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खरोंच प्रवास परख और डोर्सल स्किनफ़ोल्ड चैंबर इन विट्रो के लिए और घाव हीलिंग के Vivo विश्लेषण में

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59608
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Institute of Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Center for Molecular Signaling (PZMS), Saarland University, 2Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University

Summary

यहाँ, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग कर एक इन विट्रो खरोंच परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं और चूहों में एक विवो त्वचा घाव भरने परख के लिए। दोनों परख इन विट्रो में और विवो घाव भरने में आकलन करने के लिए सरल तरीके हैं।

Abstract

बिगड़ा cutaneous घाव भरने मधुमेह से पीड़ित रोगियों के लिए और बुजुर्ग लोगों के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है, और वहाँ एक प्रभावी उपचार के लिए एक की जरूरत है. त्वचा घाव भरने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए दवा उपचार के लिए नए लक्ष्य अणुओं की पहचान के लिए इन विट्रो और विवो दृष्टिकोणों में उपयुक्त आवश्यक हैं। हमने दो स्वतंत्र परखों में घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। प्राथमिक माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) तीव्रता से जंगली प्रकार से अलग (WT) और Cav-3 कमी चूहों (Cav]3 KO) या फाइब्रोब्लास्ट्स तीव्रता से WT चूहों से अलग siRNA के साथ इलाज के लिए नीचे Cacnb3 जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित , एन्कोडिंग Cav]3, का उपयोग किया गया. एक खरोंच एक confluent सेल monolayer पर लागू किया गया था और अंतर बंद करने के लिए निर्धारित समय अंक पर सूक्ष्म छवियों लेने के द्वारा पीछा किया गया था जब तक पलायन कोशिकाओं द्वारा अंतर की पूरी repopulation. इन छवियों का विश्लेषण किया गया, और सेल माइग्रेशन दर प्रत्येक शर्त के लिए निर्धारित किया गया था। एक में विवो परख में, हम WT और Cav$3 KO चूहों पर एक पृष्ठीय skinfold कक्ष प्रत्यारोपित, 2 मिमी व्यास की एक परिभाषित परिपत्र घाव लागू, एक गिलास coverslip के साथ घाव को कवर करने के लिए यह संक्रमण और desiccation से बचाने के लिए, और स्थूल घाव बंद नजर रखी समय के साथ. घाव बंद Cacnb3-जीन कमी चूहों में काफी तेजी से था. क्योंकि में विवो के परिणाम और इन विट्रो परख अच्छी तरह से सहसंबंधित, इन विट्रो परख में विवो घाव भरने मॉडल द्वारा इन विट्रो हिट मान्य करने से पहले उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. क्या हम यहाँ जंगली प्रकार के लिए दिखाया गया है और Cav-3 कमी चूहों या कोशिकाओं को भी विशिष्ट अणुओं के लिए लागू हो सकता है केव के अलावा अन्य Cav $3.

Introduction

त्वचा की अखंडता को बहाल करने और संक्रमण से जीव की रक्षा करने के लिए त्वचा की चोट के तुरंत बाद त्वचा घाव भरने शुरू होता है। घाव भरने की प्रक्रिया चार ओवरलैपिंग चरणों के माध्यम से चला जाता है; स्कंदन, सूजन, नए ऊतक गठन, और ऊतक remodeling1. इन चरणों के दौरान सेल प्रवास महत्वपूर्ण है। भड़काऊ कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, keratincytes, endothelial कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लास्ट अलग अलग समय बिंदुओं पर सक्रिय कर रहे हैं और घाव क्षेत्र2पर आक्रमण। इन विट्रो और विवो में घाव भरने की जांच करने के तरीके न केवल अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए बल्कि नई दवाओं का परीक्षण करने और त्वचा घाव भरने में सुधार करने और तेजी लाने के लिए लक्ष्य वाली नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए बहुत रुचि के हैं।

सेल माइग्रेशन की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए, स्क्रैच माइग्रेशन परख का उपयोग किया जा सकता है. यह अक्सर इन विट्रो घाव भरने परख के रूप में जाना जाता है। इस विधि के लिए एक सेल संस्कृति सुविधा 3 की आवश्यकताहै। यह एक सरल प्रक्रिया है, वहाँ उच्च अंत उपकरणों की कोई जरूरत नहीं है और परख सबसे सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है. इस परख में, एक सेल मुक्त क्षेत्र एक confluent सेल मोनोलेयर के यांत्रिक विघटन के द्वारा बनाई गई है, अधिमानतः उपकला- या endothelial की तरह कोशिकाओं या फाइब्रोब्लास्ट्स. खरोंच के किनारे पर कोशिकाओं को बनाया अंतर repopulate करने के लिए माइग्रेट करेंगे. समय के साथ घटते सेल-मुक्त क्षेत्र का परिमाणीकरण प्रवास दर से मिलता-जुलता है और उस समय को इंगित करता है, जिसे कोशिकाओं को अंतराल को बंद करने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, जांचकर्ताओं या तो गंभीर रूप से अलग कोशिकाओं WT चूहों या चूहों ब्याज की एक जीन की कमी से उपयोग कर सकतेहैं 4, या विश्वसनीय सेल खजाने से उपलब्ध अमर कोशिकाओं. खरोंच परख औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों के प्रभाव या सेल प्रवास पर transfected CDNAs या siRNAs के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है.

विवो में, घाव भरने एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है, जिसमें केराटिनोसाइट्स, सूजन कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रकार की आवश्यकता होती है ताकि त्वचा की शारीरिक अखंडता को तेजी से संभव 1 के रूप में बहाल किया जा सके . विवो घाव भरने के विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है और इसका उपयोग पिछले5,6,7,8में किया गया है . इस लेख में वर्णित पृष्ठीय त्वचा का चर्खन पहले घाव भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह चूहों के लिए एक संशोधित पृष्ठीय skinfold कक्ष तैयारी के रूप में प्रयोग किया जाता है. संशोधित skinfold चैम्बर मॉडल कई फायदे हैं. 1) यह त्वचा संकुचन को कम करता है, जो घाव भरने की प्रक्रिया को देख रोकता है और चूहों में घाव की मरम्मत को प्रभावित कर सकता है। 2) यह कक्ष एक गिलास कवरस्लिप के साथ घाव को कवर करने, ऊतक संक्रमण और शुष्कता को कम करने का उपयोग करता है, जो उपचार प्रक्रिया में देरी कर सकता है। 3) रक्त प्रवाह और संवहनी सीधे नजर रखी जा सकती है. 4) यह घाव का इलाज करने और9,10के उपचार में तेजी लाने के लिए औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों और अभिकर्मकों के दोहराव सामयिक आवेदन की अनुमति देता है .

