Summary
Her presenterer vi en protokoll for en in vitro scratch analysen ved hjelp av primære fibroblaster og for en in vivo hud såret healing analysen i mus. Begge analysene er enkle metoder for å vurdere in vitro-og in vivo-sår helbredelse.
Abstract
Nedsatt hud såret healing er en stor bekymring for pasienter som lider av diabetes og for eldre mennesker, og det er behov for en effektiv behandling. Hensiktsmessig in vitro og in vivo tilnærminger er avgjørende for identifisering av nye målmolekyler for narkotika behandlinger for å forbedre huden sår helbredelsesprosessen. Vi identifiserte β3 delenhet av spennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke såret healing i to uavhengige analyser, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. Primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) akutt isolert fra vill-type (WT) og CAVβ3-mangelfull mus (CAVβ3 ko) eller FIBROBLASTER akutt isolert fra WT mus behandlet med siRNA å ned-regulere uttrykket av Cacnb3 Gene , koding CAVβ3, ble brukt. En ripe ble brukt på en confluent celle monolag og gapet nedleggelsen ble fulgt ved å ta mikroskopiske bilder på definerte tidspunkt poeng til fullstendig Repopulation av gapet ved å migrere celler. Disse bildene ble analysert, og cellen migrasjon rate ble bestemt for hver tilstand. I en in vivo-analyse implantert vi en rygg skinfold kammer på WT og Cavβ3 KO mus, anvendt en definert sirkulær sår på 2 mm diameter, dekket såret med et glass dekkglass for å beskytte den mot infeksjoner og uttørking, og overvåket makroskopisk såret nedleggelse over tid. Såret lukking var betydelig raskere i Cacnb3-genet-mangelfull mus. Fordi resultatene av in vivo og in vitro-analysene samsvarer godt, kan in vitro-analysen være nyttig for screening med høy gjennomstrømming før validering av in vitro-treffene ved in vivo-såret helbredende modell. Det vi har vist her for vill-type og CAVβ3-mangelfull mus eller celler kan også være aktuelt for spesifikke molekyler enn Cavβ3.
Introduction
Skin sår healing starter umiddelbart etter hudskader for å gjenopprette hudens integritet og for å beskytte organismen fra infeksjoner. Sår helbredelsesprosessen går gjennom fire overlappende faser; blødnings, betennelse, nye vevs dannelse og vevs remodeling1. Celle migrering er avgjørende i disse fasene. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endothelial celler, og fibroblaster er aktivert på ulike tidspunkt poeng og invadere såret området2. Metoder for å undersøke såret healing in vitro og in vivo er av stor interesse ikke bare å forstå de underliggende mekanismene, men også for å teste nye legemidler og å utvikle nye strategier som tar sikte på å forbedre og akselerere huden sår helbredelse.
For å overvåke og analysere celle migrering, kan du bruke scratch Migration-analysen. Det er ofte referert til som in vitro såret healing analysen. Denne metoden krever en cellekultur anlegg3. Det er en enkel prosedyre, er det ikke behov for High-End utstyr og analysen kan utføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analysen er en celle-fritt område skapt av mekanisk forstyrrelse av en confluent celle monolag, fortrinnsvis epitel-eller endothelial-lignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten av scratch vil migrere for å gjenbefolke det opprettede gapet. Kvantifisering av den synkende celle-fritt område over tid ligner migrasjon hastighet og indikerer tiden, som cellene trenger for å lukke gapet. For dette formålet, kan etterforskere bruke enten akutt isolerte celler fra WT mus eller mus mangler et gen av interesse4, eller udødeliggjort celler tilgjengelig fra pålitelige celle repositories. Scratch analysen gjør det mulig å studere påvirkning av farmakologisk aktive forbindelser eller effekten av transfekterte cDNAs eller siRNAs på celle migrasjon.
