Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.
Abstract
A cicatrização de feridas cutâneas prejudicada é uma grande preocupação para os pacientes que sofrem de diabetes e para pessoas idosas, e há a necessidade de um tratamento eficaz. Abordagens in vitro e in vivo apropriadas são essenciais para a identificação de novas moléculas-alvo para tratamentos medicamentoso para melhorar o processo de cicatrização da ferida cutânea. Nós identificamos o subunidade β3 de canaletas tensão-fechados do cálcio (cavβ3) como uma molécula potencial do alvo para influenciar a cura da ferida em dois ensaios independentes, isto é, o ensaio in vitro da migração do risco e o modelo in vivo da câmara de dobra cutânea dorsal. Os fibroblastos embrionários do rato preliminar (MEFs) isolados aguda do selvagem-tipo (WT) e os ratos 3-deficientes de CAVβ(CAVβ3 ko) ou os fibroblasto isolados aguda dos ratos do WT trataram com o siRNA para baixo-regulam a expressão do gene Cacnb3 , foi utilizada a codificação CAVβ3. Um risco foi aplicado em uma monocamada de pilha confluente e o fechamento da abertura foi seguido tomando imagens microscópicas em pontos definidos do tempo até o repovoamento completo da abertura pelas pilhas migrando. Essas imagens foram analisadas e a taxa de migração da célula foi determinada para cada condição. Em um ensaio in vivo, implantamos uma câmara de dobra cutânea dorsal nos camundongos WT e Cavβ3 KO, aplicou uma ferida circular definida de 2 mm de diâmetro, cobriu a ferida com uma lamínula de vidro para protegê-la de infecções e dessecações, e monitorou o fechamento da ferida macroscópica ao longo do tempo. O fechamento da ferida era significativamente mais rápido em Cacnb3-ratos gene-deficientes. Como os resultados dos ensaios in vivo e in vitro se correlacionam bem, o ensaio in vitro pode ser útil para a triagem de alta produtividade antes de validar os acertos in vitro pelo modelo in vivo de cicatrização de feridas. O que mostramos aqui para camundongos ou células com deficiência de tipo selvagem e CAVβ3 pode também ser aplicável para moléculas específicas que não sejam Cavβ3.
Introduction
A cicatrização da ferida cutânea começa imediatamente após a lesão cutânea, a fim de restaurar a integridade da pele e proteger o organismo contra infecções. O processo de cicatrização de feridas atravessa quatro fases de sobreposição; coagulação, inflamação, nova formação tecidual e remodelação tecidual1. A migração celular é crucial durante essas fases. Células inflamatórias, células imunes, queratinócitos, células endoteliais e fibroblastos são ativados em diferentes pontos temporais e invadem a área da ferida2. Métodos para investigar a cicatrização de feridas in vitro e in vivo são de grande interesse não só para compreender os mecanismos subjacentes, mas também para testar novas drogas e desenvolver novas estratégias visando melhorar e acelerar a cicatrização da ferida cutânea.
Para monitorar e analisar a migração de células, o ensaio de migração de arranhões pode ser usado. É frequentemente referido como ensaio de cicatrização de feridas in vitro. Este método requer um recurso de cultura de célula3. É um procedimento simples, não há nenhuma necessidade de equipamento high-end e o ensaio pode ser executado em a maioria de laboratórios da biologia da pilha. Neste ensaio, uma área livre de células é criada pelo rompimento mecânico de uma monocamada de células confluentes, preferencialmente células epiteliais ou endoteliais ou fibroblastos. As células na borda do arranhão migrarão para preencher novamente a lacuna criada. A quantificação da área livre de células decrescentes ao longo do tempo assemelha-se à taxa de migração e indica o tempo, que as células precisam para fechar a lacuna. