Summary

Scratch migration assay og dorsale Skinfold kammer for in vitro og in vivo analyse af sårheling

Published: September 26, 2019
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol for en in vitro scratch assay ved hjælp af primære fibroblaster og for en in vivo hud sårheling analyse i mus. Begge assays er enkle metoder til at vurdere in vitro og in vivo sårheling.

Abstract

Nedsat kutane sårheling er et stort problem for patienter, der lider af diabetes og for ældre mennesker, og det er nødvendigt med en effektiv behandling. Passende in vitro-og in vivo-tilgange er afgørende for identifikationen af nye målmolekyler til behandling af lægemidler for at forbedre hudens sårhelings proces. Vi identificerede β3 under enheden af spændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke sårheling i to uafhængige analyser, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Primære mus embryonale fibroblaster (Mef’er), som er akut isoleret fra mus af vildtype (WT) og CAVβ3-mangelfuld (CAVβ3 ko) eller fibroblaster, som er akut isoleret fra WT-mus, som er behandlet med siRNA, til nedregulering af ekspression af Cacnb3 -genet , kodning CAVβ3, blev anvendt. En ridse blev anvendt på en flydende Cell enkeltlags og hullet lukning blev efterfulgt af at tage mikroskopiske billeder på definerede tidspunkter, indtil fuldstændig genbestand af hullet af de migrerende celler. Disse billeder blev analyseret, og celle migrerings hastigheden blev bestemt for hver betingelse. I en in vivo-analyse implanterede vi et dorsale fold kammer på WT og cavβ3 ko-mus, anvendte et defineret cirkulært sår med en diameter på 2 mm, dækkede såret med en glas dækseddel for at beskytte det mod infektioner og udtørring og overvågede den makroskopiske sårlukning over tid. Sårlukningen var signifikant hurtigere i mus med Cacnb3-gener. Da resultaterne af in vivo-og in vitro-assays korrelerer godt, kan in vitro-analysen være nyttig til screening af høj hastighed, før in vitro-hits valideres af in vivo-sårhelings modellen. Hvad vi har vist her for Wild-type og CAVβ3-mangelfulde mus eller celler kan også være gældende for specifikke molekyler bortset fra Cavβ3.

Introduction

Hudsårheling starter umiddelbart efter hudskaden for at genoprette hudens integritet og for at beskytte organismen mod infektioner. Sårhelingsprocessen går gennem fire overlappende faser; Koagulering, inflammation, ny vævs dannelse og vævs remodellering1. Celle migration er afgørende i disse faser. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endotelceller, og fibroblaster aktiveres på forskellige tidspunkter og invadere sårområdet2. Metoder til undersøgelse af sårheling in vitro og in vivo er af stor interesse ikke blot for at forstå de underliggende mekanismer, men også for at afprøve nye lægemidler og udvikle nye strategier, der har til formål at forbedre og accelerere sårheling i huden.

Hvis du vil overvåge og analysere celle migrering, kan du anvende analyse af scratch-migrering. Det er ofte omtales som in vitro sårheling assay. Denne metode kræver en cellekultur facilitet3. Det er en simpel procedure, der er ikke behov for high-end udstyr og analysen kan udføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analyse, et celle-frit område er skabt af den mekaniske afbrydelse af en flydende Cell monolayer, fortrinsvis epitelial-eller endotelekallignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten af bunden vil migrere for at genbefolke den oprettede kløft. Kvantificering af det faldende celle frie område over tid minder om overførselshastigheden og angiver den tid, som cellerne har brug for til at lukke hullet. Til dette formål, efterforskere kan bruge enten akut isolerede celler fra WT mus eller mus mangler et gen af interesse4, eller udødeliggjort celler til rådighed fra pålidelige celle depoter. Scratch assay gør det muligt at studere indflydelsen af farmakologisk aktive forbindelser eller effekten af transficeret cdnas eller sirnas på celle migration.

In vivo, sårheling er en kompleks fysiologisk proces, der kræver forskellige celletyper, herunder keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endotelceller for at genoprette hudens fysiske integritet så hurtigt som muligt1 . Forskellige metoder til at studere in vivo sårheling er blevet udviklet og anvendt i de sidste5,6,7,8. Den dorsale fold kammer beskrevet i denne artikel blev tidligere anvendt til sårheling assays9. Det bruges som en modificeret dorsale fold kammer forberedelse til mus. Den modificerede fold kammer model har flere fordele. 1) det minimerer hud sammentrækning, som forhindrer observere sårheling proces og kan påvirke sårreparation i mus. 2) dette kammer gør brug af dækker såret med en glas dækseddel, reducere vævs infektioner og udtørring, som kan forsinke helbredelsesprocessen. 3) blodgennemstrømning og vaskularisering kan overvåges direkte. 4) det giver mulighed for gentagne topikal anvendelse af farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for at behandle såret og fremskynde healing9,10.