हमने दो स्वतंत्र प्रोटोकॉल का उपयोग करके त्वचा घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में उच्च वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स का इस्तेमाल किया, इन कोशिकाओं Cacnb3 जीन एन्कोडिंग Cav$ 3 प्रोटीन व्यक्त करते हैं, लेकिन depolarization प्रेरित Ca2 + प्रवाह या वोल्टेज पर निर्भर Ca2 + धाराओं की कमी है. हमने इन फाइब्रोब्लास्ट्स में कैव के एक उपन्यास समारोह का वर्णन किया है: कैव$3 इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइसफॉस्फेट रिसेप्टर (IP3R) को बांधता है और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से कैल्शियम की रिहाई पर प्रतिबंध लगा देता है। चूहों में Cacnb3 जीन के विलोपन IP3 के लिए IP3R की संवेदनशीलता में वृद्धि की ओर जाता है, बढ़ाया सेल प्रवास और त्वचा घाव की मरम्मत में वृद्धि4.

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और नैतिकता के नियमों और Saarland और Saarland विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समितियों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

1 प्राथमिक सेल संस्कृति और siRNA transfection

नोट: वर्णित विधि में, प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स का उपयोग किया जाता है। ये कोशिकाएं घाव भरने और ऊतक को फिर से तैयार करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती हैं. इस प्रयोग में, Cacnb3 जीन, उच्च वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियमचैनलों 12 के Cav$3 उपइकाई एन्कोडिंग नीचे विनियमित किया गया था, जिससे विवो4में इन विट्रो और त्वचा घाव की मरम्मत में सेल प्रवास में अपनी भूमिका दिखा .

  1. siRNA की तैयारी: siRNAs पुनर्गठन से पहले, संक्षेप में ट्यूब ों को सुनिश्चित करने के लिए कि सामग्री के तल पर है centrifuge. 100 डिग्री एल आरएनसे-मुक्त बफर (100 एमएम पोटेशियम एसीटेट, 30 एमएम हैपेस, पीएच 7.5) में siRNAs का पुनर्गठन 20 डिग्री एम की एकाग्रता पर निर्माता द्वारा प्रदान की। यह siRNAs के एक शेयर समाधान है.
  2. अलीकोट इस स्टॉक समाधान पर 10 डिग्री एल प्रति ट्यूब (20 डिग्री सेल्सियस एकाग्रता) और उपयोग जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  3. एक ultrafine स्थायी मार्कर का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे एक क्षैतिज रेखा के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट चिह्नित करने के लिए हमेशा ब्याज की एक ही खरोंच क्षेत्र की पहचान करने में सक्षम होने के लिए और इसके बंद का पालन करें.
    नोट: 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें इस परख में इस्तेमाल किया गया क्योंकि वे काफी बड़े हैं, पर्याप्त स्थान और लचीलापन प्रदान करने के लिए एक सुसंगत, reproduible और ऊर्ध्वाधर खरोंच सेल मोनोलेयर भर में एक 200 $L pipette टिप का उपयोग कर लागू करने के लिए. यदि कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में उपलब्ध हैं, एक विकल्प और शायद लागत कुशल तरीका 12 या 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों का उपयोग करने के लिए किया जाएगा.
  4. प्लेट प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट, जंगली प्रकार से अलग और $ 3 कमी चूहों4, 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 6-वेल प्लेट में /
    नोट: 5 x 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के लिए और प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट के लिए स्थापित किया गया है. परीक्षण की जरूरत हो सकती है अगर 12 या 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें या अन्य सेल प्रकार है, जो आकार में अलग हो सकता है का उपयोग कर. कोशिकाओं को एक बाँझ वातावरण में संभाला जाना चाहिए जैसे जैविक सुरक्षा अलमारियाँ वर्ग द्वितीय।
  5. सेल प्रकार, जीनोटाइप, और तारीख के साथ 6-वेल प्लेट लेबल करें।
  6. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 6-वेल प्लेट ले जाएँ और 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
  7. अगले दिन, प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकाल लें, सेल कल्चर मीडियम को अच्छी तरह से बाहर निकाल लें, इसे त्याग दें और इसे अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ सावधानी से जोड़कर 2.25 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम से बदलें।
  8. siRNAs के साथ फाइब्रोब्लास्ट ्स्सट्रकरने के लिए, निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करें।
  9. प्रत्येक transfection के लिए, दो microcentrifuge ट्यूबों लेबल. पहले एक में, ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 9 डिग्री एल जोड़ें और इसे 150 डिग्री सेल्सियस कम सीरम माध्यम के साथ पतला करें। दूसरी नली में 1.5 डिग्री सेल्सियस सिरना(कैकेनब3 सिरना-1, कैकेनब3 सिरना-2 या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तले हुए siRNA) जोड़ें और इसे 150 डिग्री सेल्सियस कम सीरम माध्यम के साथ पतला करें।
  10. पतला siRNA ट्यूब में जोड़ें पतला transfection अभिकर्मक और भंवर के लिए 2 s. 21 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मिश्रण इनक्यूबेट.
  11. लेबल कुओं या तो Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 या तले हुए siRNA के साथ. कोशिकाओं में सिराना-ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक मिश्रण का 250 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  12. 6-वेल कल्चर प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 72 एच के लिए 5% सीओ2 रखें।
  13. Cacnb3 जीन silencing की दक्षता की जांच करने के लिए, transfected कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पहले से वर्णित के रूप में इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण प्रदर्शन4.