In vivo, er sår helbredelse en kompleks fysiologisk prosess, som krever ulike celletyper, inkludert keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endothelial celler for å gjenopprette hudens fysiske integritet så raskt som mulig1 . Ulike metoder for å studere in vivo såret healing har blitt utviklet og brukt i de siste5,6,7,8. Rygg skinfold kammeret beskrevet i denne artikkelen ble tidligere brukt til sår healing-analyser9. Den brukes som en modifisert rygg skinfold kammer forberedelse til mus. Den modifiserte skinfold kammer modellen har flere fordeler. 1) det minimerer hud sammentrekning, som hindrer observere sår helbredelsesprosessen og kan påvirke såret reparasjon i mus. 2) dette kammeret gjør bruk av dekker såret med et glass dekkglass, redusere vevs infeksjoner og uttørking, som kan forsinke helbredelsesprosessen. 3) blodstrøm og endometrial blodkar kan overvåkes direkte. 4) det tillater repeterende aktuell anvendelse av farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for å behandle såret og akselerere helbredelse9,10.
Vi identifiserte β3 delenhet av høyspennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke huden såret healing ved hjelp av to uavhengige protokoller, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. For in vitro-analysen, brukte vi primære fibroblaster, disse cellene gjør uttrykke Cacnb3 genet koding av Cavβ3 protein, men mangel depolarization-indusert ca2 + tilstrømningen eller spennings avhengig ca2 + strømninger. Vi beskrev en ny funksjon av Cavβ3 i disse fibroblaster: Cavβ3 binder seg til Inositol 1, 4, 5-trisphosphate reseptor (IP3R) og begrensninger kalsium utgivelse fra endoplasmatiske retikulum. Sletting av Cacnb3 genet i mus fører til økt følsomhet av IP3R for IP3, forbedret celle migrasjon og økt hud såret reparasjon4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med etikk regelverket og dyrevelferd komiteer i Saarland og Saarland University.
1 primær cellekultur og siRNA transfeksjoner
Merk: i den beskrevne metoden brukes primær fibroblaster. Disse cellene spiller en avgjørende rolle i såret healing og vev remodeling11. I dette eksperimentet, det Cacnb3 genet, koding av Cavβ3 delenhet av høy spenning-gated kalsiumkanaler12 var ned-regulert, og dermed viser sin rolle i celle migrasjon in vitro og hud såret reparasjon in vivo4.
- Fremstilling av siRNA: før du rekonstituering av siRNAs, må du kort sentrifuger rørene for å sikre at innholdet er nederst. Rekonstituer av siRNAs i 100 μL RNase buffer (100 mM kalium acetate, 30 mM HEPES, pH 7,5) levert av produsenten ved en konsentrasjon på 20 μM. Dette er en lagerløsning av siRNAs.
- Alikvot denne lager løsningen ved 10 μL per rør (20 μM konsentrasjon) og oppbevares ved-20 ° c til bruk.
- Ved hjelp av en ultrafine permanent markør, markerer en 6-brønn plate med en horisontal linje på bunnen av hver brønn for å være i stand til å alltid identifisere samme scratch region av interesse og å følge sin nedleggelse.
Merk: 6-brønn kultur plater ble brukt i denne analysen fordi de er store nok til å gi nok plass og fleksibilitet til å bruke en konsistent, reproduserbar og vertikal ripe ved hjelp av en 200 μL pipette spissen over cellen monolag. Hvis et begrenset antall celler er tilgjengelige, et alternativ og trolig den kostnadseffektive måten ville være å bruke 12-eller 24-brønn kultur plater. - Plate primære fibroblaster, isolert fra vill-type og β3-mangelfull mus4, i en 6-brønn plate i en tetthet på 5 x 105 celler/godt i nærvær av 2 ml Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% FOSTERETS storfe serum (FCS).
Merk: 5 x 105 celler per brønn har blitt etablert for 6-brønn kultur plate og for primær mus fibroblaster. Tester kan være nødvendig hvis du bruker 12-eller 24-brønn cellekultur plater eller andre celletyper, som kan være forskjellig i størrelse. Celler bør håndteres i et sterilt miljø som biologiske sikkerhetskabinett klasse II. - Merk den 6-brønn platen med celletypen, genotype og datoen.
- Flytt 6-brønn plate inn i cellen kultur inkubator og vedlikeholde celler ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 timer.
- Neste dag, ta tallerkenen ut av inkubator, aspirer celle kulturen medium ut av brønnen, kast den og erstatte den med 2,25 mL fersk kultur medium ved å legge den forsiktig mot veggen av brønnen.
- For å transfect fibroblaster med siRNAs, bruk en lipid-basert transfeksjoner reagens som anbefalt av produsenten.
