Summary
Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.
Abstract
La cicatrisation des plaies cutanées est une préoccupation majeure pour les patients souffrant de diabète et pour les personnes âgées, et il est nécessaire d'un traitement efficace. Des approches in vitro et in vivo appropriées sont essentielles pour l'identification de nouvelles molécules cibles pour les traitements médicamenteux afin d'améliorer le processus de guérison des plaies cutanées. Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à rayons de tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies dans deux essais indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Fibroblastes embryonnaires primaires de souris (MEFs) aiguement isolés des souris sauvages (WT) et Cav 3-déficientes (Cav3KO) ou fibroblastes aiguement isolés des souris de WT traitées avec siRNA pour réguler vers le bas l'expression du gène de Cacnb3 , l'encodage Cav3,ont été utilisés. Une égratignure a été appliquée sur une monocouche de cellules confluentes et la fermeture d'écart a été suivie en prenant des images microscopiques aux points de temps définis jusqu'à repeupler complètement l'écart par les cellules migrantes. Ces images ont été analysées, et le taux de migration cellulaire a été déterminé pour chaque condition. Dans un analyse in vivo, nous avons implanté une chambre de pli de peau dorsal sur des souris WT et Cav3 KO, appliqué une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre, couvert la plaie avec un couvercle en verre pour la protéger contre les infections et la dessiccation, et surveillé la fermeture macroscopique de la plaie au fil du temps. La fermeture des plaies était significativement plus rapide chez les souris cicnb3-gène-déficientes. Étant donné que les résultats des essais in vivo et in vitro sont bien corrélés, l'analyse in vitro peut être utile pour le dépistage à haut débit avant de valider les coups in vitro par le modèle de guérison des plaies in vivo. Ce que nous avons montré icipour les souris ou les cellules de type sauvage et cav3-déficients pourrait également être applicable pour des molécules spécifiques autres que Cav3.
Introduction
La cicatrisation des plaies cutanées commence immédiatement après la blessure cutanée afin de restaurer l'intégrité de la peau et de protéger l'organisme contre les infections. Le processus de cicatrisation des plaies passe par quatre phases qui se chevauchent; coagulation, inflammation, nouvelle formation de tissu, et tissu transformant1. La migration cellulaire est cruciale pendant ces phases. Les cellules inflammatoires, les cellules immunitaires, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont activés à différents moments et envahissent la zone de la plaie2. Les méthodes d'enquête sur la cicatrisation des plaies in vitro et in vivo sont d'un grand intérêt non seulement pour comprendre les mécanismes sous-jacents, mais aussi pour tester de nouveaux médicaments et pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer et à accélérer la cicatrisation des plaies cutanées.
Pour surveiller et analyser la migration cellulaire, l'analyse de la migration des rayures peut être utilisée. On l'appelle souvent l'in vitro, l'invitro, comme l'exemple de guérison des plaies. Cette méthode nécessite une installation de culture cellulaire3. Il s'agit d'une procédure simple, il n'y a pas besoin d'équipement haut de gamme et l'analyse peut être effectuée dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Dans cet analyse, une zone sans cellules est créée par la perturbation mécanique d'une monocouche cellulaire confluente, de préférence des cellules ou des fibroblastes épithélials ou endothéliaux. Les cellules sur le bord de l'éraflure migreront afin de repeupler l'espace créé. La quantification de la diminution de la zone exempte de cellules au fil du temps ressemble au taux de migration et indique le temps dont les cellules ont besoin pour combler l'écart. À cette fin, les chercheurs peuvent utiliser soit des cellules très isolées de souris WT ou des souris dépourvues d'un gène d'intérêt4, ou des cellules immortalisées disponibles à partir de dépôts cellulaires fiables. L'exemple de rayure permet d'étudier l'influence des composés pharmacologiquement actifs ou l'effet des CDNA ou des siARN transfectés sur la migration cellulaire.
In vivo, la cicatrisation des plaies est un processus physiologique complexe, nécessitant différents types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules inflammatoires, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales afin de restaurer l'intégrité physique de la peau aussi rapidement que possible1 . Différentes méthodes pour étudier la cicatrisation in vivo des plaies ont été développées et utilisées au cours des5,6,7,8. La chambre de skinfold dorsal décrite dans cet article a été précédemment employée pour des essais de guérison de blessure9. Il est utilisé comme une préparation de chambre de skinfold dorsal modifiée pour des souris. Le modèle de chambre peau replié modifié présente plusieurs avantages. 1) il minimise la contraction de peau, qui empêche d'observer le processus de guérison de blessure et pourrait influencer la réparation de blessure chez les souris. 2) Cette chambre fait usage de couvrir la plaie avec un couvercle en verre, réduisant des infections de tissu et dessiccation, qui pourrait retarder le processus de guérison. 3) Le flux sanguin et la vascularisation peuvent être directement surveillés. 4) Il permet l'application topique répétitive des composés pharmacologiquement actifs et des réactifs afin de traiter la blessure et d'accélérer la guérison9,10.
Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à haute tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies cutanées à l'aide de deux protocoles indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Pour l'évaluation in vitro, nous avons utilisé des fibroblastes primaires, ces cellules expriment le gène Cacnb3 codant la protéine Cav3, mais manquent d'afflux De Ca2 ou de courants Ca2 dépendants de la tension. Nous avons décrit une nouvelle fonction de Cav-3 dans ces fibroblastes : Cav-3 se lie au récepteur inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) et les contraintes de libération de calcium du réticulum endoplasmique. La suppression du gène Cacnb3 chez la souris conduit à une sensibilité accrue de l'IP3R pour IP3, la migration cellulaire améliorée et la réparation accrue des plaies cutanées4.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées et exécutées conformément aux règlements d'éthique et aux comités de protection des animaux de la Sarre et de l'Université de la Sarre.
1 Culture cellulaire primaire et transfection de siRNA
REMARQUE : Dans la méthode décrite, des fibroblastes primaires sont utilisés. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. Dans cette expérience, le gène Cacnb3, codant la sous-unité Cav3 des canaux calciques à haute tension12 a été régulé vers le bas, montrant ainsi son rôle dans la migration cellulaire in vitro et la réparation des plaies cutanées in vivo4.
- Préparation de l'ARNre : Avant de reconstituer les siRNAs, centrifuger brièvement les tubes pour s'assurer que le contenu est en bas. Reconstituer les siARN dans un tampon sans RNase de 100 L (100 mM d'acétate de potassium, 30 mM HEPES, pH 7,5) fourni par le fabricant à une concentration de 20 m. Il s'agit d'une solution de stock de siRNAs.
- Aliquot cette solution de stock à 10 l par tube (20 M de concentration) et stocker à -20 oC jusqu'à utilisation.
- À l'aide d'un marqueur permanent ultrafin, marquez une plaque de 6 puits avec une ligne horizontale au fond de chaque puits afin de pouvoir toujours identifier la même région d'égratignure d'intérêt et de suivre sa fermeture.
REMARQUE : Des plaques de culture de 6 puits ont été utilisées dans cet analyse parce qu'elles sont assez grandes, pour fournir suffisamment d'espace et de flexibilité pour appliquer une égratignure cohérente, reproductible et verticale à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l sur la monocouche cellulaire. Si un nombre limité de cellules sont disponibles, une autre façon et probablement rentable serait d'utiliser des plaques de culture de 12 ou 24 puits. - Fibroblastes primaires de plaque, isolés des souris sauvages-type et de 3-déficients4,dans une plaque de 6 puits à une densité de 5 x 105 cellules/puits en présence du milieu modifié d'aigle de 2 ml de Dulbecco (DMEM) complété avec le sérum bovin foetal de 10% (FCS).
REMARQUE : 5 x 105 cellules par puits ont été établies pour la plaque de culture de 6 puits et pour les fibroblastes primaires de souris. Des tests peuvent être nécessaires si l'utilisation de plaques de culture cellulaire de 12 ou 24 puits ou d'autres types de cellules, qui pourraient être de taille différente. Les cellules doivent être manipulées dans un environnement stérile tel que les armoires de sécurité biologique s'occupent de classe II. - Étiquetez la plaque de 6 puits avec le type de cellule, le génotype et la date.
- Déplacer la plaque de 6 puits dans l'incubateur de culture cellulaire et maintenir les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Le lendemain, sortez la plaque de l'incubateur, aspirez le milieu de culture cellulaire du puits, jetez-la et remplacez-la par un milieu de culture frais de 2,25 ml en l'ajoutant soigneusement contre la paroi du puits.
- Afin de transfect fibroblastes avec des siRNAs, utilisez un réactif de transfection à base de lipides comme recommandé par le fabricant.
- Pour chaque transfection, étiqueter deux tubes de microcentrifuge. Dans le premier, ajouter 9 L du réactif de transfection et le diluer avec un milieu sérique réduit de 150 l. Dans le deuxième tube, ajoutez 1,5 L siRNA(Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA brouillé comme un contrôle négatif) et diluez-le avec un milieu de sérum réduit de 150 l.