2. इन विट्रो घाव भरने परख (स्क्रैच प्रवास परख)

  1. इनक्यूबेटर से सेल कल्चर प्लेट को बाहर निकालिए और 10x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें। खरोंच परख के साथ शुरू ही जब वे 100% संगम तक पहुँच चुके हैं.
    नोट: सटीकता और reproducibility के लिए, 100% संगम खरोंच प्रवास परख शुरू करने के लिए एक अनिवार्य कारक है. इसलिए, यह संस्कृति कुओं में कोशिकाओं की एक ही संख्या बीज के लिए महत्वपूर्ण है, संगम के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जांच करने के लिए और एक ही समय बिंदु (दिन 0 संगम) पर खरोंच लागू करने के लिए. कोशिकाओं तक पहुँचने के बाद लंबे समय के लिए प्रतीक्षा कर रहा है 100% संगम विभिन्न प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकते हैं.
  2. एक बार जब सेल 100% संगम तक पहुँच जाता है, अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम aspirate और इसे त्याग दें.
  3. एक पिपेट टिप (200 जेडएल) का उपयोग करने के लिए मैन्युअल रूप से अच्छी तरह से नीचे चिह्नित क्षैतिज रेखा के लिए एक खरोंच ऊर्ध्वाधर बनाने के लिए, अच्छी तरह से के बीच में confluent सेल monolayer भर में.
  4. 2 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) (137 एमएम नैकल, 2.7 एमएम केसीएल, 1.5 एमएम केएच2पीओ4,8.1 एमएम ना2एचपीओ4,पीएच 7.4) के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला क्षतिग्रस्त कोशिकाओं, ढीली कोशिकाओं, और खरोंच क्षेत्र से मलबे से जारी कारकों को दूर करने के लिए। अच्छी तरह से सेल संस्कृति से कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए अच्छी तरह से की दीवार के खिलाफ ध्यान से पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से 10% सीरम या 1% सीरम युक्त सेल संस्कृति मध्यम के 2 एमएल जोड़ें.
    नोट: यह 10% सीरम के तहत और 1 के तहत खरोंच परख प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है 1% सीरम पुष्टि करने के लिए कि मनाया प्रभाव सेल प्रसार और प्रवास या सेल प्रवास के कारण होता है केवल.
  6. माइक्रोस्कोप चरण के लिए थाली ले जाएँ और सेल मुक्त क्षेत्र के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर कब्जा (अच्छी तरह से प्रति दो क्षेत्रों) तुरंत खरोंच के बाद (t $0h) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 10x आवर्धन पर. छवि हमेशा खरोंच के एक ही क्षेत्र के लिए, क्षैतिज रेखा है, जो कदम (1.3) में तैयार किया गया था का उपयोग करें, और इस लाइन के ऊपर एक छवि और इस पंक्ति के नीचे एक छवि ले. चित्रों को TIFF या JPEG के रूप में सहेजें.
  7. चूँकि सूक्ष्मदर्शी अवस्था कोशिका वृद्धि की स्थिति को बनाए नहीं रखती है, प्लेट को कोशिका संवर्धन इनक्यूबेटर में वापस ले जाती है तथा कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस तथा 5% ब्व्2पर रखदेती है।
  8. 6, 10 और 30 एच के बाद, प्लेट को माइक्रोस्कोप चरण में फिर से ले जाएं और छवियों को उसी तरह कैप्चर करें जैसा कि चरण 2.6 में वर्णित है।
    नोट: इन समय अंक वर्णित प्रक्रिया के लिए और प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए स्थापित किया गया है। पहले पायलट प्रयोग के दौरान, अधिक समय अंक कितनी तेजी से फाइब्रोब्लास्ट अंतर repopulate देखने के लिए परीक्षण किया गया. हालांकि 0, 6, 10 और 30 h उचित शुरू समय अंक हैं, जांचकर्ताओं का अनुकूलन और प्रत्येक आवेदन के लिए और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए उपयुक्त समय अंक स्थापित करना चाहिए. अधिक सटीक विकल्प, यदि उपलब्ध है, समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए किया जाएगा.
  9. ImageJ13का उपयोग करना, प्रारंभिक सेल मुक्त क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करें (100%) और 6, 10 और 30 ज के बाद शेष क्षेत्र (चित्र 1)। स्क्रैच क्षेत्र का प्रतिशत कोशिकाओं को माइग्रेट करके पुनः आबाद किया जाता है, फिर प्रारंभिक स्क्रैच क्षेत्र के सापेक्ष गणना की जाती है.

3. खरोंच क्षेत्र का विश्लेषण

  1. खुला ImageJ सॉफ्टवेयर13|
  2. ImageJ मेनू पट्टी में छवि छोड़ने के द्वारा JPEG (उदा., 24-बिट RGB छवियों 1360x1024) के रूप में पहली छवि अपलोड करें.
  3. फ्रीहैंड चयन बटन का चयन करें और सेल-मुक्त क्षेत्र चिह्नित करें
  4. विश्लेषण पर क्लिक करें और उपायका चयन करें. परिणामों वाली एक विंडो दिखाई देगी जिसमें क्षेत्र मान होगा.
  5. इस मान को विश्लेषण स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें.
  6. समय बिंदु 0 h से प्रत्येक छवि के लिए चरण 3.2-3.5 दोहराएँ और फिर अगली बार अंक 6, 10 और 30 h के लिए फिर से प्रारंभ करें।
  7. निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक स्क्रैच के लिए 6, 10 और 30 h के बाद कक्षों को माइग्रेट करके पुनः आबाद किए गए स्क्रैच क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करें:
    Equation 1
    एक $ प्रारंभिक खरोंच के सेल मुक्त क्षेत्र, ख ] सेल मुक्त क्षेत्र 6 ज के बाद
  8. 6 ज के बाद कक्षों को माइग्रेट करके स्क्रैच क्षेत्र के प्रतिशत के लिए माध्य और मानक त्रुटि (S.E.M.) की गणना करें. डेटा को स्तंभ पट्टी ग्राफ़ या स्कैटर प्लॉट के रूप में दिखाएँ.

