העכבר להתאמץ. עם זאת, נוגדנים EpCAM לאפשר לחוקרים להבחין האפיתל SMA+: epcam+ תאים של מקור Ectodermal עורי (MECS) ו SMA +epcam תאים של מקור אנדועורי (קרום הלב).
הכנת מתלה חד תאי
LG מכיל מטריקס מסחטות filamentous כי יש לעכל ביסודיות. הפרוטוקול שסופק מאפשר הכנה של פתרון תא בודד עבור ניתוח FACS ויישומים נוספים. הדוגמה של תאים שאינם מוצגים מוצגת באיור 3.
בידוד לקרום הלב על ידי FACS
כדי להבדיל MECs מקרום הלב, תאים בודדים היו מוכתמים בנוגדן ל-EpCAM, אשר מזהה רק תאים אפיתל. האוכלוסייה העיקרית של תאים נקבע על ידי משטח פיזור קדימה ובצד (איור 4A). Doublets לא נכללו על ידי התוויית אזור פיזור קדימה לעומת רוחב עם אזור פיזור בצד לעומת רוחב (איור 4B). הדרה מתים מת נעשה באמצעות Ghost אדום 780 (הכדאיות צבען) (איור 4C). שליטה ללא תווית (איור 4E), בקרת רקע ובקרת נוגדנים המסומנים בנוגדן ראשוני אחד שימשו כדי לקבוע את רעשי הרקע (לא ספציפית נוגדן מחייב) וליצור פיצוי נאות עבור הפרדה אופטימלית בין אותות (איור 4D). ניתוח נתונים בוצעו באמצעות תוכנת FlowJo.
מניות וכלי קרום הלב היו מגודרת על ידי תיוג DsRed. DsRed+ עמעום (לא מוצג) ו-dsred+ תאים בהירים בתוך אוכלוסיית התאים מMEC וכדוריות הדם זוהו (איור 4d). הבהירות של תאים המסומנים בתווית עשוי להיות תלוי ברמה של ביטוי SMA או מידה של הפעלת עיתונאי על הזרקת TM19. רק האוכלוסייה DS אדום+ התאים בהירים נאספו מאז רק תאים הבדיל במלואם היו נדרשים. האוכלוסיות של DS אדום+ עמום דורשות חקירה נוספת.
יישומים במורד הזרם
ידוע היטב כי MECs לשחק בפונקציה הקונקטילה חשוב בלוטות אקסוקרינית. יתר על כן, הם תאים מפלסטיק מאוד יש תכונות של תאי גזע. לכן, מבודדים MECs ניתן להשתמש ביישומים מרובים. לדוגמה, תאים יכולים להיות מתורבתים, משמש עבור בידוד RNA או השתלת (איור 1f)12,20,21,22.
| פרמטר | בלוטת הנפילה | בלוטת הלסת |
| מספר העכברים לכל מדגם | 2 | 1 |
| מספר בלוטות לכל מדגם | 4 | 2 |
| בלוטות חיתוך | נפרד מבלוטת הפרוטיד | הפרדה בין בלוטת המשנה |
| ריכוז הקולגן למדגם | 6 מ"ג לשני מ"ל | 9 מ"ג לשני מ"ל |
| מספר תא משוער לאחר דיסוציאציה אנזימטית | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| שלב ההחלמה (עיין בסעיף "למבוגרים בלבד לפני השימוש בלוטת העכבר הבודד דיסוציאציה תא יחיד", נקודה 15) | השעיה מחדש של תאים ב 6 מ ל של מדיית שחזור | השעיה מחדש של תאים ב 12 מ ל של מדיית שחזור |
| נפח של מאגר FACS במהלך מכתים נוגדנים | 400 מיקרומטר | 2 צינורות על ידי 400 μL; עדיף לפצל את התאים לשניים או שלושה צינורות כי כל צינור יש לא יותר מ 6x105 |
טבלה 1: שינויים בפרוטוקול לבידוד תאים מבלוטת הלסת התחתונה (SMG). הטבלה מתארת שינויים מרכזיים הנדרשים כדי לבודד MECs ו קרום הלב של מורטין SMG בהשוואה עם ההליך עבור LG מורלין.
