Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.
Abstract
Die zahngeschädigte Wundheilung ist ein großes Anliegen für Patienten mit Diabetes und für ältere Menschen, und es besteht bedarf einer wirksamen Behandlung. Geeignete In-vitro- und In-vivo-Ansätze sind für die Identifizierung neuer Zielmoleküle für medikamentöse Behandlungen unerlässlich, um den Wundheilungsprozess der Haut zu verbessern. Wir identifizierten die Untereinheit 3 von spannungsgebundenen Kalziumkanälen (Cav3) als potenzielles Zielmolekül, um die Wundheilung in zwei unabhängigen Assays zu beeinflussen, d.h. dem In-vitro-Scratch-Migration-Assay und dem in vivo dorsalen Hautfaltenkammermodell. Primäre mausembryonale Fibroblasten (MEFs) akut isoliert aus Wildtyp (WT) undCav3-defizienten Mäusen(Cav3 KO) oder Fibroblasten, die akut von mit siRNA behandelten WT-Mäusen isoliert wurden, um die Expression des Cacnb3-Gens zu regulieren , kodierte Cav3,wurden verwendet. Auf eine konfluente Zellmonoschicht wurde ein Kratzer aufgebracht, und auf den Lückenschluss folgten mikroskopische Bilder zu definierten Zeitpunkten bis zur vollständigen Wiederbesiedlung der Lücke durch die wandernden Zellen. Diese Bilder wurden analysiert, und die Zellmigrationsrate wurde für jede Bedingung bestimmt. In einem In-vivo-Test implantierten wir eine dorsale Hautfaltenkammer auf WT- und Cav3 KO-Mäuse, legten eine definierte kreisförmige Wunde von 2 mm Durchmesser auf, bedeckten die Wunde mit einem Glasdeckel, um sie vor Infektionen und Austrocknung zu schützen, und überwachten den makroskopischen Wundverschluss. im Laufe der Zeit. Bei Cacnb3-Gen-mangelhaftenMäusen war der Wundverschluss deutlich schneller. Da die Ergebnisse der in vivo und der In-vitro-Assays gut korrelieren, kann der In-vitro-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nützlich sein, bevor die In-vitro-Treffer des in vivo Wundheilungsmodells validiert werden. Was wir hier für Wildtyp-und Cav-3-defizienten Mäusen oder Zellen gezeigt haben, könnte auch für andere Moleküle als Cav3 gelten.
Introduction
Die Wundheilung der Haut beginnt unmittelbar nach der Hautverletzung, um die Integrität der Haut wiederherzustellen und den Organismus vor Infektionen zu schützen. Der Wundheilungsprozess durchläuft vier überlappende Phasen; Gerinnung, Entzündung, neue Gewebebildung und Gewebeumbau1. Die Zellmigration ist in diesen Phasen von entscheidender Bedeutung. Entzündliche Zellen, Immunzellen, Keratinozyten, Endothelzellen und Fibroblasten werden zu verschiedenen Zeitpunkten aktiviert und dringen in den Wundbereichein 2. Methoden zur Untersuchung der Wundheilung in vitro und in vivo sind von großem Interesse, nicht nur um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, sondern auch um neue Medikamente zu testen und neue Strategien zu entwickeln, die darauf abzielen, die Wundheilung der Haut zu verbessern und zu beschleunigen.
Zum Überwachen und Analysieren der Zellmigration kann der Scratch-Migrationstest verwendet werden. Es wird oft als in vitro Wundheilung assay bezeichnet. Diese Methode erfordert eine Zellenkultureinrichtung3. Es ist ein einfaches Verfahren, es gibt keine Notwendigkeit für High-End-Ausrüstung und der Assay kann in den meisten zellbiologischen Laboratorien durchgeführt werden. Bei diesem Test entsteht ein zellfreier Bereich durch die mechanische Störung einer Konfluentzellmonoschicht, vorzugsweise epitheliale oder endotheliale Zellen oder Fibroblasten. Zellen am Rand des Kratzers werden migriert, um die erstellte Lücke wieder aufzufüllen. Die Quantifizierung des abnehmenden zellfreien Bereichs im Zeitverlauf ähnelt der Migrationsrate und gibt die Zeit an, die die Zellen benötigen, um die Lücke zu schließen. Zu diesem Zweck können die Forscher entweder akut isolierte Zellen von WT-Mäusen oder Mäusen ohne ein Gen von Interesse4oder verewigte Zellen aus zuverlässigen Zellrepositorien verwenden. Der Kratztest ermöglicht die Untersuchung des Einflusses pharmakologisch aktiver Verbindungen oder der Wirkung transfizierter cDNAs oder siRNAs auf die Zellmigration.
In vivo ist die Wundheilung ein komplexer physiologischer Prozess, der verschiedene Zelltypen wie Keratinozyten, Entzündungszellen, Fibroblasten, Immunzellen und Endothelzellen erfordert, um die körperliche Unversehrtheit der Haut so schnell wie möglich wiederherzustellen1 . Verschiedene Methoden zur Erforschung der In-vivo-Wundheilung wurden in denletzten5,6,7,8entwickelt und angewendet. Die in diesem Artikel beschriebene dorsale Hautfaltenkammer wurde zuvor für Die Wundheilungstests9verwendet. Es wird als modifiziertes dorsales Hautfaltenkammerpräparat für Mäuse verwendet. Das modifizierte Skinfold-Kammermodell hat mehrere Vorteile. 1) Es minimiert die Hautkontraktion, was die Beobachtung des Wundheilungsprozesses verhindert und die Wundreparatur bei Mäusen beeinflussen kann. 2) Diese Kammer nutzt die Abdeckung der Wunde mit einem Glasdeckel, Verringerung von Gewebeinfektionen und Austrocknung, die den Heilungsprozess verzögern könnte. 3) Blutfluss und Vaskularisation können direkt überwacht werden. 4) Es ermöglicht die repetitive topische Anwendung von pharmakologisch aktiven Verbindungen und Reagenzien, um die Wunde zu behandeln und die Heilung zu beschleunigen9,10.
Wir identifizierten die Untereinheit 3 von hochspannungsgeschlossenen Kalziumkanälen (Cav3) als potenzielles Zielmolekül, um die Wundheilung der Haut mit zwei unabhängigen Protokollen zu beeinflussen, d.h. dem In-vitro-Scratch-Migration-Assay und dem in vivo dorsalen Hautfaltenkammermodell. Für den In-vitro-Test verwendeten wir primäre Fibroblasten, diese Zellen exprimieren zwar das Cacnb3-Gen, das für das Cav3-Protein kodiert, aber es fehlt an Depolarisations-induzierten Ca2+-Zufluss- oder spannungsabhängigen Ca2+-Strömen. Wir beschrieben eine neuartige Funktion von Cav3 in diesen Fibroblasten: Cav3 bindet an den Inositol 1,4,5-Trisphosphat-Rezeptor (IP3R) und schränkt die Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum ein. Die Deletion des Cacnb3-Gens bei Mäusen führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit des IP3R für IP3, einer verbesserten Zellmigration und einer erhöhten Hautwundreparatur4.
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Protocol
Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Ethik-Regeln und den Tierschutzausschüssen des Saarlandes und der Universität des Saarlandes genehmigt und durchgeführt.
1 Primäre Zellkultur und siRNA-Transfektion
HINWEIS: Bei der beschriebenen Methode werden primäre Fibroblasten verwendet. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung und Der Umgestaltung des Gewebes11. In diesem Experiment wurde das Cacnb3-Gen, das die Untereinheit Cav3 aus hochspannungsgebundenen Kalziumkanälen12 kodiert, down-reguliert, wodurch seine Rolle bei der Zellmigration in vitro und der Hautwundreparatur in vivo4gezeigt wurde.
- Vorbereitung von siRNA: Vor der Rekonstituierung der siRNAs zentrieren Sie die Rohre kurz, um sicherzustellen, dass sich der Inhalt am Boden befindet. Rekonstituieren Sie die siRNAs in einem 100-L-RNase-freien Puffer (100 mM Kaliumacetat, 30 mM HEPES, pH 7,5), der vom Hersteller in einer Konzentration von 20 m bereitgestellt wird. Dies ist eine Aktienlösung von siRNAs.
- Aliquot diese Lagerlösung bei 10 l pro Tube (20 M Konzentration) und lagern Sie bei -20 °C bis zur Verwendung.
- Markieren Sie mit einem ultrafeinen permanenten Marker eine 6-Well-Platte mit einer horizontalen Linie an der Unterseite jedes Brunnens, um immer den gleichen Kratzbereich von Interesse identifizieren zu können und seinem Verschluss zu folgen.
HINWEIS: 6-Well-Kulturplatten wurden in diesem Test verwendet, weil sie groß genug sind, um genügend Platz und Flexibilität zu bieten, um einen konsistenten, reproduzierbaren und vertikalen Kratzer mit einer 200-L-Pipettenspitze über die Zellmonoschicht aufzutragen. Wenn eine begrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung steht, wäre eine Alternative und wahrscheinlich der kosteneffiziente Weg, 12- oder 24-Well-Kulturplatten zu verwenden. - Plattenprimär-Fibroblasten, isoliert von den Wildtyp- und 3-defizienten Mäusen4, in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen/Well in Gegenwart von 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FCS).
HINWEIS: 5 x 105 Zellen pro Brunnen wurden für 6-Well-Kulturplatte und für primäre Maus-Fibroblasten etabliert. Tests können erforderlich sein, wenn 12- oder 24-Well-Zellkulturplatten oder andere Zelltypen verwendet werden, die unterschiedlich groß sein können. Zellen sollten in einer sterilen Umgebung wie biologischen Sicherheitsschränken der Klasse II behandelt werden. - Beschriften Sie die 6-Well-Platte mit dem Zelltyp, dem Genotyp und dem Datum.
- Bewegen Sie die 6-Well-Platte in den Zellkultur-Inkubator und halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h.
- Am nächsten Tag die Platte aus dem Brutkasten nehmen, das Zellkulturmedium aus dem Brunnen saugen, entsorgen und durch 2,25 ml frisches Kulturmedium ersetzen, indem man es vorsichtig an die Wand des Brunnens anfügt.
- Um Fibroblasten mit siRNAs zu transfekieren, verwenden Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz, wie vom Hersteller empfohlen.