4. विवो त्वचा घाव भरने परख में

नोट: C57BL/6 जंगली प्रकार पुरुषों (8-12 22-26 जी शरीर के वजन के साथ पुराने सप्ताह) और एक नियंत्रण के रूप में Cav $3 कमी चूहों इस अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है.

  1. प्रयोग शुरू करने से एक दिन पहले, सभी सर्जिकल उपकरणों, शिकंजा, नट और टाइटेनियम फ्रेम को त्वचा के ऊपरी कक्ष की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: टाइटेनियम फ्रेम दो सममित पूरक हिस्सों से बना है और यह एक परिपत्र अवलोकन खिड़की जहां घाव लागू किया जाएगा और माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया गया है (चित्र 2एकदेखें)।
  2. एक जंगली-प्रकार या $3-कम माउस (22-26 ग्राम शरीर का वजन) द्वारा इंट्रापेरिटोनल (आई.पी.) 0.1 एमएल लवण/10 ग्राम शरीर के वजन का इंजेक्शन, जिसमें केटामाइन (75 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) और xylazine (25 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) का मिश्रण होता है। एक अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें.
    नोट: यह इंजेक्शन लगभग 30 मिनट शल्य संज्ञाहरण देता है और संज्ञाहरण की गहराई को माउस की सजगता की जांच करके शल्य प्रक्रिया के माध्यम से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  3. आंखों के सूखापन या क्षति से बचने के लिए, दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें और यदि आवश्यक हो तो आवेदन को दोहराएं।
  4. ध्यान से माउस dorsum दाढ़ी, एक बिजली शेवर का उपयोग कर किसी भी शेष बालों को दूर करने के लिए मुंडा क्षेत्र के लिए एक depilation क्रीम के आवेदन के बाद. माउस त्वचा को घायल नहीं करने के लिए ध्यान रखना। पूरी तरह से सभी बालों को दूर करने के लिए लगभग 10 मिनट के लिए depilation क्रीम छोड़ दें.
  5. सममित टाइटेनियम चैम्बर फ्रेम का एक हिस्सा लेने के द्वारा टाइटेनियम कक्ष तैयार करें और एक तरफ नट्स के साथ जोड़ने वाले शिकंजा को ठीक करें। ये पागल त्वचा में रक्त वाहिकाओं के संपीड़न से बचने के लिए कक्ष के दो सममित भागों के बीच 400-500 डिग्री मीटर रखने के लिए एक स्पेसर के रूप में काम करेंगे।
  6. माउस के पीछे से क्रीम निकालें और गर्म (35-37 डिग्री सेल्सियस) नल के पानी के साथ बाल मुक्त क्षेत्र को साफ करें।
  7. सुनिश्चित करें कि सर्जरी करने के लिए जगह साफ, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) और humidified है।
  8. त्वचा कीटाणुनाशक के साथ माउस के बाल मुक्त क्षेत्र को संक्रमित करें। एक प्रकाश स्रोत के सामने माउस के पीछे की त्वचा की एक गुना ले लो और त्वचा की डबल परत के बीच लाइन की स्थिति जहां टाइटेनियम कक्ष प्रत्यारोपित किया जाएगा. उसके बाद, एक polypropylene सीवन cranially और caudally के साथ skinfold ठीक है और माउस तह त्वचा लिफ्ट करने के लिए एक धातु रैक पर सीवन के दूसरे पक्ष को कस. माउस को आराम से बैठने की अनुमति देने के लिए रैक की ऊंचाई समायोजित करें।
  9. टाइटेनियम फ्रेम के दो सममित हिस्सों के बीच मुड़ी हुई पृष्ठीय त्वचा परत को सैंडविच करने के लिए एक तरह से माउस की पिछली त्वचा की परत में टाइटेनियम चैम्बर को लगाया। पृष्ठीय त्वचा के पीछे करने के लिए अपने बेहतर किनारे पर polypropylene टांके द्वारा टाइटेनियम फ्रेम की पहली छमाही संलग्न करें।
    नोट: टाइटेनियम फ्रेम पर, बेहतर किनारे पर 8 छेद होते हैं (चित्र 2क) और मुड़ी हुई त्वचा को प्रत्येक आठ छिद्रों पर पॉलीप्रोपाइलीन सीवन द्वारा अच्छी तरह से तय किया जाना चाहिए।
  10. अगले चरण पर जाने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की सजगता की जाँच करें कि संज्ञाहरण की गहराई बनाए रखी है।
  11. skinfold के आधार पर, दो जोड़ने शिकंजा, टाइटेनियम कक्ष की पहली छमाही से जुड़ी पास, वापस से सामने की ओर skinfold घुसना. त्वचा पर छोटे चीरों बनाओ (ठीक कैंची का उपयोग करके) जोड़ने शिकंजा की चिकनी प्रवेश में मदद करने के लिए.
  12. रैक से माउस को अलग करें और इसे एक पार्श्व स्थिति पर रखें। 3 जोड़ने शिकंजा के शीर्ष पर टाइटेनियम कक्ष के दूसरे पूरक आधा रखो (चित्रा 2एकदेखें) और टाइटेनियम फ्रेम की दूसरी छमाही के माध्यम से इन शिकंजा पारित करने के क्रम में उंगलियों के साथ मामूली दबाव लागू होते हैं। फिर, स्टेनलेस स्टील पागल के साथ दोनों सममित भागों को ठीक.
  13. इस कदम पर शिकंजा की जकड़न के लिए सावधान ध्यान देना, क्योंकि यह अलग हो सकता है, अगर यह बहुत ढीला है. इसके विपरीत, अगर यह बहुत तंग है, यह skinfold निचोड़, रक्त के प्रवाह को कम करने और ऊतक हानि और परिगलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    नोट: चरण 4.5 में तैयार किए गए नट टाइटेनियम चैम्बर के दो सममित हिस्सों के बीच 400-500 डिग्री मीटर की दूरी रखने के लिए एक स्पेसर के रूप में सेवा करते हैं। पागल एक मामूली प्रतिरोध महसूस किया जाता है जब तक मजबूत किया जाना चाहिए.
  14. प्लास का उपयोग कर शिकंजा के शेष भाग को काटें।
    नोट: यह इस कदम पर आवश्यक है के मामले में पेंच गलत तरीके से आता है आँख सुरक्षा के लिए प्रयोगशाला सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें.
  15. अवलोकन खिड़की के भीतर त्वचा के केंद्र में एक मानकीकृत बायोप्सी पंच (2 मिमी व्यास में) द्वारा घाव क्षेत्र को चिह्नित करें (चित्र 2एक) त्वचा के फ़ोल्ड चैम्बर के लिए reproduible घाव आकार सुनिश्चित करने के लिए।
  16. ठीक संदंश और कैंची का उपयोग करके, एपिडरिस और डर्मिस के साथ पूरी त्वचा को हटाने के द्वारा चिह्नित क्षेत्र के भीतर एक परिपत्र घाव बनाएं। अंतिम घाव क्षेत्र 3.5-4.5 मिमी2के आसपास होगा, चित्रा 2खदेखें। 0.5 एमएल बाँझ नमकीन (0.9 % NaCl, 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ घाव साफ।
  17. घाव को कांच के कवरस्लिप के साथ कवर करें और टाइटेनियम चैम्बर पर स्नैप रिंग प्लाईर का उपयोग करके एक तस्वीर की अंगूठी के साथ इस ग्लास कवरस्लिप को ठीक करें।
  18. शल्य प्रक्रिया खत्म करने के तुरंत बाद, एक कैमरे से लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के इमेजिंग चरण पर माउस रखें और रोशनी के तहत छवियों (दिन 0) ले। 40X आवर्धन का उपयोग करें और भविष्य के ऑफ लाइन विश्लेषण के लिए छवियों को बचाने के.
    नोट: अन्वेषक तुरंत कब्जा करने के बाद छवियों की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि गुणवत्ता भविष्य ऑफ लाइन विश्लेषण के लिए पर्याप्त है चाहिए. skinfold कक्ष और त्वचा घाव के प्रदर्शन की तैयारी के आसपास 30 मिनट लगते हैं.
  19. कम से कम 2 ज के लिए संज्ञाहरण से वसूली के दौरान एक गर्म जगह पर माउस रखें. इसके बाद, अलग-अलग पिंजरों में चूहों को पशु सुविधा (12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र) में स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि चूहों को भोजन और पानी तक पहुंच प्राप्त हो।
  20. तीन दिन बाद घाव के बाद माउस को माउस-रिसोवर में रखें और इमेजिंग चरण के शीर्ष पर निरोधक को ठीक करें।
  21. एक कैमरे से लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत मंच रखें. 40x आवर्धन के साथ रोशनी के तहत छवियों को ले लो, सभी चित्रों को रिकॉर्ड और भविष्य ऑफ लाइन विश्लेषण के लिए उन्हें बचाने के लिए
  22. चरण दोहराएँ 4.20 और 4.21 फिर से दिन में 6, 10 और दिन 14 के बाद wounding.
  23. घाव छवियों का प्रयोग करें, ImageJ13में ऑफ लाइन विश्लेषण के लिए. दिन 0 में घाव क्षेत्र 100 % के रूप में माना जाता है और समय के साथ घाव बंद प्रारंभिक घाव क्षेत्र के सापेक्ष प्लॉट किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2c,dमें दिखाए जाते हैं।
  24. प्रतिशत की गणना करें (%) निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर घाव क्षेत्र का:
    Equation 2
    x:समय बिंदु (दिन 0, 3, 10 या 14), एक: दिन 0 में घाव क्षेत्र, ख:समय बिंदु x पर घाव क्षेत्र

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Representative Results

खरोंच परख जंगली प्रकार के एक confluent सेल मोनोलेयर पर किया गया था और $ 3 कमी MEFs (चित्र 1ग). एक 200 डिग्री पिपेट टिप का उपयोग कर "स्क्रैच" प्रदर्शन करने के बाद, दोनों जीनोटाइप से कोशिकाओं को खरोंच क्षेत्र में स्थानांतरित और अंतर बंद करें। छवियाँ 6, 10 और 30 h के बाद लिया गया (चित्र 1एक). सेल प्रवास प्रतिशत (%) के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था खरोंच क्षेत्र की कोशिकाओं को माइग्रेट करके repopulated 6 घंटे खरोंच प्रदर्शन करने के बाद. प्रवास कैव$3-कमी एमईएफ ने जंगली-प्रकार के चूहों से एमईएफ की तुलना में काफी पहले स्क्रैच क्षेत्र को बंद कर दिया था (चित्र 1ए,बी)। सेल प्रसार के किसी भी प्रभाव को बाहर करने के लिए, खरोंच प्रवास परख या तो 10% या 1% FCS की उपस्थिति में किया गया था. 10% FCS पर दोनों प्रक्रियाओं मौजूद हैं, सेल प्रसार और प्रवास, जबकि 1% FCS सेल प्रसार पर कम से कम है. 10% में फाइब्रोब्लास्ट्स (चित्र 1ख, बाएँ) या 1% FCS (चित्र 1ख, दाएँ) ने एक समान प्रवास पैटर्न दिखाया, जो कैव$ 3 में सेल प्रसार योगदान की संभावना को खारिज करता है। कैव3-कम एमईएफ ने दोनों स्थितियों के तहत जंगली-प्रकार एमईएफ की तुलना में काफी पहले अंतर को बंद कर दिया था। केव$3-निर्भर प्रभाव की पुष्टि करने के लिए जो कि 3-कम फाइब्रोब्लास्टों में देखा गया था, जंगली-प्रकार के फाइब्रोब्लास्टों को सिरना के साथ कैव$3 प्रोटीन को डाउन-रेन्यू करने के लिए ट्रांसफेक्टेड किया गया था (चित्र 1ई)। डाउन-विनियमन के लिए एक नियंत्रण के रूप में, इम्यूनोब्लॉट्स सिरना उपचार की दक्षता की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया गया। दो स्वतंत्र Cacnb3 विशिष्ट siRNA (siRNA1 और siRNA2), और एक तले हुए siRNA (एक नियंत्रण के रूप में) इस्तेमाल किया गया. कैकेनब3-विशिष्टसिआरएन के साथ उपचारित फाइब्रोब्लास्ट्स का व्यवहार 3-अपरूपी फाइब्रोब्लास्टों की तरह होता है (चित्र 1घ), अर्थात, कैव3 प्रोटीन की अनुपस्थिति में प्रवास में वृद्धि होती है (चित्र 1ई)।