- Ajouter le siRNA dilué dans le tube contenant un réactif de transfection dilué et un vortex pendant 2 s. Incuber le mélange pendant 5 min à 21 oC.
- Étiquetez les puits avec Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA brouillé. Ajouter 250 L du mélange de réactifs siRNA-transfection dans le sens de la chute aux cellules.
- Remettre la plaque de culture de 6 puits dans l'incubateur et maintenir les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 72 h.
- Afin de vérifier l'efficacité du silençage des gènes Cacnb3, de recueillir des cellules transfectées et d'effectuer une analyse immunoblot tel que décrit précédemment4.
2. Test de guérison des plaies in vitro (test de migration à gratter)
- Sortez la plaque de culture cellulaire de l'incubateur et examinez les cellules au microscope à l'aide de l'objectif 10x. Commencez par l'égratignure seulement quand ils ont atteint 100% confluence.
REMARQUE : Pour la précision et la reproductibilité, la confluence à 100 % est un facteur obligatoire pour commencer l'analyse de migration des rayures. Par conséquent, il est important de semer le même nombre de cellules dans les puits de culture, d'examiner chaque puits pour la confluence et d'appliquer la rayure au même moment (jour 0 confluence). Attendre plus longtemps après que les cellules atteignent 100% de confluence peut évoquer des réponses différentes. - Une fois que la cellule atteint 100% de confluence, aspirez le milieu de culture hors du puits et jetez-le.
- Utilisez une pointe de pipette (200 l) pour créer manuellement une égratignure verticale à la ligne horizontale marquée au fond du puits, à travers la monocouche de cellules confluentes au milieu du puits.
- Rincer chaque puits deux fois avec 2 mL de saline tamponnée par phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mKHKH 2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) pour éliminer les facteurs libérés des cellules endommagées, des cellules lâches et des débris de la zone rayée. Ajouter 2 ml de PBS soigneusement contre la paroi du puits pour éviter de détacher les cellules de la culture cellulaire bien.
- Ajouter 2 ml de milieu de culture cellulaire contenant soit 10% de sérum ou 1% de sérum soigneusement à chaque puits.
REMARQUE : Il est recommandé d'effectuer l'essai de rayure sous 10% de sérum et moins de 1% de sérum pour confirmer que l'effet observé est provoqué par la prolifération et la migration de cellules ou par la migration cellulaire seulement. - Déplacez la plaque au stade du microscope et capturez des images lumineuses de la zone sans cellules (deux zones par puits) immédiatement après le grattage (t-0h) à un grossissement de 10x à l'aide d'un microscope léger. Pour imager toujours la même région de l'éraflure, utilisez la ligne horizontale, qui a été préparée par étape (1.3), et prenez une image au-dessus de cette ligne et une image au-dessous de cette ligne. Enregistrez des images comme TIFF ou JPEG.
- Étant donné que le stade du microscope ne maintient pas l'état de croissance cellulaire, déplacez la plaque vers l'incubateur de culture cellulaire et maintenez les cellules à 37 oC et 5 % de CO2.
- Après 6, 10 et 30 h, déplacez la plaque à nouveau au stade du microscope et capturez les images de la même manière que décrite à l'étape 2.6.
REMARQUE : Ces points de temps ont été établis pour la procédure décrite et pour les fibroblastes primaires. Au cours de la première expérience pilote, plus de points de temps ont été testés pour voir à quelle vitesse les fibroblastes repeuplent l'écart. Bien que 0, 6, 10 et 30 h soient des points de départ raisonnables, les enquêteurs devraient optimiser et établir les points de temps appropriés pour chaque application et pour chaque type de cellule. L'alternative la plus précise, si elle est disponible, serait d'utiliser la microscopie en accéléré. - À l'aide de L'imageJ13, quantifiez la zone initiale exempte de cellules (100 %) et la zone restante après 6, 10 et 30 h (figure 1). Le pourcentage de la zone d'égratignure repeuplée par les cellules migratrices est ensuite calculé par rapport à la zone initiale de rayures.
3. Analyse de la zone de rayures
- Ouvrez le logiciel ImageJ13.
- Téléchargez la première image en tant que JPEG (par exemple, 24 bits images RGB 1360x1024) en laissant tomber l'image dans la barre de menu ImageJ.
- Sélectionnez le bouton de sélection à main levée et marquez la zone sans cellules
- Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesure. Une fenêtre avec les résultats apparaîtra contenant la valeur de la zone.
- Transférez cette valeur dans une feuille de calcul d'analyse.