- Etikettieren Sie für jede Transfektion zwei Mikrozentrifugenrohre. Fügen Sie im ersten das Transfektionsreagenz hinzu und verdünnen Sie es mit einem reduzierten Serummedium von 150 l. In der zweiten Röhre 1,5 l siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 oder scrambled siRNA als Negativkontrolle) hinzufügen und mit 150 l reduziertem Serummedium verdünnen.
- Die verdünnte siRNA in die Röhre geben, die ein verdünntes Transfektionsreagenz enthält, und Wirbel für 2 s. Inkubieren Sie das Gemisch 5 min bei 21 °C.
- Beschriften mit Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 oder Rührbrunnen. Fügen Sie den Zellen 250 l des siRNA-transfection Reagenzgemisches tropfenweise hinzu.
- Legen Sie die 6-Well-Kulturplatte wieder in den Inkubator und halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h.
- Um die Effizienz des Cacnb3-Gen-Silencings zu überprüfen, sammeln Sie transfizierte Zellen und führen Sie eine Immunoblot-Analyse durch, wie zuvorbeschrieben 4.
2. In-vitro-Wundheilungstest (Scratch-Migration-Assay)
- Nehmen Sie die Zellkulturplatte aus dem Inkubator und untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit dem 10-fachen Objektiv. Beginnen Sie mit dem Scratch-Assay nur, wenn sie 100% Konfluenz erreicht haben.
HINWEIS: Für die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ist 100% Konfluenz ein obligatorischer Faktor für den Start des Scratch-Migration-Assays. Daher ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Zellen in die Kulturbrunnen zu saaten, jeden Brunnen auf Diekonfluenz zu untersuchen und den Kratzer gleichzeitig anzuwenden (Tag 0 Konfluency). Das längere Warten, nachdem die Zellen 100% Konfluenz erreicht haben, kann unterschiedliche Reaktionen hervorrufen. - Sobald die Zelle 100% Konfluenz erreicht hat, saugen Sie das Kulturmedium aus dem Brunnen und entsorgen Sie es.
- Verwenden Sie eine Pipettenspitze (200 l), um manuell einen Kratzer vertikal zur horizontalen Linie zu erstellen, die am unteren Rand des Brunnens markiert ist, über die konfluente Zellmonolayer in der Mitte des Brunnens.
- Spülen Sie jeweils gut zweimal mit 2 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4), um die freigesetzten Faktoren aus beschädigten Zellen, losen Zellen und Schmutz aus dem zerkratzten Bereich zu entfernen. Fügen Sie 2 ml PBS vorsichtig gegen die Wand des Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass zellengut von der Zellkultur gelöst werden.
- Fügen Sie 2 ml Zellkulturmedium, das entweder 10% Serum oder 1% Serum enthält, sorgfältig zu jedem Brunnen hinzu.
HINWEIS: Es wird empfohlen, den Kratztest unter 10% Serum und unter 1% Serum durchzuführen, um zu bestätigen, dass der beobachtete Effekt nur durch die Zellproliferation und -migration oder nur durch Zellmigration verursacht wird. - Bewegen Sie die Platte auf die Mikroskopstufe und erfassen Sie helle Feldbilder des zellfreien Bereichs (zwei Bereiche pro Brunnen) unmittelbar nach dem Kratzen (t=0h) bei einer 10-fachen Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop. Um immer den gleichen Bereich des Kratzers abzubilden, verwenden Sie die horizontale Linie, die in Schritt (1.3) vorbereitet wurde, und nehmen Sie ein Bild über dieser Linie und ein Bild unterhalb dieser Linie. Speichern Sie Bilder als TIFF oder JPEG.
- Da das Mikroskopstadium den Zellwachstumszustand nicht aufrechterhält, bewegen Sie die Platte zurück in den Zellkultur-Inkubator und halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2.
- Nach 6, 10 und 30 h die Platte wieder auf die Mikroskopstufe bewegen und Bilder auf die gleiche Weise aufnehmen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
HINWEIS: Diese Zeitpunkte wurden für das beschriebene Verfahren und für primäre Fibroblasten festgelegt. Während des ersten Pilotversuchs wurden weitere Zeitpunkte getestet, um zu sehen, wie schnell Fibroblasten die Lücke wieder bevölkern. Obwohl 0, 6, 10 und 30 h vernünftige Startzeitpunkte sind, sollten die Prüfer die geeigneten Zeitpunkte für jede Anwendung und für jeden Zelltyp optimieren und festlegen. Die genauere Alternative, falls verfügbar, wäre die Zeitraffermikroskopie. - Mit ImageJ13, quantifizieren Sie den anfänglichen zellfreien Bereich (100%) und die verbleibende Fläche nach 6, 10 und 30 h (Abbildung 1). Der Prozentsatz der Scratch-Fläche, die durch migrierende Zellen neu aufgefüllt wird, wird dann relativ zum ursprünglichen Scratch-Bereich berechnet.
3. Analyse der Kratzfläche
- Öffnen Sie ImageJ Software13.
- Laden Sie das erste Bild als JPEG hoch (z. B. 24-Bit-RGB-Bilder 1360x1024), indem Sie das Bild in die ImageJ-Menüleiste ablegen.
- Wählen Sie die Schaltfläche Freihandauswahl und markieren Sie den zellfreien Bereich
- Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Measureaus. Es wird ein Fenster mit den Ergebnissen angezeigt, das den Flächenwert enthält.
- Übertragen Sie diesen Wert in eine Analysetabelle.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.5 für jedes Bild vom Zeitpunkt 0 h und starten Sie dann erneut für die nächsten Zeitpunkte 6, 10 und 30 h.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der Scratch-Fläche, die durch Migrieren von Zellen nach 6, 10 und 30 h für jeden Scratch neu aufgefüllt wird, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
a = zellfreier Bereich des anfänglichen Kratzers, b = zellfreier Bereich nach 6 h - Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) für den Prozentsatz der Scratch-Fläche, der durch migrierende Zellen nach 6 h neu aufgefüllt wird. Zeigen Sie Daten als Spaltenbalkendiagramm oder Streudiagramm an.
4. In vivo HautWundheilungstest
HINWEIS: Für diese Studie werden C57BL/6 Wildmännchen (8-12 Wochen alt mit 22-26 g Körpergewicht) und Cav-3-mäuse als Kontrollmittel verwendet.
- Einen Tag vor Beginn des Experiments, Autoklaven alle chirurgischen Instrumente, Schrauben, Muttern und Titanrahmen für die Hautfaltkammervorbereitung verwendet werden.
HINWEIS: Der Titanrahmen besteht aus zwei symmetrischen komplementären Hälften und verfügt über ein kreisförmiges Beobachtungsfenster, in dem die Wunde aufgetragen und anschließend mikroskopisch dargestellt wird (siehe Abbildung 2a). - Anästhetisieren Sie eine Wild-Typ- oder 3-mangelhafte Maus (22-26 g Körpergewicht) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 0,1 ml Saline/10 g Körpergewicht, das eine Mischung aus Ketamin (75 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (25 mg/kg Körpergewicht) enthält. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf eine Zehenklemme.
HINWEIS: Diese Injektion gibt etwa 30 min chirurgische Anästhesie und die Tiefe der Anästhesie muss durch den chirurgischen Eingriff durch die Überprüfung der Reflexe der Maus kontrolliert werden. - Um Trockenheit oder Schädigung der Augen zu vermeiden, tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf und wiederholen Sie die Anwendung bei Bedarf.
- Vorsichtig rasieren Sie die Maus dorsum, mit einem elektrischen Rasierer gefolgt von der Anwendung einer Enthaarungscreme auf den rasierten Bereich, um alle verbleibenden Haare zu entfernen. Achten Sie darauf, die Maushaut nicht zu verletzen. Lassen Sie die Enthaarungscreme für ca. 10 min vollständig alle Haare zu entfernen.
- Bereiten Sie die Titankammer vor, indem Sie einen Teil des symmetrischen Titankammerrahmens nehmen und die Verbindungsschrauben mit Muttern auf einer Seite befestigen. Diese Nüsse dienen als Abstandsgeber, um 400-500 m zwischen den beiden symmetrischen Teilen der Kammer zu halten, um eine Kompression der Blutgefäße in der Haut zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Creme von der Rückseite der Maus und reinigen Sie den haarfreien Bereich mit warmem (35-37 °C) Leitungswasser.
- Stellen Sie sicher, dass der Ort, an dem eine Operation durchgeführt werden kann, sauber, warm (37 °C) und befeuchtet ist.
- Desinfizieren Sie den haarfreien Bereich der Maus mit dem Hautdesinfektionsmittel. Nehmen Sie eine Falte der hinteren Haut der Maus vor einer Lichtquelle und positionieren Sie die mittlere Linie der Doppelschicht der Haut, wo die Titankammer implantiert wird. Danach fixieren Sie die Hautfalte mit einer Polypropylen-Nähte kranially und kauarisch und straffen Sie die andere Seite der Naht auf einem Metallgestell, um die Maus gefaltete Haut zu heben. Stellen Sie die Höhe des Racks ein, damit die Maus bequem sitzen kann.
- Implantieren Sie die Titankammer in die Falte der hinteren Haut der Maus, um die gefaltete dorsale Hautschicht zwischen den beiden symmetrischen Hälften des Titanrahmens einzusperren. Befestigen Sie die erste Hälfte des Titanrahmens durch Polypropylen-Nähte an ihrer oberen Kante an der Rückseite der dorsalen Hautfalte.
HINWEIS: Auf dem Titanrahmen befinden sich 8 Löcher an der oberen Kante (Abbildung 2a) und die gefaltete Haut sollte gut durch Polypropylen-Nähte auf jedem der acht Löcher fixiert werden. - Bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen, überprüfen Sie die Reflexe der Maus, um sicherzustellen, dass die Tiefe der Anästhesie erhalten bleibt.
- An der Basis der Hautfalte, passieren Sie die beiden Verbindungsschrauben, an der ersten Hälfte der Titankammer befestigt, um die Hautfalte von hinten nach vorne zu durchdringen. Machen Sie kleine Schnitte auf der Haut (mit feiner Schere), um das reibungslose Eindringen der Verbindungsschrauben zu erleichtern.
- Lösen Sie die Maus vom Rack und legen Sie sie seitlich an. Legen Sie die zweite komplementäre Hälfte der Titankammer auf die 3 Verbindungsschrauben (siehe Abbildung 2a) und setzen Sie leichten Druck mit den Fingern, um diese Schrauben durch die zweite Hälfte des Titanrahmens zu passieren. Fixieren Sie dann beide symmetrischen Teile mit Edelstahlmuttern.
- Achten Sie bei diesem Schritt sorgfältig auf die Dichtheit der Schrauben, da sie sich lösen könnte, wenn sie zu locker ist. Im Gegensatz dazu, wenn es zu eng ist, wird es die Hautfalte drücken, den Blutfluss reduzieren und kann zu Gewebebeeinträchtigung und Nekrose führen.
HINWEIS: In Schritt 4.5 hergestellte Muttern dienen als Abstandser, um einen Abstand von 400-500 m zwischen den beiden symmetrischen Hälften der Titankammer zu halten. Die Muttern sollten so lange angezogen werden, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist. - Schneiden Sie den restlichen Teil der Schrauben mit einer Zange.
HINWEIS: Bei diesem Schritt ist es notwendig, Laborschutzbrillen für den Augenschutz zu verwenden, falls die Schraube falsch abkommt. - Markieren Sie den Wundbereich durch einen standardisierten Biopsie-Punch (2 mm Durchmesser) in der Mitte der Haut innerhalb des Beobachtungsfensters (siehe Abbildung 2a) der Hautfaltkammer, um reproduzierbare Wundgrößen zu gewährleisten.
- Durch die Verwendung von feinen Zangen und Scheren, erstellen Sie eine kreisförmige Wunde innerhalb des markierten Bereichs, indem Sie die gesamte Haut mit Epidermis und Dermis entfernen. Die letzte Wundfläche wird etwa 3,5-4,5 mm2betragen, siehe Abbildung 2b. Reinigen Sie die Wunde mit 0,5 ml steriler Saline (0,9 % NaCl, 37 °C).
- Bedecken Sie die Wunde mit einem Glasdeckel und fixieren Sie diesen Glasdeckel mit einem Schnappring mit der Schnappringzange auf der Titankammer.
- Unmittelbar nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs stellen Sie die Maus auf die Bildstufe eines Stereomikroskops, das mit einer Kamera ausgestattet ist, und nehmen Sie Bilder (Tag 0) unter Beleuchtung auf. Verwenden Sie die 40X Vergrößerung und speichern Sie die Bilder für zukünftige Off-Line-Analysen.
HINWEIS: Der Prüfer sollte die Bilder unmittelbar nach der Aufnahme untersuchen, um sicherzustellen, dass die Qualität für zukünftige Online-Analysen ausreicht. Die Herstellung der Hautfaltkammer und die Leistung der Hautwunde dauert etwa 30 Minuten. - Halten Sie die Maus an einem warmen Ort während der Erholung von der Anästhesie für mindestens 2 h. Danach bringen Sie Mäuse in einzelnen Käfigen zurück in die Tieranlage (12 h Hell-/Dunkelzyklus) und stellen Sie sicher, dass Mäuse Zugang zu Nahrung und Wasser haben.
- Drei Tage nach der Wundung legen Sie die Maus in einen Maus-Restrainer und fixieren Sie den Restrainer auf der Bildstufe.
- Platzieren Sie die Bühne unter einem Stereomikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. Nehmen Sie Bilder unter Beleuchtung mit 40-facher Vergrößerung auf, zeichnen Sie alle Bilder auf und speichern Sie sie für zukünftige Off-Line-Analysen
- Wiederholen Sie die Schritte 4.20 und 4.21 erneut an Tag 6, 10 und Tag 14 nach der Verwundung.
- Verwenden Sie die Wundbilder für die Off-Line-Analyse in ImageJ13. Der Wundbereich an Tag 0 wird als 100 % betrachtet und der Wundverschluss im Laufe der Zeit wird relativ zum ursprünglichen Wundbereich gezeichnet. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2c,ddargestellt.
- Berechnen des Prozentsatzes (%) der Wundfläche zu jedem Zeitpunkt mit der folgenden Gleichung:
x: Zeitpunkt (Tag 0, 3, 10 oder 14), a: Wundbereich am Tag 0, b: Wundbereich zum Zeitpunkt x
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Representative Results
Der Kratzer-Assay wurde an einer Konfluentzellmonoschicht von Wildtyp- und 3-mangelhaften MEFs durchgeführt (Abbildung 1c). Nach dem Ausführen des "Kratzers" mit einer 200-L-Pipettenspitze wandern Zellen beider Genotypen in den Kratzbereich und schließen die Lücke. Die Bilder wurden nach 6, 10 und 30 h aufgenommen (Abbildung 1a). Die Zellmigration wurde als Prozentsatz quantifiziert (%) der Kratzerfläche neu bevölkert durch migrierende Zellen 6 Stunden nach dem Durchführen des Kratzers. Die Migration von Cav-3-mangelhaften MEFs schloss den Kratzbereich deutlich früher als MEFs von Wildtypmäusen (Abbildung 1a,b). Um jegliche Auswirkungen der Zellproliferation auszuschließen, wurde der Kratzmigrationstest in Gegenwart von 10% oder 1% FCS durchgeführt. Bei 10% FCS sind beide Prozesse vorhanden, die Zellproliferation und Migration, während bei 1% die Proliferation von FCS-Zellen minimiert wird. Fibroblasten in 10%(Abbildung 1b, links) oder 1% FCS (Abbildung 1b, rechts) zeigten ein ähnliches Migrationsmuster, das die Möglichkeit eines Zellproliferationsbeitrags zum beobachteten Phänotyp Cav3 ausschloss. Cav-3-mangelhafte MEFs schlossen die Lücke unter beiden Bedingungen deutlich früher als Wildtyp-MEFs. Zur Bestätigung des Cav-3-abhängigen Effekts, der bei fibroblasten Fibroblasten beobachtet wurde, wurden Wild-Typ-Fibroblasten mit siRNA transfiziert, um das Cav-3-Protein zu regulieren (Abbildung 1e). Als Kontrolle für die Down-Regulation wurden Immunoblots durchgeführt, um die Wirksamkeit der siRNA-Behandlung zu bestätigen. Es wurden zwei unabhängige Cacnb3-spezifische siRNAs (siRNA1 und siRNA2) und eine scrambled siRNA (als Steuerung) verwendet. Fibroblasten, die mit den Cacnb3-spezifischensiRNAs behandelt werden, verhalten sich wie 3-defizienten Fibroblasten (Abbildung 1d), d.h. die Migration wird in Abwesenheit von Cav3-Protein erhöht (Abbildung 1e).
In vivo wurde die dorsale Hautfaltkammer implantiert (Abbildung 2a,b) und auf dem rasierten Rücken(Abbildung 2b) der Wildtyp- und Cav-3-Mäuse (8 Tiere pro Genotyp, 8-12 Wochen alt und 22-26 g Gewicht). Die Wunde wurde durchgeführt, indem die gesamte Haut mit Epidermis und Dermis entfernt wurde. Um die Wundheilung der Haut zwischen beiden Genotypen zu vergleichen, wurde der Wundbereich in der Hautfaltkammer direkt nach der Verwundung fotografiert (Tag 0) und dann wurden Bilder 3, 6, 10 und 14 Tage nach der Verwundung aufgenommen (Abbildung 2c). Die Größe der Wunden wurde auf diesen digitalen Bildern gemessen und die Wundfläche an einem bestimmten Tag wurde als Prozentsatz (%) ausgedrückt. des ursprünglichen Wundbereichs (Abbildung 2d). Der Wundverschluss wird bei Mäusen mit einem Mangel an 3 z.B. im Vergleich zu Wildtypkontrollen erhöht. Im Gegensatz zum Wildtyp war die Wunde bei Mäusen mit 3-Prozent-Mäusen bereits nach 10 Tagen fast vollständig geschlossen. Am Tag 14 nach der Verwundung wurden die Wunden in beiden Genotypen vollständig geschlossen (Abbildung 2c,d).
Abbildung 1 : In-vitro-Scratch-Migration Assay. (a) Repräsentative Bilder von Kulturen von Wildtyp (WT, links) und Cav3 KO (3 KO, rechts) primärer Mausembryonaler Fibroblasten (MEFs) sofort, 6, 10 und 30 h nach Durchführung eines Kratzers. Bilder wurden in 8-Bit-Graustufen umgewandelt, und der Kontrast sowie die Helligkeit wurden angepasst, um den zellfreien Bereich maximal zu visualisieren. Die Analyse des zellfreien Bereichs (% der Durch migrationende Zellen neu bevölkerten Scratch-Fläche) wurde auf den ursprünglichen 24-Bit-RGB-Bildern durchgeführt. (b) Balkendiagramme mit Prozentsätzen (%) kratzert es nach 6 Stunden entweder in Gegenwart von hohen (10 %, links) oder niedrigen (1%, rechten) fetalen Rinderserum (FCS) in Wildtyp-Experimenten (schwarz) und Cav3 KO (rot) (c) Immunoblot: Proteinextrakte aus dem Wildtyp-Gehirn (50 g pro Spur) und Fibroblasten (MEFs, 100 g pro Spur) mit einem Cav3-spezifischen Antikörper. Das Protein Nr. 3 (55 kDa) ist im Wildtyp-Gehirn (als Kontrolle verwendet) und fibroblasten vorhanden, fehlt aber in Proteinextrakten von Cav-3-mangelhaften Gehirn- und Fibroblasten, die von Cav-3-mäusen hergestellt werden. (d) Zusammenfassung des Prozentsatzes der Kratzfläche, der durch migrierende Zellen nach 6 Stunden in Wildtypzellen wieder aufgefüllt wird, die entweder mit rühriger siRNA (Kontrolle, schwarz) oder zwei unabhängigen Cacnb3 siRNAs (siRNA1 und siRNA2, rote offene Balken) behandelt werden. (e) Der entsprechende Immunoblot aus dem Experiment in (d). Die Daten werden als Mittelwert angezeigt, p-Werte wurden mit dem t-Test des nicht gepaarten zweitailten Schülers berechnet. Die Panels a und b wurden von [Belkacemi et al., 2018]4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : In vivo Hautwundheilung bei Mäusen. (a) Die Innenseite des Titanrahmens zeigt die eine Hälfte der Titankammer und die Vorderansicht der montierten Titankammer mit zwei symmetrischen Hälften, die mit Schrauben und Muttern befestigt sind. (b) Maus nach der Rasur der dorsalen Haut und Montage der dorsalen Hautfaltkammer bestehend aus zwei symmetrischen Titanrahmen (das Gewicht des Titanrahmens beträgt etwa 2 g) und auftragen eine kreisförmige Wunde (2 mm Durchmesser). (c) Bilder der Wunde direkt nach der Verwundung (Tag 0) und 3, 6, 10 und 14 Tage nach der Verwundung. Der kontinuierliche Prozess des Wundverschlusses mit vollständiger Epithelisierung wird über 14 Tage bei Wild-Typ-Mäusen (WT, oben) und Cav-3 KO (3 KO, unten) gezeigt. (d) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Wundfläche mit einem computergestützten Bildanalyseprogramm bestimmt und als Prozentsatz der Wundfläche unmittelbar nach der Verletzung an Tag 0 (Mittelwert n = 8, 3 KO-Mäuse und die entsprechenden Wildtyp-Mäuse) Kontrollmäuse). Die P-Werte wurden mit dem zweiseitig angelegten ANOVA- und Bonferronis Mehrfachvergleichstest berechnet. Die Panels c und d wurden von [Belkacemi et al., 2018]4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir einen in vitro und in vivo Wundheilungstest und korrelieren die erzielten Ergebnisse. Für den In-vitro-Test verwendeten wir primäre Maus-Fibroblasten4,14,15, die eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Gewebeumgestaltung11spielen. Andere anhängliche Zelltypen, die als Monolayer wachsen (z. B. Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinozyten), können ebenfalls verwendet werden. Die gleiche Anzahl lebensfähiger und gesunder Zellen zu beschichten und den Kratzer bei gleicher Konfluenz anzuwenden, ist von größter Bedeutung, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Es wird dringend empfohlen, biologische und technische Replikationen durchzuführen. Bei der vorliegenden Methode wurden 6-Well-Platten verwendet, aber auch 12- oder 24-Well-Platten können vor allem dann eingesetzt werden, wenn Zellen nur in begrenzter Anzahl erhältlich sind. Im Falle der siRNA-Behandlung ist eine Immunoblot-Analyse nach jedem Versuchssatz obligatorisch, um sicherzustellen, dass das Zielprotein effizient nach unten reguliert wird. Transfektionsreagenz und Zeitfenster sollten für jeden Zelltyp getestet und ausgewählt werden, bevor sie mit dem Migrationstest beginnen. Bei Fibroblasten und dem Cacnb3-Gen dauerte es 3 bis 4 Tage, um das gewünschte Down-Regulations-Niveau zu erreichen. Im Gegensatz dazu benötigt der Kratzmigrationstest kürzere Zeiten (6 h bis 24 h). Um eine hohe Variabilität in der Kratzergröße zu vermeiden, ist es zwingend erforderlich, dass derselbe Prüfer den Kratzer für jeden Versuchssatz anwendet, dass der gleiche Druck von der Pipettenspitze verabreicht wird und die Wunde so weit wie möglich vertikal auf die markierte Linie an der Boden der Platte über die Zellmonoschicht. Die Anwendung eines mechanischen Kratzers über die Zellmonoschicht führt zur Freisetzung verschiedener zellulärer Faktoren (z. B. ATP) aus beschädigten Zellen in den extrazellulären Raum. Diese Faktoren würden parakrine Signalisierung einschließlich Ca2+-Signalisierung in den benachbarten Zellen induzieren, die wiederum zelluläre Reaktionen beeinflussen würde16. Um diese Effekte zu vermeiden, können Kultureinsätze zum Plattieren von Zellen verwendet werden und nach dem Entfernen dieser Inserts wird ein zellfreier Spalt erzeugt, ohne die benachbarten Zellen zu beschädigen17. Für ein Hochdurchsatz-Screening könnten die Prüfer erwägen, auf dem Markt erhältliche Instrumente zu verwenden, um reproduzierbare und konsistente Kratzer in 96-Well-Platten zu erzeugen. Um die Zellmigrationskinetik im Laufe der Zeit kontinuierlich zu verfolgen, können Benutzer auch die Verwendung von kommerziellen High-End-Systemen für die automatische Bildaufnahme in Betracht ziehen. Automatisierte Systeme für Scratch-Anwendungen und Bilderfassung sind jedoch aufgrund hoher Kosten nicht immer verfügbar. Eine leichter zugängliche und kostengünstigere Lösung für die Zeitraffer-Bildgebung wäre beispielsweise die Verwendung des von Hernandez Vera und Kollegen18beschriebenen Systems (ATLIS: ein erschwingliches Zeitraffer-Bildgebungs- und Inkubationssystem).