विवो में, पृष्ठीय त्वचा-फ़ोल्ड चैम्बर प्रत्यारोपित किया गया था (चित्र 2ए, बी) और 2 मिमी व्यास का एक परिभाषित परिपत्र घाव जंगली-प्रकार के मुंडा पीठ पर उत्पन्न हुआ था ( चित्र2ख) जंगली-प्रकार और कैव$3-कम चूहों (8 जानवर प्रति जीनोटाइप, 8-12 सप्ताह पुराने और 22-26 ग्राम वजन). घाव त्वचा और dermis के साथ पूरी त्वचा को हटाने के द्वारा किया गया था. दोनों जीनोटाइप के बीच त्वचा घाव भरने की तुलना करने के लिए, त्वचा गुना चैम्बर में घाव क्षेत्र को घाव करने के बाद सीधे फोटो खिंचवाए गए (दिन 0) और फिर चित्र 3, 6, 10, और 14 दिनों के बाद घाव (चित्र 2ग) लिया गया था। घावों के आकार इन डिजिटल छवियों पर मापा गया और एक दिन में घाव क्षेत्र प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था (%) प्रारंभिक घाव क्षेत्र का (चित्र 2घ)। घाव बंद करने में वृद्धि हुई है $ 3-कमी चूहों में जंगली प्रकार के नियंत्रण की तुलना में. जंगली प्रकार के विपरीत, $ 3 कमी चूहों में घाव लगभग पूरी तरह से 10 दिनों के बाद पहले से ही बंद कर दिया गया था. 14 दिन के बाद घाव, घाव पूरी तरह से दोनों जीनोटाइप में बंद कर दिया गया (चित्र 2ग,d)।