- Répétez les étapes 3.2-3.5 pour chaque image à partir du point de temps 0 h, puis recommencez pour la prochaine fois les points 6, 10 et 30 h.
- Calculez le pourcentage de zone de rayures repeuplée par les cellules migratrices après 6, 10 et 30 h pour chaque égratignure en utilisant l'équation suivante :
une zone libre de cellules de l'égratignure initiale, b - zone libre de cellules après 6 h - Calculer la moyenne et l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.) pour le pourcentage de zone de rayurere repeuplée par les cellules de migration après 6 h. Afficher les données sous forme de graphique à barres de colonne ou de parcelle de dispersion.
4. In vivo peau plaie curatif d'analyse
REMARQUE : Les mâles de type sauvage C57BL/6 (8-12 semaines avec un poids corporel de 22-26 g) et les souris de Type Cav3 comme contrôle sont utilisés pour cette étude.
- Un jour avant de commencer l'expérience, autoclavetous les instruments chirurgicaux, vis, écrous et cadres en titane à utiliser pour la préparation de la chambre de skinfold.
REMARQUE : Le cadre en titane est composé de deux moitiés complémentaires symétriques et il dispose d'une fenêtre d'observation circulaire où la plaie sera appliquée et suivie d'une microscopie (voir Figure 2a). - Anesthésiez une souris sauvage ou déficiente de 3 (22-26 g de poids corporel) par injection intrapéritonéale (i.p.) de 0,1 mL de saline/10 g de poids corporel contenant un mélange de kétamine (75 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (25 mg/kg de poids corporel). Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réponse à une pincée d'orteil.
REMARQUE: Cette injection donne environ 30 min d'anesthésie chirurgicale et la profondeur de l'anesthésie doit être contrôlée par la procédure chirurgicale, en vérifiant les réflexes de la souris. - Pour éviter la sécheresse ou les dommages des yeux, appliquez l'onde ophtalmique sur les deux yeux et répétez l'application si nécessaire.
- Raser soigneusement le dorsum souris, à l'aide d'un rasage électrique suivie de l'application d'une crème de dépillation à la zone rasée pour enlever les cheveux restants. Veillez à ne pas blesser la peau de la souris. Laisser la crème de dépillation pendant environ 10 min pour enlever complètement tous les cheveux.
- Préparer la chambre en titane en prenant une partie du cadre symétrique de la chambre en titane et fixer les vis de connexion avec des noix sur un côté. Ces écrous serviront d'espaceur pour garder 400-500 m entre les deux parties symétriques de la chambre pour éviter la compression des vaisseaux sanguins dans la peau.
- Retirer la crème de l'arrière de la souris et nettoyer la région sans poils avec de l'eau chaude du robinet (35-37 oC).
- Assurez-vous que l'endroit où effectuer la chirurgie est propre, chaud (37 oC) et humidifié.
- Désinfecter la zone sans poils de la souris avec un désinfectant pour la peau. Prenez un pli de la peau arrière de la souris devant une source lumineuse et placez la ligne médiane de la double couche de la peau où la chambre en titane sera implantée. Après cela, fixer le skinfold avec une suture de polypropylène cranially et caudally et serrer l'autre côté de la suture sur une grille en métal pour soulever la peau pliée de souris. Ajustez la hauteur du support pour permettre à la souris de s'asseoir confortablement.
- Implantez la chambre de titane dans le pli de la peau arrière de la souris de manière à sandwich la couche de peau dorsal pliée entre les deux moitiés symétriques du cadre de titane. Attachez la première moitié du cadre en titane par des sutures en polypropylène sur son bord supérieur à l'arrière du skinfold dorsal.
REMARQUE: Sur le cadre en titane, il ya 8 trous sur le bord supérieur (Figure 2a) et la peau pliée doit être bien fixé par des sutures en polypropylène sur chacun des huit trous. - Avant de passer à l'étape suivante, vérifiez les réflexes de la souris pour vous assurer que la profondeur de l'anesthésie est maintenue.
- À la base du skinfold, passer les deux vis de connexion, attachées à la première moitié de la chambre en titane, pour pénétrer le skinfold de l'arrière vers le côté avant. Faire de petites incisions sur la peau (à l'aide de ciseaux fins) pour aider à lisser la pénétration des vis de connexion.
- Détachez la souris de la grille et placez-la sur une position latérale. Placez la deuxième moitié complémentaire de la chambre en titane sur les 3 vis de connexion (voir Figure 2a) et appliquez une légère pression avec les doigts afin de passer ces vis à travers la seconde moitié du cadre en titane. Ensuite, fixer les deux pièces symétriques avec des noix en acier inoxydable.