- For hver transfeksjoner, Merk to mikrosentrifugen rør. I den første, tilsett 9 μL av transfeksjoner reagens og fortynne den med 150 μL redusert serum medium. I det andre røret legger du til 1,5 μL siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller forvrengt siRNA som en negativ kontroll) og fortynne den med 150 μL redusert serum medium.
- Tilsett fortynnet siRNA i røret som inneholder fortynnet transfeksjoner reagens og Vortex for 2 s. ruge blandingen i 5 min ved 21 ° c.
- Merk brønner med enten Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller kryptert siRNA. Tilsett 250 μL av siRNA-transfeksjoner reagens blanding dråpevis til cellene.
- Plasser 6-brønn kultur plate tilbake i inkubator og holde cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 72 h.
- For å kontrollere effektiviteten av Cacnb3 gen-deaktivering, samle transfekterte celler og utføre immunoblot analyser som beskrevet tidligere4.
2. in vitro såret healing analysen (scratch migrasjon analysen)
- Ta cellen kultur platen ut av inkubator og undersøke cellene under mikroskopet ved hjelp av 10x mål. Start med scratch analysen bare når de har nådd 100% confluency.
Merk: for nøyaktigheten og reproduserbarheten er 100% confluency en obligatorisk faktor for å starte scratch Migration-analysen. Derfor er det viktig å frø samme antall celler inn i kultur brønnene, for å undersøke hver brønn for confluency og å bruke scratch på samme tidspunkt (dag 0 confluency). Venter lenger etter at cellene nå 100% confluency kan fremkalle forskjellige svar. - Når cellen når 100% confluency, aspirer kulturen medium ut av brønnen og forkaste det.
- Bruk en pipette (200 μL) for å manuelt lage en ripe vertikalt på den horisontale linjen som er merket på bunnen av brønnen, over confluent celle monolag midt i brønnen.
- Skyll hver brønn to ganger med 2 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) for å fjerne de frigitte faktorene fra skadede celler, løse celler og rusk fra skrapte området. Tilsett 2 mL PBS nøye mot veggen av brønnen for å unngå å løsne celler fra celle kulturen godt.
- Tilsett 2 mL cellekultur medium som inneholder enten 10% serum eller 1% serum nøye til hver brønn.
Merk: det anbefales å utføre scratch analysen under 10% serum og under 1% serum for å bekrefte at den observerte effekten er forårsaket av celle spredning og migrasjon eller ved celle migrasjon bare. - Flytt platen til mikroskop scenen og ta lyse felt bilder av celle-fritt område (to områder per brønn) umiddelbart etter riper (t = 0h) med en 10x forstørrelse ved hjelp av et lett mikroskop. Til bilde alltid det samme området av scratch, bruk den horisontale linjen, som ble utarbeidet i trinn (1,3), og ta ett bilde over denne linjen og ett bilde under denne linjen. Lagre bilder som TIFF eller JPEG.
- Fordi mikroskopet scenen ikke opprettholder cellevekst tilstand, flytte platen tilbake til cellen kultur inkubator og holde cellene ved 37 ° c og 5% CO2.
- Etter 6, 10 og 30 timer flytter du platen til mikroskop fasen igjen og tar bilder på samme måte som beskrevet i trinn 2,6.
Merk: disse tids punktene er opprettet for den beskrevne prosedyren og for primær fibroblaster. Under det første forsøks eksperimentet ble det testet mer tid for å se hvor raskt fibroblaster gjenbefolke gapet. Selv om 0, 6, 10 og 30 t er rimelige starttidspunkt poeng, bør etterforskerne optimalisere og etablere riktig tidspunkt for hvert program og for hver celle type. Jo mer nøyaktig alternativ, hvis tilgjengelig, ville være å bruke time-lapse mikroskopi. - Bruke ImageJ13, kvantifisere den første celle-fritt område (100%) og det resterende området etter 6, 10 og 30 timer (figur 1). Prosentdelen av kladdeområdet som repopulated ved å migrere celler, beregnes deretter i forhold til det opprinnelige kladdeområdet.
3. analyse av kladdeområdet
- Åpne ImageJ programvare13.
- Sende det for det første image idet JPEG (e.g., 24-bit RGB profilen 1360x1024) av drop bildet inn i ImageJ meny stang.