Figure 1
चित्र 1 : इन विट्रो खरोंच प्रवास परख| (क)जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी, बाएँ) और कैव 3 KO ($ 3 KO, दाएँ) प्राथमिक माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) से संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों को तुरंत, 6, 10 और 30 एच एक खरोंच प्रदर्शन करने के बाद। छवियाँ 8 बिट ग्रे पैमाने में परिवर्तित कर रहे थे, और इसके विपरीत, साथ ही चमक, अधिकतम सेल मुक्त क्षेत्र कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया. सेल मुक्त क्षेत्र का विश्लेषण (स्क्रैच क्षेत्र का% भाग जो कक्षमाइग्रेन करके पुनः आबाद किया गया) मूल 24-बिट RGB छवियों पर किया गया था. (ख) प्रतिशत दर्शाने वाले बार ग्राफ (%) स्क्रैच क्षेत्र की कोशिकाओं के बाद पलायन कोशिकाओं द्वारा repopulated 6 घंटे के बाद या तो उच्च की उपस्थिति में (10 %, बाएँ) या कम (1%, दाएँ) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफसीएस) जंगली-प्रकार में (काला) और Cav$3 KO (लाल) प्रयोगों(ग) इम्यूनोब्लॉट: जंगली प्रकार मस्तिष्क से प्रोटीन अर्क (50 [जी प्रति लेन) और फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ, 100 डिग्री प्रति लेन) एक Cav$3 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर. $3 प्रोटीन (55 kDa) जंगली प्रकार के मस्तिष्क में मौजूद है (एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है), और फाइब्रोब्लास्ट्स, लेकिन Cav$3 की कमी मस्तिष्क और फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रोटीन के अर्क में अनुपस्थित है Cav$3 कमी चूहों से तैयार. (घ)जंगली-प्रकार की कोशिकाओं में 6 घंटे के बाद या तो तले हुए siRNA (नियंत्रण, काले) या दो स्वतंत्र Cacnb3 siRNAs (siRNA1 और siRNA2, लाल खुली सलाखों) के साथ इलाज किया कोशिकाओं माइग्रेट द्वारा repopulated खरोंच क्षेत्र के प्रतिशत का सारांश. (इ) प्रयोग में (घ) से संगत इम्युनोब्लॉट . डेटा मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - SEM, p मूल्यों unpaired दो पूंछ छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई. पैनलों एक और ख से संशोधित किया गया है [Belkacemi एट अल., 2018]4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : विवो त्वचा में चूहों में घाव भरने. (क)टाइटेनियम फ्रेम आंतरिक पक्ष दृश्य टाइटेनियम चैम्बर और सामने की ओर देखने का एक आधा दिखा दो सममित शिकंजा और पागल के साथ संलग्न आधा के साथ इकट्ठे टाइटेनियम कक्ष दिखा. (ख) पृष्ठीय त्वचा को शेविंग करने और दो सममित टाइटेनियम फ्रेम (टाइटेनियम फ्रेम का वजन लगभग 2 ग्राम) से बना पृष्ठीय त्वचा फोल्ड कक्ष बढ़ने और एक परिपत्र घाव (2 मिमी व्यास) लागू करने के बाद माउस। (ग)घाव के बाद सीधे घाव की छवियाँ (दिन 0) और 3, 6, 10, और 14 दिनों के बाद घाव. घाव बंद करने की निरंतर प्रक्रिया, पूर्ण उपकलाकेयीकरण के साथ, जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी, शीर्ष) और कैव$3 KO ($ 3 KO, नीचे) चूहों में 14 दिनों से अधिक दिखाया गया है। (घ)समय बिंदुओं पर संकेत दिया, घाव क्षेत्र एक कंप्यूटर की मदद से छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग कर निर्धारित किया गया था और घाव क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में साजिश रची तुरंत दिन 0 में चोट के बाद (मतलब ] SEM के n $ 8, $ 3 KO चूहों और इसी जंगली प्रकार नियंत्रण चूहों). P मान दो तरह ANOVA और Bonferroni के एकाधिक तुलना परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई. पैनलों ग और घ से संशोधित किया गया है [Belkacemi एट अल., 2018]4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम एक इन विट्रो और विवो घाव भरने परख में वर्णन और प्राप्त परिणामसहसंबंध. इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट्स4,14,15 जो घाव भरने और ऊतक11remodeling में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते थे इस्तेमाल किया. अन्य अनुशील कोशिका प्रकार मोनोलेयर्स (जैसे, उपकला कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, केरातिनोसाइट्स) के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यवहार्य और स्वस्थ कोशिकाओं की एक ही संख्या चढ़ाना और संगम की एक ही डिग्री पर खरोंच लागू करने के क्रम में सटीक और reproduible परिणाम प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि महत्व का है. यह अत्यधिक जैविक और तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। वर्तमान विधि में, 6 अच्छी तरह से प्लेटों का इस्तेमाल किया गया था, लेकिन 12- या 24 अच्छी प्लेटें भी इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर जब कोशिकाओं को केवल सीमित संख्या में उपलब्ध हैं. SiRNA उपचार के मामले में, प्रयोगों के प्रत्येक सेट के बाद इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य है कि लक्ष्य प्रोटीन कुशलता से नीचे विनियमित है। स्थानांतरण अभिकर्मक और समय विंडो का परीक्षण किया जाना चाहिए और माइग्रेशन परख के साथ शुरू करने से पहले प्रत्येक सेल प्रकार के लिए चयनित किया जाना चाहिए। फाइब्रोब्लास्ट्स और Cacnb3 जीन के मामले में, यह 3 से 4 दिन लग गए नीचे विनियमन के वांछित स्तर तक पहुँचने के लिए. इसके विपरीत, खरोंच प्रवास परख कम समय (6 ज से 24 ज) की जरूरत है। खरोंच आकार में उच्च परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, यह अनिवार्य है कि एक ही अन्वेषक प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए खरोंच लागू होता है, कि बराबर दबाव पिपेट टिप द्वारा प्रशासित है और घाव के रूप में ज्यादा के रूप में चिह्नित लाइन पर चिह्नित लाइन के लिए संभव ऊर्ध्वाधर रखने के लिए कोशिका मोनोलेयर के पार प्लेट के नीचे. सेल मोनोलेयर में एक यांत्रिक खरोंच के आवेदन से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से अतिरिक्त कोशिकीय अंतरिक्ष में विभिन्न सेलुलर कारकों (जैसे, एटीपी) की रिहाई होती है। इन कारकों Ca2 सहितparacrine संकेत प्रेरित होगा + पड़ोसी कोशिकाओं में -signaling, जो बारी में सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करेगा16. इन प्रभावों से बचने के लिए, संस्कृति आवेषण कोशिकाओं चढ़ाना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इन आवेषण के बाद एक सेल मुक्त अंतर पड़ोसी कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना बनाया जाता है17. उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए, जांचकर्ताओं 96 अच्छी प्लेटों में reproduible और लगातार खरोंच बनाने के लिए बाजार पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करने पर विचार हो सकता है. समय के साथ लगातार सेल प्रवास गतिज का पालन करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को भी स्वत: छवि पर कब्जा करने के लिए उच्च अंत वाणिज्यिक प्रणालियों का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं. हालांकि, खरोंच आवेदन और छवि पर कब्जा करने के लिए स्वचालित सिस्टम हमेशा उच्च लागत की वजह से उपलब्ध नहीं हैं. समय चूक इमेजिंग के लिए एक और अधिक सुलभ और लागत प्रभावी समाधान उदाहरण के लिए प्रणाली का उपयोग कर होगा (ATLIS: एक सस्ती समय चूक इमेजिंग और ऊष्मायन प्रणाली) Hernandez वेरा और सहयोगियों द्वारा वर्णित18.

किसी भी सेल प्रसार inhibitors के अभाव में, खरोंच प्रवास परख में अंतर की repopulation सेल प्रवास और सेल प्रसार का एक संयोजन है. केवल सेल प्रवास की निगरानी करने के लिए, सेल प्रसार उदाहरण के लिए या तो Actinomycin सी19 या Mitomycin सी 20 के साथ उपचार के द्वारा दबा दिया जा सकताहै. इन यौगिकों की पर्याप्त सांद्रता सावधानी से निर्धारित किया जाना चाहिए और इन यौगिकों के विषाक्त प्रभाव से बचने के लिए परीक्षण किया, जो कोशिकाओं की व्यवहार्यता और स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता को प्रभावित कर सकता है. के रूप में वर्तमान लेख में वर्णित, सीरम भुखमरी या संस्कृति माध्यम में सीरम एकाग्रता की कमी सेल प्रसार के प्रभाव को कम करने के लिए एक और तरीका है. सीरम भुखमरी कई अन्य सेल आधारित परख में प्रयोग किया जाता है. यह सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक उच्च संख्या है, जो प्राप्त परिणाम और व्याख्याओं21के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं प्रेरित कर सकते हैं. सीरम भुखमरी सावधानी से लागू किया जाना चाहिए और सेल व्यवहार्यता पर इसके प्रभाव प्रयोग शुरू करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए. वर्तमान लेख में, 10% या 1% सीरम की उपस्थिति में प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रवास दिखाया गया है (चित्र 1खदेखें)। प्रवासन दर, जैसा कि उम्मीद थी, सीरम की कम सांद्रता में धीमी है। हालांकि, दोनों स्थितियों में जंगली-प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में 3-कम फाइब्रोब्लास्ट तेजी से स्थानांतरित होते हैं; कम और उच्च सीरम एकाग्रता.