In Ermangelung von Zellproliferationshemmern ist die Wiederbesiedlung der Lücke im Kratzmigrationstest eine Kombination aus Zellmigration und Zellproliferation. Um nur die Zellmigration zu überwachen, kann die Zellproliferation beispielsweise durch Behandlung mit Actinomycin C19 oder Mitomycin C20unterdrückt werden. Angemessene Konzentrationen dieser Verbindungen müssen sorgfältig bestimmt und getestet werden, um die toxischen Wirkungen dieser Verbindungen zu vermeiden, die die Lebensfähigkeit der Zellen und ihre Migrationsfähigkeit beeinträchtigen könnten. Wie in diesem Artikel beschrieben, ist Serumhunger oder die Verringerung der Serumkonzentration im Kulturmedium eine weitere Möglichkeit, die Auswirkungen der Zellproliferation zu reduzieren. Serumhunger wird in mehreren anderen zellbasierten Assays verwendet. Es kann eine hohe Anzahl von zellulären Reaktionen induzieren, die mit den erhaltenen Ergebnissen und Interpretationen stören könnte21. Der Serumhunger muss sorgfältig angewendet werden, und seine Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit sollte vor Beginn des Experiments bewertet werden. Im vorliegenden Artikel wird die Migration von primären Fibroblasten in Gegenwart von 10 % oder 1 % Serum angezeigt (siehe Abbildung 1b). Die Migrationsrate ist bei niedrigen Serumkonzentrationen erwartungsgemäß langsamer. Allerdings wandern die Fibroblasten bei anderen Bedingungen schneller als Wildtypzellen. niedrige und hohe Serumkonzentration.
Der Hautwundheilungstest mit der dorsalen Hautfaltenkammer ist ein relativ einfaches Verfahren zur Untersuchung des Hautwundverschlusses im Laufe der Zeit in vivo. Die Implantation der titandorsalen Hautfaltkammer wurde erstmals bei Ratten22beschrieben. Sorg et al. verwendeten diese Technik bei sKH1-hr haarlosen Mäusen, um der Wundheilung und der Bildung neuer Blutgefäße zu folgen9. Das in diesem Artikel beschriebene Hautfaltenkammermodell hat viele Vorteile gegenüber den klassischen Wundheilungstests, die auf der rückenden Haut, am Ohr23 oder hintere Gliedmaßen7 von Mäusen durchgeführt werden. Die Abdeckung des Wundbereichs mit einem Glasdeckel verhindert Infektionen und Gewebetraumata und begrenzt die Austrocknung der Wunde. Die mit dem Glasdeckel abgedeckte Beobachtungskammer kann während des Heilungsprozesses jederzeit geöffnet werden, so dass die topische Anwendung verschiedener pharmakologisch aktiver Verbindungen (z.B. siRNA für Cav3 als Lösungen oder Salben) möglich ist und die Kammer wieder geschlossen. Murine HautWunden Heilungsprozess besteht aus Kontraktion und Epithelisierung24. Die Verwendung der dorsalen Hautfaltkammer bei Mäusen minimiert die Hautkontraktion und gibt die Möglichkeit, hauptsächlich den Epithelisierungsprozess zu studieren. Es bietet auch ein klares Fenster, um den Wundverschlussprozess zu beobachten und zu überwachen. Ein Nachteil der Titankammer ist, dass die Maus die Titankammer, die ein Gewicht von etwa 2 g (7,7 % des Gewichts einer 26 g Maus) hat, 14 Tage lang tragen muss. Dies könnte einige Beschwerden für die Maus verursachen, obwohl es scheint, dass Mäuse gut diese Kammer vertragen und sie bequem sind und leicht Nahrung und Wasser erreichen können. Das in diesem Artikel vorgestellte Hautwundheilungsmodell kann nur eine Wunde pro Maus untersuchen. Andere veröffentlichte Methoden25,26 schlagen vor, zwei Wunden pro Maus anzuwenden, was die Anzahl der für eine Studie benötigten Tiere verringern würde. Es ist von großer Bedeutung, eine kreisförmige Wunde von ähnlicher Größe für alle Mäuse zu schaffen, um objektive Informationen sowie zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Um die Wunden im Laufe der Zeit zu fotografieren, wurden Mäuse auf einem Maus-Restrainer fixiert, auf einer Bühne platziert, und die Hautfaltenkammer wird unter einem Stereomikroskop positioniert. Die Verwendung des Restrainers hilft bei der Vermeidung von Anästhesie und der Minimierung von Stress für die Mäuse. Mäuse können geopfert werden und Gewebe aus dem verwundeten Bereich können in verschiedenen Stadien des Heilungsprozesses (entweder nach vollständiger Heilung oder zu früheren Zeitpunkten) für histologische Analysen, RNA-Sammlung oder Proteinbiochemie explantiert und gesammelt werden.
Zusammenfassend haben wir zwei Techniken gezeigt, einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen. In beiden Assays wird die Wundheilung/Lückenverschluss in Abwesenheit der Untereinheit Cav3 aus spannungsgebundenen Kalziumkanälen erhöht. Wie bei Wildtyp- und Cav-3-mäusen oder -Zellen, könnten beide Assays in Abwesenheit oder Anwesenheit anderer spezifischer Moleküle korrelieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Petra Weissgerber und der Transgene Unit der SPF Tieranlage (Projekt P2 des SFB 894) der Medizinischen Fakultät und der Tiereinrichtung am Institut für Klinische und Experimentelle Chirurgie der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes, Homburg. Wir danken Dr. Andreas Beck für die kritische Lektüre des Manuskripts. Gefördert wurde die Studie von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Projekt A3 bis A.B. und V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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