- Velg knappen for valg av Frihånd og Merk det celle frie området
- Klikk på analyser og velg mål. Det vises et vindu med resultatene som inneholder områdeverdien.
- Overfør denne verdien til et analyse regneark.
- Gjenta trinn 3.2-3.5 for hvert bilde fra tid punkt 0 h og deretter starte på nytt for neste gang punkt 6, 10 og 30 h.
- Beregn prosenten av kladdeområdet repopulated ved å migrere celler etter 6, 10 og 30 t for hver ripe ved hjelp av følgende ligning:
a = celle fritt område av den første scratch, b = celle fritt område etter 6 h - Beregn gjennomsnittet og standardfeilen for middelverdien (S.E.M.) for prosentdelen av kladdeområdet som repopulated ved å migrere celler etter 6 timer. Vis data som et stolpediagram eller et punktdiagram.
4. in vivo hud såret healing analysen
Merk: C57BL/6 vill-type menn (8-12 uker gammel med 22-26 g kroppsvekt) og Cavβ3-mangelfull mus som kontroll brukes til denne studien.
- En dag før du starter eksperimentet, autoklav alle kirurgiske instrumenter, skruer, muttere og Titan rammer som skal brukes for skinfold kammer forberedelse.
Merk: Titan rammen er sammensatt av to symmetriske komplementære halvdeler, og den har en sirkulær Observasjonsvindu hvor såret vil bli påført og etterfulgt av mikroskopi (se figur 2a). - Bedøve en vill-type eller β3-mangelfull mus (22-26 g kroppsvekt) ved intraperitoneal (IP) injeksjon av 0,1 mL Saline/10 g kroppsvekt som inneholder en blanding av ketamin (75 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (25 mg/kg kroppsvekt). Sjekk dybden av anestesi ved mangelen på respons på en tå knipe.
Merk: denne injeksjon gir rundt 30 min kirurgisk anestesi og dybden av anestesi må styres gjennom kirurgisk prosedyre, ved å sjekke reflekser av musen. - For å unngå tørrhet eller skade på øynene, Påfør øye salve på begge øynene og gjenta søknaden om nødvendig.
- Forsiktig barbere musa antecubital, benytter en elektrisk barbermaskin føle etter av søknaden av en hårfjerning kremen å det barbere område å fjerne alle resterende håret. Pass på at du ikke skader muse huden. La hårfjerning krem for rundt 10 min for å fjerne alt håret.
- Forbered Titan kammer ved å ta en del av den symmetriske Titan kammer ramme og fest forbindelses skruene med nøtter på den ene siden. Disse mutrene vil fungere som en spacer for å holde 400-500 μm mellom de to symmetriske delene av kammeret for å unngå komprimering av blodkar i huden.
- Fjern kremen fra baksiden av musen og rengjør hår fri regionen med varmt (35-37 ° c) vann fra springen.
- Sørg for at stedet for å utføre operasjonen er ren, varm (37 ° c) og fuktet.
- Desinfisere hår fritt område av musen med hud desinfeksjonsmiddel. Ta en fold av ryggen huden på musen foran en lyskilde og posisjon midtlinjen av det doble laget av huden der Titan kammeret vil bli implantert. Etter det, fikse skinfold med en polypropylen Sutur cranially og caudally og stram den andre siden av Sutur på et metall rack for å løfte musen foldet huden. Juster høyden på stativet slik at musen kan sitte komfortabelt.
- Implantat Titan kammer i flippen på baksiden av musen på en måte å sandwich det foldet rygg hud lag mellom de to symmetriske halvdelene av Titan rammen. Fest første halvdel av Titan rammen med polypropylen sting på den overlegne kanten til baksiden av rygg skinfold.
NB: på Titan RAM men er det 8 hull på den overlegne kanten (figur 2a) og den foldet huden skal være godt festet med polypropylen sting på hver av de åtte hullene. - Før du flytter til neste trinn, sjekk reflekser av musen for å sikre at dybden av anestesi opprettholdes.
- Ved foten av skinfold, passerer de to kobler skruer, festet til første halvdel av Titan kammer, å trenge inn i skinfold fra tilbake til forsiden. Lag små snitt på huden (ved hjelp av fin saks) for å hjelpe glatt penetrasjon av forbindelses skruene.