Vi identificerede β3 under enheden af højspændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke huden sårheling ved hjælp af to uafhængige protokoller, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Til in vitro-analyse, vi brugte primære fibroblaster, disse celler udtrykker Cacnb3 genet kodning af Cavβ3 protein, men mangler depolarisering-induceret ca2 + tilstrømning eller spændings afhængige ca2 + strømme. Vi beskrev en roman funktion af cavβ3 i disse fibroblaster: cavβ3 binder sig til inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) og begrænsninger calcium frigivelse fra endoplasmatiske reticulum. Sletning af Cacnb3 genet i mus fører til øget følsomhed af IP3R for IP3, forbedret celle migration og øget sårheling reparation4.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med de etiske regler og dyrevelfærds udvalgene i Saarland og Saarland Universitet. 1 primær cellekultur og siRNA transfektering Bemærk: i den beskrevne metode anvendes primære fibroblaster. Disse celler spiller en afgørende rolle i sårheling og vævs remodeling11. I dette eksperiment, den Cacnb3 genet, kodning af Cavβ3 underenhed af højspændings-gated calcium …

Representative Results

Ridse analysen blev udført på et konflydende celle-enkeltlags af vildt-type-og β3-mangelfulde mef’er (figur 1c). Efter at have udført “bunden” ved hjælp af en 200 μL pipettespids, migrerer cellerne fra begge genotyper ind i arbejdsområdet og lukker hullet. Billeder blev taget efter 6, 10 og 30 h (figur 1a). Celle migration blev kvantificeret som procentdelen (%) af arbejdsområde genbefolket ved at migrere celler 6 timer …

Discussion

I dette manuskript beskriver vi en in vitro og in vivo sårhelings analyse og korrelerer de opnåede resultater. Til in vitro-analysen brugte vi primære mus fibroblaster4,14,15 , som spiller en vigtig rolle i sårheling og vævs remodeling11. Andre vedlige celletyper, der vokser som monolag (f. eks. epiteliale celler, endotelceller, keratinocytter), kan også anvendes. Plating det samme antal levedygtige…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene enhed af SPF Animal facilitet (projekt P2 af SFB 894) af det medicinske fakultet og dyret facilitet på Institut for klinisk og eksperimentel kirurgi på det medicinske fakultet ved Saarland Universitet, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk læsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 til A.B. og V.F.).

Materials

0.9 % NaCl
1 ml syringes BD Plastipak 303172
6 well plate Corning 3516
Biopsy punch Kai Industries 48201 2 mm
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) Origene SR415626
Depilation cream any depilation cream
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) Bayer 3400935940179.00 (BEPANTHEN)
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) Bayer Health Care Rompun 2%
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by life technologies 41966-029
Fetal bovine serum Gibco by life technologies 10270-106
Hexagon full nut
Ketamine hydrochloride Zoetis KETASET
Light microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-8000 Similar microscopes might be used
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778075
Micro-forceps
Micro-Scissors
Mouse restrainer Home-made
Normal scissors
Objective Nikon plan apo 10x/0.45
Opti-MEM Gibco by life technologies 51985-026
Polypropylene sutures
Screwdriver
Skin disinfectant (octeniderm) Schülke & Mayr GmbH 118212
Slotted cheese head screw
Snap ring
Snap ring plier
Surgical microscope with camera Leica Leica M651
Titanium frames for the skinfold chamber IROLA 160001 Halteblech M
Wire piler

References

  1. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  2. Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
  3. Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
  4. Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
  5. Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
  6. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
  7. Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
  8. Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
  9. Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
  10. Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
  11. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
  12. Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  14. Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
  15. Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
  16. Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
  17. Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
  18. Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
  19. Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
  20. Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
  21. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
  22. Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
  23. Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
  24. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
  25. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
  26. Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).

Play Video

Cite This Article
Belkacemi, A., Laschke, M. W., Menger, M. D., Flockerzi, V. Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing. J. Vis. Exp. (151), e59608, doi:10.3791/59608 (2019).

View Video