पृष्ठीय skinfold कक्ष का उपयोग कर त्वचा घाव भरने परख विवो में समय के साथ त्वचा घाव बंद करने की जांच करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है। चूहोंमें पहली बार टाइटेनियम पृष् ठीय त्वचा के छिद्र कक्ष का रोपण किया गया . Sorg एट अल SKH1-hr hairless चूहों में इस तकनीक का इस्तेमाल घाव भरने और नए रक्त वाहिकाओं के गठन का पालन करने के लिए9. skinfold कक्ष मॉडल इस लेख में वर्णित शास्त्रीय घाव चिकित्सा पर कई फायदे हैं पृष्ठीय त्वचा पर प्रदर्शन किया, कान पर23 या चूहों के पिछले अंग7. एक गिलास कवरस्लिप के साथ घाव क्षेत्र को कवर संक्रमण और ऊतक आघात को रोकता है और घाव के शुष्कीकरण को सीमित करता है। कांच coverslip के साथ कवर अवलोकन कक्ष चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय खोला जा सकता है, विभिन्न औषधीय सक्रिय यौगिकों के सामयिक आवेदन की अनुमति (जैसे, समाधान या मलहम के रूप में Cav$3 के लिए siRNA) और कक्ष हो सकता है फिर से बंद कर दिया. Murine त्वचा घाव उपचार प्रक्रिया दोनों संकुचन और उपकला24से बना है . चूहों में पृष्ठीय skinfold कक्ष का उपयोग त्वचा संकुचन को कम करता है और मुख्य रूप से उपकला की प्रक्रिया का अध्ययन करने का अवसर देता है. यह भी निरीक्षण और घाव बंद करने की प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक स्पष्ट खिड़की प्रदान करता है। टाइटेनियम कक्ष का एक नुकसान यह है कि माउस को टाइटेनियम चैम्बर ले जाना है, जिसमें लगभग 2 ग्राम (एक 26 ग्राम माउस के वजन का 7.7%) 14 दिनों के लिए है। यह माउस के लिए कुछ परेशानी का कारण हो सकता है, हालांकि ऐसा लगता है कि चूहों अच्छी तरह से इस कक्ष को सहन और वे आराम कर रहे हैं और आसानी से भोजन और पानी तक पहुँच सकते हैं. इस लेख में प्रस्तुत त्वचा घाव भरने मॉडल माउस प्रति केवल एक घाव का अध्ययन कर सकते हैं. अन्य प्रकाशित विधियों25,26 माउस प्रति दो घाव लागू करने का सुझाव है जो एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाएगा. यह उद्देश्य जानकारी प्राप्त करने के लिए सभी चूहों के लिए समान आकार का एक परिपत्र घाव बनाने के लिए बहुत महत्व का है और साथ ही विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य परिणाम. समय के साथ घावों की छवियों को लेने के लिए, चूहों एक माउस निरोधक पर तय कर रहे थे, एक मंच पर रखा, और skinfold कक्ष एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत तैनात है. निरोधक का उपयोग संज्ञाहरण से बचने और चूहों के लिए तनाव को कम करने में मदद करता है। चूहे का बलिदान किया जा सकता है और घायल क्षेत्र से ऊतकों को लगाया जा सकता है और उपचार प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में एकत्र किया जा सकता है (या तो पूर्ण उपचार के बाद या पहले के समय अंक पर) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, आरएनए संग्रह या प्रोटीन जैव रसायन के लिए।

सारांश में, हम दो तकनीकों से पता चला है, एक इन विट्रो खरोंच परख प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट ्सऔर चूहों में एक विवो त्वचा घाव भरने परख का उपयोग कर. दोनों परखों में, वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों की कैवजेड 3 उपइकाई के अभाव में घाव भरने/ जंगली प्रकार और Cav$3 कमी चूहों या कोशिकाओं के साथ के रूप में, दोनों परख अच्छी तरह से अनुपस्थिति या अन्य विशिष्ट अणुओं की उपस्थिति में सहसंबंधित हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम डॉ पेट्रा Weissgerber और SPF पशु सुविधा के ट्रांसजीन इकाई (SFB 894 की परियोजना P2) चिकित्सा संकाय और Saarland विश्वविद्यालय, Homburg के चिकित्सा संकाय में नैदानिक और प्रायोगिक सर्जरी के संस्थान में पशु सुविधा धन्यवाद. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एंड्रियास बेक धन्यवाद. इस अध्ययन के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, परियोजना A3 से A.B. और V.F.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9 % NaCl
1 ml syringes BD Plastipak 303172
6 well plate Corning 3516
Biopsy punch Kai Industries 48201 2 mm
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) Origene SR415626
Depilation cream any depilation cream
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) Bayer 3400935940179.00 (BEPANTHEN)
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) Bayer Health Care Rompun 2%
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by life technologies 41966-029
Fetal bovine serum Gibco by life technologies 10270-106
Hexagon full nut
Ketamine hydrochloride Zoetis KETASET
Light microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-8000 Similar microscopes might be used
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778075
Micro-forceps
Micro-Scissors
Mouse restrainer Home-made
Normal scissors
Objective Nikon plan apo 10x/0.45
Opti-MEM Gibco by life technologies 51985-026
Polypropylene sutures
Screwdriver
Skin disinfectant (octeniderm) Schülke & Mayr GmbH 118212
Slotted cheese head screw
Snap ring
Snap ring plier
Surgical microscope with camera Leica Leica M651
Titanium frames for the skinfold chamber IROLA 160001 Halteblech M
Wire piler

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References

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चिकित्सा अंक 151 घाव भरने खरोंच प्रवास पृष्ठीय skinfold कक्ष फाइब्रोब्लास्ट्स siRNA transfection Cav$3
खरोंच प्रवास परख और डोर्सल स्किनफ़ोल्ड चैंबर इन विट्रो के लिए और घाव हीलिंग के Vivo विश्लेषण में
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Belkacemi, A., Laschke, M. W., Menger, M. D., Flockerzi, V. Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing. J. Vis. Exp. (151), e59608, doi:10.3791/59608 (2019).

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