- Løsne musen fra stativet og plasser den på en lateral posisjon. Sett den andre komplementære halvdelen av Titan kammer på toppen av de 3 skruene (se figur 2a) og påfør lett trykk med fingrene for å passere disse skruene gjennom andre halvdel av Titan rammen. Deretter reparerer du begge de symmetriske delene med nøtter i rustfritt stål.
- Vær forsiktig oppmerksom på tetthet av skruene på dette trinnet, siden det kan løsne, hvis det er for løst. I kontrast, hvis det er for stramt, vil det klemme skinfold, redusere blodstrøm og kan føre til vev svekkelse og nekrose.
Merk: nøtter som er klargjort i trinn 4,5, fungerer som en spacer for å holde en avstand på 400-500 μm mellom de to symmetriske halvdelene av Titan kammeret. Mutrene skal strammes til det føles litt motstand. - Skjær den resterende delen av skruene ved hjelp av tang.
Merk: det er nødvendig på dette trinnet for å bruke laboratorie vernebriller for øyebeskyttelse i tilfelle skruen kommer av feil vei. - Merk sårområdet med en standardisert biopsi punch (2 mm i diameter), i midten av huden innenfor observasjon vinduet (se figur 2a) av skinfold kammeret for å sikre reproduserbar sår størrelser.
- Ved å bruke fine tang og saks, lage en sirkulær sår innenfor det merkede området ved å fjerne hele huden med epidermis og dermis. Det endelige sårområdet vil være rundt 3,5-4,5 mm2, se figur 2b. Rengjør såret med 0,5 mL sterilt saltvann (0,9% NaCl, 37 ° c).
- Dekk såret med et glass dekkglass og fikse dette glasset dekkglass med en smekk ring ved hjelp av snap ring plier på Titan kammeret.
- Umiddelbart etter endt kirurgisk prosedyre, plassere musen på Imaging stadium av en stereomikroskopet utstyrt med et kamera og ta bilder (dag 0) under belysning. Bruk 40X forstørrelse og lagre bildene for fremtidig off-line analyse.
Merk: etterforsker skal undersøke bildene umiddelbart etter fangst for å sikre at kvaliteten er tilstrekkelig for fremtidige off-line analyser. Utarbeidelse av skinfold kammer og ytelse av huden såret tar rundt 30 minutter. - Hold musen på et varmt sted under utvinning fra anestesi i minst 2 t. Deretter overfører mus i individuelle bur tilbake til dyret anlegget (12 h lys/mørk syklus) og sørg for at mus har tilgang til mat og vann.
- Tre dager etter såret plassere musen i en mus-restrainer og fikse restrainer på toppen av Imaging scenen.
- Plasser scenen under en stereomikroskopet utstyrt med et kamera. Ta bilder under belysning med 40x forstørrelse, spille inn alle bilder og lagre dem for fremtidige off-line analyser
- Gjenta trinn 4,20 og 4,21 igjen på dag 6, 10 og dag 14 post-såret.
- Bruk sår bilder, for off-line analyse i ImageJ13. Såret området på dag 0 regnes som 100% og såret nedleggelse over tid er plottet i forhold til det opprinnelige såret området. Representative resultater er vist i figur 2c, d.
- Beregn prosenten (%) av sårområdet ved hvert tidspunkt ved hjelp av følgende ligning:
x: tidspunkt punkt (dag 0, 3, 10 eller 14), a: sårområdet på dag 0, b: sårområdet på tidspunktet punkt x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scratch-analysen ble utført på en confluent celle monolag av vill-type og β3-mangelfull MEFs (figur 1c). Når du har utført "scratch" ved hjelp av et 200-genotyper μL pipette, migrerer celler fra begge i kladdeområdet og lukker gapet. Bildene ble tatt etter 6, 10 og 30 h (figur 1a). Celle overføringen ble kvantifisert som prosentandel (%) av kladdeområdet repopulated ved å migrere celler 6 timer etter at du har utført scratch. Migrering av Cavβ3-mangelfull MEFs lukket kladdeområdet betydelig tidligere enn MEFs fra vill-type mus (figur 1a, b). For å utelukke noen effekt av celle spredning, ble scratch Migration analysen utført i nærvær av enten 10% eller 1% FCS. På 10% FCS begge prosessene er til stede, cellen spredning og migrasjon, mens på 1% FCS celle spredning er minimert. Fibroblaster i 10% (figur 1b, venstre) eller 1% FCS (figur 1b, høyre) viste en lignende migrasjon mønster, utelukker muligheten for celle spredning bidrag til Cavβ3 observert fenotype. Cavβ3-mangelfull MEFs lukket gapet betydelig tidligere enn vill-type MEFs under begge forholdene. For å bekrefte den Cavβ3-avhengige effekten som er observert i β3-mangelfull fibroblaster, ble vill-type fibroblaster transfekterte med siRNA for å regulere Cavβ3 proteinet (figur 1e). Som en kontroll for ned-regulering, immunoblots ble utført for å bekrefte effektiviteten av siRNA behandling. To uavhengige Cacnb3 -spesifikke SiRNAs (SiRNA1 og siRNA2), og en kryptert siRNA (som en kontroll) ble brukt. Fibroblaster behandlet med Cacnb3-spesifikke siRNAs oppfører seg som β3-mangelfull fibroblaster (figur 1d), dvs. migreringen er økt i fravær av Cavβ3 protein (figur 1e).
