Her præsenterer vi en protokol for en in vitro scratch assay ved hjælp af primære fibroblaster og for en in vivo hud sårheling analyse i mus. Begge assays er enkle metoder til at vurdere in vitro og in vivo sårheling.
Nedsat kutane sårheling er et stort problem for patienter, der lider af diabetes og for ældre mennesker, og det er nødvendigt med en effektiv behandling. Passende in vitro-og in vivo-tilgange er afgørende for identifikationen af nye målmolekyler til behandling af lægemidler for at forbedre hudens sårhelings proces. Vi identificerede β3 under enheden af spændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke sårheling i to uafhængige analyser, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Primære mus embryonale fibroblaster (Mef’er), som er akut isoleret fra mus af vildtype (WT) og CAVβ3-mangelfuld (CAVβ3 ko) eller fibroblaster, som er akut isoleret fra WT-mus, som er behandlet med siRNA, til nedregulering af ekspression af Cacnb3 -genet , kodning CAVβ3, blev anvendt. En ridse blev anvendt på en flydende Cell enkeltlags og hullet lukning blev efterfulgt af at tage mikroskopiske billeder på definerede tidspunkter, indtil fuldstændig genbestand af hullet af de migrerende celler. Disse billeder blev analyseret, og celle migrerings hastigheden blev bestemt for hver betingelse. I en in vivo-analyse implanterede vi et dorsale fold kammer på WT og cavβ3 ko-mus, anvendte et defineret cirkulært sår med en diameter på 2 mm, dækkede såret med en glas dækseddel for at beskytte det mod infektioner og udtørring og overvågede den makroskopiske sårlukning over tid. Sårlukningen var signifikant hurtigere i mus med Cacnb3-gener. Da resultaterne af in vivo-og in vitro-assays korrelerer godt, kan in vitro-analysen være nyttig til screening af høj hastighed, før in vitro-hits valideres af in vivo-sårhelings modellen. Hvad vi har vist her for Wild-type og CAVβ3-mangelfulde mus eller celler kan også være gældende for specifikke molekyler bortset fra Cavβ3.
Hudsårheling starter umiddelbart efter hudskaden for at genoprette hudens integritet og for at beskytte organismen mod infektioner. Sårhelingsprocessen går gennem fire overlappende faser; Koagulering, inflammation, ny vævs dannelse og vævs remodellering1. Celle migration er afgørende i disse faser. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endotelceller, og fibroblaster aktiveres på forskellige tidspunkter og invadere sårområdet2. Metoder til undersøgelse af sårheling in vitro og in vivo er af stor interesse ikke blot for at forstå de underliggende mekanismer, men også for at afprøve nye lægemidler og udvikle nye strategier, der har til formål at forbedre og accelerere sårheling i huden.
Hvis du vil overvåge og analysere celle migrering, kan du anvende analyse af scratch-migrering. Det er ofte omtales som in vitro sårheling assay. Denne metode kræver en cellekultur facilitet3. Det er en simpel procedure, der er ikke behov for high-end udstyr og analysen kan udføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analyse, et celle-frit område er skabt af den mekaniske afbrydelse af en flydende Cell monolayer, fortrinsvis epitelial-eller endotelekallignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten af bunden vil migrere for at genbefolke den oprettede kløft. Kvantificering af det faldende celle frie område over tid minder om overførselshastigheden og angiver den tid, som cellerne har brug for til at lukke hullet. Til dette formål, efterforskere kan bruge enten akut isolerede celler fra WT mus eller mus mangler et gen af interesse4, eller udødeliggjort celler til rådighed fra pålidelige celle depoter. Scratch assay gør det muligt at studere indflydelsen af farmakologisk aktive forbindelser eller effekten af transficeret cdnas eller sirnas på celle migration.
In vivo, sårheling er en kompleks fysiologisk proces, der kræver forskellige celletyper, herunder keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endotelceller for at genoprette hudens fysiske integritet så hurtigt som muligt1 . Forskellige metoder til at studere in vivo sårheling er blevet udviklet og anvendt i de sidste5,6,7,8. Den dorsale fold kammer beskrevet i denne artikel blev tidligere anvendt til sårheling assays9. Det bruges som en modificeret dorsale fold kammer forberedelse til mus. Den modificerede fold kammer model har flere fordele. 1) det minimerer hud sammentrækning, som forhindrer observere sårheling proces og kan påvirke sårreparation i mus. 2) dette kammer gør brug af dækker såret med en glas dækseddel, reducere vævs infektioner og udtørring, som kan forsinke helbredelsesprocessen. 3) blodgennemstrømning og vaskularisering kan overvåges direkte. 4) det giver mulighed for gentagne topikal anvendelse af farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for at behandle såret og fremskynde healing9,10.
Vi identificerede β3 under enheden af højspændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke huden sårheling ved hjælp af to uafhængige protokoller, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Til in vitro-analyse, vi brugte primære fibroblaster, disse celler udtrykker Cacnb3 genet kodning af Cavβ3 protein, men mangler depolarisering-induceret ca2 + tilstrømning eller spændings afhængige ca2 + strømme. Vi beskrev en roman funktion af cavβ3 i disse fibroblaster: cavβ3 binder sig til inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) og begrænsninger calcium frigivelse fra endoplasmatiske reticulum. Sletning af Cacnb3 genet i mus fører til øget følsomhed af IP3R for IP3, forbedret celle migration og øget sårheling reparation4.
I dette manuskript beskriver vi en in vitro og in vivo sårhelings analyse og korrelerer de opnåede resultater. Til in vitro-analysen brugte vi primære mus fibroblaster4,14,15 , som spiller en vigtig rolle i sårheling og vævs remodeling11. Andre vedlige celletyper, der vokser som monolag (f. eks. epiteliale celler, endotelceller, keratinocytter), kan også anvendes. Plating det samme antal levedygtige…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene enhed af SPF Animal facilitet (projekt P2 af SFB 894) af det medicinske fakultet og dyret facilitet på Institut for klinisk og eksperimentel kirurgi på det medicinske fakultet ved Saarland Universitet, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk læsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 til A.B. og V.F.).
0.9 % NaCl | |||
1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
Depilation cream | any depilation cream | ||
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
Hexagon full nut | |||
Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
Micro-forceps | |||
Micro-Scissors | |||
Mouse restrainer | Home-made | ||
Normal scissors | |||
Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
Polypropylene sutures | |||
Screwdriver | |||
Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
Slotted cheese head screw | |||
Snap ring | |||
Snap ring plier | |||
Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
Wire piler |