איור 1: ייצוג סכמטי של הניסוי. (א) זריקות IP של SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חלילעכברים עם TM. (ב) בידוד והנחת LG או smg. (ג) ניתוח תיוג תאים במיקרוסקופ פלואורסצנטית. (ד) עיכול מרובה-צעדים אנזימטי כדי להכין פתרון של תא בודד. חשוב לבדוק את צעדי העיכול תחת מיקרוסקופ קל כדי לוודא שהתאים משתחררים מאשכולות. (ה) דוגמה של מציג מראה SMA + מוארת ds אדום +/epcam + (mecs) ו-DS אדום + בהיר/epcam-(קרום הלב). (ו) שנאסף mecs ו קרום הלב יכול להיות נתון הליכים שונים במורד הזרם, כולל טיפוח התא, בידוד RNA וניתוח ביטוי גנים השתלת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צעדים קריטיים של LG בידוד/מינוב. (א) הסרת העור בין העין והאוזן כדי לנתח LG. מעגל צהוב מקווקו מציין מיקום LG. (ב) הקרע LG. ראש החץ הצהוב מצביע על האזור שבין בלוטות האקרימאל לבין הבלוטות. (ג) LG טחנה באמצעי עיכול בינונית באמצעות מספריים עם קצוות מעוקלים וקהה. (ד) העברה של רקמות טחון לתוך שפופרת 2 מ ל. ראש חץ צהוב מתאר רחב נשא בגודל 1 מ"ל טיפ נדרש להעברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קונמוקד ו ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) תמונות הממחישות תאים יחידים בודדים מבית LG מורלין. (A-C) תאים בודדים מבודדים שני lgs של אחד 4 החודש SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/fl עכבר. גרעינים הם מוכתמים DAPI (כחול). ראשי חץ לבנים לציין SMA + (DS אדום) תאים: MECs או קרום הלב. סרגל קנה מידה = 15 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי של מורטין LG mecs ו קרום הלב באמצעות FACS. (א) קביעת האוכלוסייה העיקרית של התאים LG על ידי קדימה ולאחר פיזור באזור. (ב) החרגה של doublets באמצעות שטח פיזור קדימה לעומת רוחב. (ג) הדרה של תא מת דרך גוסט אדום 780 (הכדאיות צבען). (ד) MEC (sma + מוארת/epcam+) ו קרום הלב (Sma+ מוארת/epcam-) אוכלוסיות מבוססות על כתמים עם נוגדן epcam. (ה) בקרה ללא תווית (תאים מעכבר סוג פראי). בכל חלקה מסופקים% התאים הנמצאים בפיקוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות confocal וקד מראה הבדל הפצה וצורה בין MECs ו קרום המוח מבודדים מתוך LG מורלין. (א) הר שלם הכנה של LG עם תאים המסומנים בתווית מראה הבדל התפלגות בין MEC לבין כרוציטים. (ב) הצורה של MEC וכלב הקרום שונה. לקרום הלב קטן יחסית והוא מכיל צורה של סקווירד, ואילו MEC גדול ובעל צורה לא סדירה ומספר תהליכים ארוכים. ראשי חץ = מאחד וכלי קרום הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה תיאר פרוטוקול של בידוד לקרום הלב של LG ו-SMG. הליך זה היה מבוסס על תיוג גנטי של SMA, הסמנים האמינים היחיד של MECs ו קרום הראש.
הדחיפות לפיתוח פרוטוקול זה היה מונע על ידי העדר כמעט מוחלט של ספרות המדגיש את הבידוד של MECs מ murine LGs ו-SMGs. למרות תיוג גנטי שימש בעבר, שימוש בעכברים SMA-GFP כדי לבודד את התאים SMA מגיל שלושה צעירים LGs12, זה לא מאפשר את השימוש אלה עכברים ישנים לבידוד התא בשל אובדן חלקי של האות בעכברים למבוגרים. בנוסף, תאים GFP התווית לתת רקע גבוה יחסית ב-FACS יישומים23 דורש פיצוי נוסף. לעומת זאת, SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl קו העכבר מראה לא או רקע נמוך ורמות גבוהות של הפעלת תיוג SMA במהלך התפתחות העכבר לאחר הלידה, לבגרות והזדקנות. שימוש של SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl העכבר חשוב במיוחד עבור מחקרים התמקדו התקדמות המחלה או הזדקנות, מאז SMA התאים בעכברים אלה יכול להיות מתויג לפני פיתוח מחלות ולמד מאוחר יותר כאשר מחלה/הזדקנות מתקדמת. צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא מדיטציה LG יסודית והעיכול הבא. שלב זה עשוי להקטין את מספר התאים שהושג במהלך ניתוח ה-FACS. באופן כללי, בידוד וניתוח מיידי של תאים ראשוניים חשוב גם בשל שינויים משמעותיים בפרופילים הטרנסקריפטריים של תאים הנשמרים בתרבות24.
בנוסף, הפרוטוקול המתואר בנוגע לבידוד של משפחת מורלין ממורין LGs מאפשר הליכים שונים במורד הזרם. חלבון, רנ א ועקירת DNA הם אפשריים הן אוכלוסיות בודדות תאים, אם כי כמה עכברים/דגימות צריך להיות מעובד במקביל או ברצף כדי להגדיל את מספר התאים. יחד עם זאת, התוצאות המתקבלות מדגימות דרך יעילה וברורה יחסית לבידוד מתוך רקמת הבלוטות של מורטין שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים ולא קונפליקטים של אינטרסים אחרים.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר Ivo Kalajzic עבור מתן לנו עם מאמץ העכבר SMACreErt2 , טאקשי umazume למעקב העכבר הגנואיות, מארק שלי לרכישת תמונות מקצועיות לאיור 2. כמו כן, אנו מודים למזכיר המועצה לעורכים מדעיים ומארק שלי לעריכה באנגלית מדעית. אנו אסירי תודה על מכון המחקר סקריפס זרימה Cy, ליבה לסיוע עם מיון תאים וכד Dr. רובין וילאנביא עבור דיונים מרובים/ייעוץ בניתוח נתונים של FACS.
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לעיניים מענקים 5 R01 EY026202 ו 1 R01 EY028983 ל H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