In vivo, rygg skinfold kammeret ble implantert (figur 2a, b) og en definert sirkulær sår på 2 mm diameter ble generert på barbert rygg (figur 2b) av vill-type og Cavβ3-mangelfull mus (8 dyr per genotype, 8-12 uker gammel og 22-26 g vekt). Såret ble utført ved å fjerne hele huden med epidermis og dermis. Å sammenligne huden såret helbredelse mellom begge genotyper, såret området i huden fold kammeret ble fotografert direkte etter såret (dag 0) og deretter bilder ble tatt 3, 6, 10 og 14 dager etter såret (figur 2c). Størrelsen på sårene ble målt på disse digitale bildene og sårområdet på en gitt dag ble uttrykt som prosentandel (%) av det første sårområdet (figur 2d). Sår lukking økes i β3-mangelfull mus sammenlignet med ville-type kontroller. I motsetning til de ville-type, såret i β3-mangelfull mus var nesten helt lukket allerede etter 10 dager. På dag 14 post-såret, sårene var helt lukket i begge genotyper (figur 2c, d).
Figur 1 : In vitro scratch migrasjon analysen. (a) representative bilder av kulturer fra vill-type (WT, venstre) og Cavβ3 ko (β3 ko, høyre) primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) umiddelbart, 6, 10 og 30 timer etter å ha utført en ripe. Bilder ble konvertert til 8-bits gråskala, og kontrasten, samt lysstyrke, ble tilpasset maksimalt visualisere cellen fritt område. Analyse av celle fritt område (% av kladdeområdet repopulated ved å migrere celler) ble utført på de opprinnelige 24-biters RGB-bildene. (b) stolpediagrammer som viser prosenter (%) av scratch Area repopulated ved å migrere celler etter 6 timer enten i nærvær av høy (10%, venstre) eller lav (1%, høyre) fosterets storfe serum (FCS) i vill-type (svart) og Cavβ3 KO (rød) eksperimenter (c) Immunoblot: protein ekstrakter fra vill-type hjernen (50 μg per kjørefelt) og fibroblaster (MEFs, 100 μg per kjørefelt) ved hjelp av et Cavβ3 spesifikt antistoff. Det β3 proteinet (55 kDa) er tilstede i vill-type hjernen (brukt som en kontroll), og fibroblaster, men er fraværende i protein ekstrakter av Cavβ3-mangelfull hjerne og fibroblaster fremstilt fra Cavβ3-mangelfull mus. (d) oppsummering av prosentandelen av kladdeområdet repopulated ved å migrere celler etter 6 timer i ville-type celler behandlet med enten eggerøre siRNA (kontroll, svart) eller to uavhengige Cacnb3 SiRNAs (siRNA1 og siRNA2, røde åpne barer). (e) tilsvarende immunoblot fra eksperimentet i (d). Data vises som gjennomsnittet ± SEM, p-verdier ble beregnet ved bruk av ikke-sammenkoblet tosidig student t-test. Paneler a og b er blitt modifisert fra [Belkacemi et al., 2018]4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : In vivo hud sår helbredelse hos mus. (a) Titanium ramme innvendig sidevisning som viser halvparten av Titan kammer og forsidevisning som viser samlet Titan kammer med to symmetriske halvdeler festet med skruer og muttere. (b) mus etter barbering av rygg huden og montering av rygg skinfold kammer bestående av to symmetriske Titan RAM mer (vekten av Titan RAM men er rundt 2 g) og påføre en sirkulær sår (2 mm diameter). (c) bilder av såret rett etter såret (dag 0) og 3, 6, 10 og 14 dager etter såret. Den kontinuerlige prosessen med å lukke såret, med fullstendig epithelialization, vises over 