- Portez une attention particulière à l'étanchéité des vis à cette étape, car elle pourrait se détacher, si elle est trop lâche. En revanche, s'il est trop serré, il serrera le skinfold, réduira le flux sanguin et peut mener à l'affaiblissement de tissu et à la nécrose.
REMARQUE : Les écrous préparés à l'étape 4.5 servent d'espaceur pour garder une distance de 400-500 m entre les deux moitiés symétriques de la chambre en titane. Les écrous doivent être serrés jusqu'à ce qu'une légère résistance soit ressentie. - Couper la partie restante des vis à l'aide de pinces.
REMARQUE : Il est nécessaire à cette étape d'utiliser des lunettes de sécurité de laboratoire pour la protection des yeux au cas où la vis se détache dans le mauvais sens. - Marquer la zone de la plaie par un poinçon de biopsie standardisé (2 mm de diamètre), au centre de la peau dans la fenêtre d'observation (voir Figure 2a) de la chambre de pli de peau afin d'assurer la taille des plaies reproductibles.
- En utilisant des forceps et des ciseaux fins, créer une plaie circulaire dans la zone marquée en enlevant la peau complète avec l'épiderme et le derme. La zone de la plaie finale sera d'environ 3,5-4,5 mm2, voir Figure 2b. Nettoyer la plaie à l'air salin de 0,5 ml (0,9 % NaCl, 37 oC).
- Couvrez la plaie d'un bordereau en verre et fixez ce bordereau en verre avec un anneau en claquettes à l'aide de la pince à anneau sur la chambre en titane.
- Immédiatement après la fin de l'intervention chirurgicale, placez la souris au stade d'imagerie d'un stéréomicroscope équipé d'une caméra et prenez des images (jour 0) sous illumination. Utilisez le grossissement 40X et enregistrez les images pour l'analyse hors ligne future.
REMARQUE : L'enquêteur doit examiner les images immédiatement après la capture pour s'assurer que la qualité est suffisante pour de futures analyses hors ligne. La préparation de la chambre de skinfold et la performance de la blessure de peau prend environ 30 minutes. - Gardez la souris à un endroit chaud pendant la récupération de l'anesthésie pendant au moins 2 h. Par la suite, transférez les souris dans des cages individuelles à l'établissement animalier (cycle lumière/obscurité de 12 h) et assurez-vous que les souris ont accès à la nourriture et à l'eau.
- Trois jours après la blessure placer la souris dans un anti-souris et fixer la correction sur le dessus de l'étape d'imagerie.
- Placez la scène sous un stéréomicroscope équipé d'une caméra. Prenez des images sous l'éclairage avec le grossissement 40x, enregistrez toutes les images et enregistrez-les pour de futures analyses hors ligne
- Répétez les étapes 4.20 et 4.21 encore au jour 6, 10 et jour 14 post-blessure.
- Utilisez les images de la plaie, pour l'analyse hors ligne dans ImageJ13. La zone de la plaie au jour 0 est considérée comme 100 % et la fermeture de la plaie au fil du temps est tracée par rapport à la zone de la plaie initiale. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 2c,d.
- Calculer le pourcentage (%) de la zone de la plaie à chaque moment en utilisant l'équation suivante :
x: point de temps (jour 0, 3, 10 ou 14), a: zone de blessure au jour 0, b: zone de blessure au point de temps x
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Representative Results
L'égratignure a été réalisée sur un monocouche de cellules confluentes de type sauvage et de MEF déficients(figure 1c). Après avoir effectué le « scratch » à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l, les cellules des deux génotypes migrent dans la zone de rayures et comblent l'écart. Les images ont été prises après 6, 10 et 30 h (Figure 1a). La migration cellulaire a été quantifiée en pourcentage (%) de la zone de rayurere repeuplée par les cellules de migration 6 heures après l'exécution de l'éraflure. Les MEF migrateurs de Cav3-déficients ont fermé la zone d'égratignure beaucoup plus tôt que les MEF de souris de type sauvage(figure 1a,b). Pour exclure tout effet de prolifération cellulaire, l'adiquier a été effectué en présence de 10 % ou 1 % de FCS. À 10% FCS les deux processus sont présents, la prolifération cellulaire et la migration, tandis qu'à 1% de prolifération des cellules FCS est réduite au minimum. Les fibroblastes dans 10 %(figure 1b, à gauche) ou 1 % de FCS(figure 1b, à droite) ont montré un modèle de migration similaire, excluant la possibilité d'une contribution à la prolifération cellulaire au phénotype observé par Cav3. Les MEF déficients de Cav3 ont comblé l'écart beaucoup plus tôt que les MEF de type sauvage dans les deux conditions. Pour confirmer l'effet dépendant de Cav3 observé dans les fibroblastes déficients de 3 ans, les fibroblastes de type sauvage ont été transfectés avec du siRNA pour réguler la protéine Cav-3(figure 1e). Comme contrôle pour le down-regulation, des immunoblots ont été exécutés pour confirmer l'efficacité du traitement de siRNA. Deux siRNAs spécifiques indépendants de Cacnb3 (siRNA1 et siRNA2), et un siRNA brouillé (comme commande) ont été employés. Les fibroblastes traités avec les siRNAs spécifiques de Cacnb3se comportent comme des fibroblastes déficients de 3 (figure 1d), c'est-à-dire que la migration est augmentée en l'absence de protéine Cav-3 (Figure 1e).