14 dager i vill-type (WT, Top) og Cavβ3 KO (β3 KO, bunn) mus. (d) på tidspunktet punktene indikert, såret området ble bestemt ved hjelp av en datamaskin-assistert bildeanalyse program og plottet som en prosentandel av sårområdet umiddelbart etter skade på dag 0 (gjennomsnittlig ± SEM av n = 8, β3 ko mus og tilsvarende Wild-type kontroll mus). P-verdier ble beregnet ved hjelp av toveis ANOVA og Bonferroni ' s Multiple sammenligninger test. Paneler c og d har blitt modifisert fra [Belkacemi et al., 2018]4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet, beskriver vi en in vitro og in vivo såret healing analysen og relatere resultatene oppnådd. For in vitro-analysen, brukte vi primær mus fibroblaster4,14,15 som spiller en viktig rolle i såret healing og vev remodeling11. Andre tilhenger celletyper som vokser som monolagere (f. eks, epitelceller, endothelial celler, keratinocytter) kan brukes også. Plating samme antall levedyktige og sunne celler og anvende scratch på samme grad av confluency er av overordnet betydning for å oppnå nøyaktig og reproduserbar resultater. Det anbefales sterkt å utføre biologiske og tekniske replikerer. I denne metoden, 6-brønn plater ble brukt, men 12-eller 24-brønn plater kan også brukes spesielt når celler er bare tilgjengelig med begrenset antall. I tilfelle av siRNA behandling, er immunoblot analyse etter hvert sett av eksperimenter obligatorisk å sørge for at målet protein er effektivt ned-regulert. Transfeksjoner reagens-og tidsvindu skal testes og velges for hver celle type før du begynner med migrerings analysen. I tilfelle av fibroblaster og Cacnb3 genet, tok det 3 til 4 dager for å nå ønsket nivå av ned-regulering. I motsetning til scratch migrasjon analysen trenger kortere tid (6 t til 24 h). For å unngå høy variasjon i kladde størrelsen, er det obligatorisk at den samme undersøkeren bruker grunnen for hvert sett eksperimenter, at lik trykk administreres av pipette spissen og for å holde såret så mye som mulig vertikal til den markerte linjen på bunnen av platen over cellen monolag. Anvendelse av en mekanisk ripe over celle monolag fører til frigjøring av ulike cellulære faktorer (f. eks, ATP) fra skadede celler til ekstracellulære plass. Disse faktorene vil indusere paracrine signalering inkludert ca2 +-signalering i nabocellene, som igjen ville påvirke cellulære responser16. For å unngå disse effektene, kultur inserts kan brukes for plating celler og etter fjerning av disse setter inn en celle-fri gap er opprettet uten å skade nabocellene17. For screening med høy gjennomstrømming kan etterforskerne vurdere å bruke instrumenter som er tilgjengelige på markedet for å skape reproduserbar og konsekvente riper i 96 brønn plater. Å følge cellen Migration Kinetics fortsatt over tid, brukernes kanne likeledes betenke benytter høy-end reklamen systemer for automatisk image fange. Automatiserte systemer for scratch-programmer og bildeopptak er imidlertid ikke alltid tilgjengelige på grunn av høye kostnader. En mer tilgjengelig og kostnadseffektiv løsning for time-lapse Imaging ville være for eksempel ved hjelp av systemet (ATLIS: en rimelig tid-lapse Imaging og inkubasjons system) beskrevet av Hernandez Vera og kolleger18.