In vivo, la chambre de pli de peau dorsal a été implantée (Figure 2a,b) et une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre a été générée sur le dos rasé (figure 2b) des souris de type sauvage et de Cav3-déficientes (8 animaux par génotype, 8-12 semaines et 22-26 g de poids). La blessure a été exécutée en enlevant la peau complète avec l'épiderme et le derme. Pour comparer la cicatrisation des plaies cutanées entre les deux génotypes, la zone de la plaie dans la chambre de pliage de la peau a été photographiée directement après avoir été blessée (jour 0) et des photos ont ensuite été prises 3, 6, 10 et 14 jours après la blessure (figure 2c). La taille des blessures a été mesurée sur ces images numériques et la zone de la plaie à un jour donné a été exprimée en pourcentage (%) de la zone de la plaie initiale (figure 2d). La fermeture des plaies est augmentée chez les souris déficientes de 3 par rapport aux témoins de type sauvage. Contrairement au type sauvage, la plaie chez les souris déficientes de 3 était presque complètement fermée déjà après 10 jours. Au 14e jour après la blessure, les blessures étaient complètement refermées dans les deux génotypes(figure 2c,d).
Figure 1 : Test de migration de rayures in vitro. (a) Images représentatives de cultures de type sauvage (WT, gauche) et de Cav3 KO (3 KO, droite) fibroblastes embryonnaires de souris primaires (MEFs) immédiatement, 6, 10 et 30 h après avoir effectué une égratignure. Les images ont été converties en échelle grise 8 bits, et le contraste, ainsi que la luminosité, ont été adaptés pour visualiser au maximum la zone libre de cellules. L'analyse de la zone exempte de cellules (% de la zone de rayures repeuplée par les cellules de migration) a été effectuée sur les images originales 24 bits RGB. (b) Graphiques à barres montrant les pourcentages (%) de la zone d'égratignure repeuplée par les cellules migratrices après 6 heures soit en présence de haute (10 %, gauche) ou faible (1 %, à droite) sérum bovin fœtal (FCS) dans des expériences de type sauvage (noir) et Cav3 KO (rouge) (c) Immunoblot : extraits de protéines du cerveau sauvage (50 par voie) et par fibroblastes (MEF, 100 g par voie) à l'aide d'un anticorps spécifique Cav3. La protéine no 3 (55 kDa) est présente dans le cerveau de type sauvage (utilisé comme témoin) et les fibroblastes, mais elle est absente dans les extraits protéiques du cerveau et des fibroblastes déficients de Cav3 préparés à partir de souris déficientes de Cav3. (d) Résumé du pourcentage de surface de rayures repeuplée par les cellules migrantes après 6 heures dans des cellules de type sauvage traitées avec soit l'ARNre brouillé (contrôle, noir) ou deux siRNAs Cacnb3 indépendants (siRNA1 et siRNA2, barres ouvertes rouges). (e) L'immunoblot correspondant de l'expérience dans (d). Les données sont affichées comme moyennes - SEM, p les valeurs ont été calculées à l'aide du test t de l'étudiant à deux queues non apparié. Les panneaux a et b ont été modifiés à partir de [Belkacemi et al., 2018]4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cicatrisation in vivo des plaies cutanées chez la souris. (a) Vue intérieure de côté de cadre de titane montrant une moitié de la chambre en titane et vue latérale avant montrant la chambre en titane assemblée avec deux moitiés symétriques attachées avec des vis et des écrous. (b) Souris après le rasage de la peau dorsale et le montage de la chambre de pli de peau dorsal composée de deux cadres symétriques en titane (le poids du cadre de titane est d'environ 2 g) et l'application d'une plaie circulaire (2 mm de diamètre). (c) Images de la blessure directement après la blessure (jour 0) et 3, 6, 10 et 14 jours après la blessure. Le processus continu de fermeture des plaies, avec épithélialisation complète, est montré sur 14 jours chez les souris