I fravær av noen celle spredning hemmere, Repopulation av gapet i scratch migrasjon analysen er en kombinasjon av celle migrasjon og celle spredning. Hvis du bare vil overvåke celle migrering, kan celle spredning undertrykkes for eksempel ved behandling med enten Actinomycin C19 eller Mitomycin c20. Tilstrekkelige konsentrasjoner av disse forbindelsene må nøye bestemmes og testes for å unngå toksiske effekter av disse forbindelsene, som kan påvirke levedyktigheten til cellene og deres evne til å migrere. Som beskrevet i denne artikkelen, er serum sult eller reduksjon av serum konsentrasjonen i kultur mediet en annen måte å redusere virkningene av celle spredning. Serum sult brukes i flere andre celle-baserte analyser. Det kan indusere et høyt antall cellulære svar, som kan forstyrre de oppnådde resultatene og tolkninger21. Serum sult må nøye påføres og dens effekt på cellen levedyktighet bør vurderes før du starter eksperimentet. I denne artikkelen vises migrering av primær fibroblaster i nærvær av enten 10% eller 1% serum (se figur 1b). Overføringshastigheten, som forventet, er tregere ved lave konsentrasjoner av serum. Β3-mangelfull fibroblaster migrerer imidlertid raskere enn ville-type celler på begge betingelser; konsentrasjon av lavt og høyt serum.
Huden såret healing analysen ved hjelp av rygg skinfold kammeret er en relativt grei prosedyre for å undersøke huden såret nedleggelse over tid i vivo. Implantation av Titan rygg skinfold kammer ble beskrevet for første gang på rotter22. Sorgs et al. brukte denne teknikken i SKH1-HR barberte mus til å følge såret healing og dannelse av nye blodkar9. Den skinfold kammer modellen som er beskrevet i denne artikkelen har mange fordeler i forhold til den klassiske såret healing analyser utført på rygg hud, på øret23 eller hind lem7 av mus. Dekker såret området med et glass dekkglass hindrer infeksjoner og vev traumer og begrenser uttørking av såret. Observasjons kammeret dekket med glass dekkglass kan åpnes når som helst under helbredelsesprosessen, slik at lokal anvendelse av ulike farmakologisk aktive forbindelser (f. eks, siRNA for Cavβ3 som løsninger eller salver) og kammeret kan lukket igjen. Murine hud sår helbredelsesprosessen består av både sammentrekning og epithelialization24. Ved hjelp av rygg skinfold kammer i mus minimerer hud sammentrekning og gir mulighet til å studere hovedsakelig epithelialization prosessen. Det gir også et klart vindu for å observere og overvåke såret nedleggelse prosessen. En ulempe av Titan kammeret er at musen har til å bære Titan kammer, som har en vekt på rundt 2 g (7,7% av vekten av en 26 g mus), for 14 dager. Dette kan føre til noe ubehag for musen, selv om det virker som mus tåler godt dette kammeret, og de er komfortable og kan lett nå mat og vann. Huden såret healing modell som presenteres i denne artikkelen kan studere bare ett sår per mus. Andre publiserte metoder25,26 foreslår å bruke to sår per mus som ville redusere antall dyr som trengs for en studie. Det er av stor betydning å skape et sirkulært sår av lignende størrelse for alle mus for å få objektiv informasjon så vel som pålitelige og reproduserbar resultater. For å ta bilder av sårene over tid, var mus festet på en mus restrainer, plassert på en scene, og skinfold kammeret er plassert under en stereomikroskopet. Ved hjelp av restrainer bidrar til å unngå anestesi og minimere stress for mus. Mus kan bli ofret og vev fra de sårede området kan bli eksplanterte og samlet på ulike stadier av helbredelsesprosessen (enten etter fullstendig helbredelse eller på tidligere tidspunkt poeng) for histologiske analyse, RNA samling eller protein biokjemi.
Oppsummert har vi vist to teknikker, en in vitro scratch analysen bruker primære fibroblaster og en in vivo hud såret healing analysen i mus. I begge analysene økes sår helbredelse/gap lukking i fravær av Cavβ3 delenhet av spennings-gated kalsiumkanaler. Som med mus eller celler av vill type og Cavβ3-mangelfull, kan begge analysene godt relatere i fravær eller tilstedeværelse av andre spesifikke molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene Unit av SPF dyr anlegget (prosjekt P2 av SFB 894) av medisinsk fakultet og dyret anlegget ved Institutt for klinisk og eksperimentell kirurgi ved medisinsk fakultet Saarland University, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk lesning av manuskriptet. Denne studien ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, prosjekt a3 til A.B. og V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