de type sauvage (WT, en haut) et de Cav3 KO (3 KO, en bas). d) Au moment où les points indiqués, la zone de la plaie a été déterminée à l'aide d'un programme d'analyse d'image assisté par ordinateur et tracée en pourcentage de la zone de la plaie immédiatement après la blessure au jour 0 (moyenne - SEM de n - 8, 3 souris KO et le type sauvage correspondant souris de contrôle). Les valeurs P ont été calculées à l'aide du test de comparaisons multiples d'ANOVA et bonferroni. Les panneaux c et d ont été modifiés à partir de [Belkacemi et al., 2018]4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons un analyse de guérison in vitro et in vivo de blessure et corrélons les résultats obtenus. Pour l'analyse in vitro, nous avons utilisé les fibroblastes primaires de souris4,14,15 qui jouent un rôle important dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. D'autres types de cellules adhérentes qui poussent sous forme de monocouches (p. ex. cellules épithéliales, cellules endothéliales, kératinocytes) peuvent également être utilisés. Le plaquage du même nombre de cellules viables et saines et l'application de l'égratignure au même degré de confluence est d'une importance primordiale afin d'obtenir des résultats précis et reproductibles. Il est fortement recommandé d'effectuer des répliques biologiques et techniques. Dans la méthode actuelle, des plaques de 6 puits ont été utilisées, mais des plaques de 12 ou 24 puits peuvent également être utilisées, surtout lorsque les cellules ne sont disponibles qu'à nombre limité. Dans le cas du traitement de l'ARNc, l'analyse des immunoblotaprès chaque ensemble d'expériences est obligatoire pour s'assurer que la protéine cible est efficacement régulée vers le bas. Le réactif de transfection et la fenêtre temporelle doivent être testés et sélectionnés pour chaque type de cellule avant de commencer l'essai de migration. Dans le cas des fibroblastes et du gène Cacnb3, il a fallu 3 à 4 jours pour atteindre le niveau souhaité de régulation. En revanche, l'analyse de migration des rayures nécessite des temps plus courts (6 h à 24 h). Pour éviter une grande variabilité de la taille des rayures, il est obligatoire que le même chercheur applique l'égratignure pour chaque ensemble d'expériences, que la pression égale est administrée par la pointe de pipette et de garder la plaie autant que possible verticale à la ligne marquée à la en bas de la plaque à travers la monocouche cellulaire. L'application d'une égratignure mécanique sur la monocouche cellulaire entraîne la libération de différents facteurs cellulaires (p. ex., ATP) à partir de cellules endommagées dans l'espace extracellulaire. Ces facteurs induiraient la signalisation paracrine comprenant Ca2 -signalisation dans les cellules voisines, qui à son tour influencerait des réponses cellulaires16. Pour éviter ces effets, des inserts de culture peuvent être utilisés pour le placage des cellules et après l'enlèvement de ces inserts un espace sans cellules est créé sans endommager les cellules voisines17. Pour le dépistage à haut débit, les enquêteurs pourraient envisager d'utiliser des instruments disponibles sur le marché pour créer des rayures reproductibles et cohérentes dans des plaques de 96 puits. Pour suivre la cinétique de migration cellulaire en continu au fil du temps, les utilisateurs peuvent également envisager d'utiliser des systèmes commerciaux haut de gamme pour la capture automatique d'images. Cependant, les systèmes automatisés pour l'application de rayures et la capture d'image ne sont pas toujours disponibles en raison des coûts élevés. Une solution plus accessible et plus rentable pour l'imagerie en accéléré serait par exemple l'utilisation du système (ATLIS: un système d'imagerie et d'incubation en accéléré abordable) décrit par Hernandez Vera et ses collègues18.
En l'absence d'inhibiteurs de la prolifération cellulaire, le repeuplement de l'écart dans l'analyse de migration des rayures est une combinaison de migration cellulaire et de prolifération cellulaire. Pour ne surveiller que la migration cellulaire, la prolifération cellulaire peut être supprimée par exemple par un traitement avec Actinomycin C19 ou Mitomycin C20. Les concentrations adéquates de ces composés doivent être soigneusement déterminées et testées afin d'éviter les effets toxiques de ces composés, qui pourraient affecter la viabilité des cellules et leur capacité à migrer. Comme décrit dans le présent article, la famine de sérum ou la réduction de la concentration de sérum dans le milieu de culture est une autre manière de réduire les effets de la prolifération cellulaire. La famine de sérum est employée dans plusieurs autres essais cellulaires. Il peut induire un nombre élevé de réponses cellulaires, ce qui pourrait interférer avec les résultats obtenus et les interprétations21. La famine de sérum doit être soigneusement appliquée et son effet sur la viabilité de cellules devrait être évalué avant de commencer l'expérience. Dans le présent article, la migration des fibroblastes primaires en présence de sérum de 10 % ou de 1 % est indiquée (voir la figure 1b). Comme prévu, le taux de migration est plus lent à de faibles concentrations de sérum. Cependant, les fibroblastes déficients de 3 migrent plus rapidement que les cellules de type sauvage aux deux conditions; concentration de sérum faible et élevée.
L'analyse de guérison de blessure de peau utilisant la chambre de skinfold dorsal est une procédure relativement simple pour étudier la fermeture de blessure de peau au fil du temps in vivo. L'implantation de la chambre de pli de peau dorsal de titane a été décrite pour la première fois chez des rats22. Sorg et coll. ont utilisé cette technique chez les souris glaçantes SKH1-hr pour suivre la cicatrisation des plaies et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins9. Le modèle de chambre skinfold décrit dans cet article a beaucoup d'avantages au-dessus des essais classiques de guérison de blessure exécutés sur la peau dorsal, sur l'oreille23 ou le membre arrière7 des souris. La couverture de la zone de la plaie avec un bordereau en verre prévient les infections et les traumatismes tissulaires et limite la dessiccation de la plaie. La chambre d'observation recouverte de la glissière de verre peut être ouverte à tout moment pendant le processus de guérison, permettant l'application topique de différents composés pharmacologiquement actifs (par exemple, siRNA pour Cav-3 comme solutions ou onguents) et la chambre peut être fermé à nouveau. Le processus de guérison des plaies de peau de Murine est composé de la contraction et de l'épithélialization24. L'utilisation de la chambre de pli de peau dorsal chez les souris minimise la contraction de peau et donne la possibilité d'étudier principalement le processus d'épithélialization. Il fournit également une fenêtre claire pour observer et surveiller le processus de fermeture de blessure. Un inconvénient de la chambre en titane est que la souris doit porter la chambre en titane, qui a un poids d'environ 2 g (7,7% du poids d'une souris de 26 g), pendant 14 jours. Cela pourrait causer un certain inconfort pour la souris, bien qu'il semble que les souris tolèrent bien cette chambre et ils sont confortables et peuvent facilement atteindre la nourriture et l'eau. Le modèle de guérison de blessure de peau présenté dans cet article peut étudier seulement une blessure par souris. D'autres méthodes publiées25,26 suggèrent d'appliquer deux plaies par souris qui réduirait le nombre d'animaux nécessaires pour une étude. Il est d'une grande importance de créer une plaie circulaire de taille similaire pour toutes les souris pour obtenir des informations objectives ainsi que des résultats fiables et reproductibles. Pour prendre des images des blessures au fil du temps, des souris ont été fixées sur un refileur de souris, placées sur une scène, et la chambre de skinfold est placée sous un stéréomicroscope. L'utilisation de la formatrice aide à éviter l'anesthésie et à minimiser le stress chez les souris. Les souris peuvent être sacrifiées et les tissus de la zone blessée peuvent être explantés et recueillis à différentes étapes du processus de guérison (soit après la guérison complète ou à des moments plus tôt) pour l'analyse histologique, la collecte d'ARN ou la biochimie des protéines.
En résumé, nous avons montré deux techniques, un test de grattage in vitro à l'aide de fibroblastes primaires et un test de guérison des plaies de peau in vivo chez la souris. Dans les deux essais, la cicatrisation des plaies/fermeture de l'écart est augmentée en l'absence de la sous-unité Cav-3 des canaux de calcium à barrière de tension. Comme pour les souris ou les cellules de type sauvage et de Cav3, les deux essais pourraient bien être corrélés en l'absence ou la présence d'autres molécules spécifiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions la Dre Petra Weissgerber et l'Unité Transgène de l'établissement animalier SPF (projet P2 de la SFB 894) de la Faculté de médecine et l'établissement animalier de l'Institut de chirurgie clinique et expérimentale de la Faculté de médecine de l'Université de Sarre, à Hombourg. Nous remercions le Dr Andreas Beck pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projet A3 à A.B. et V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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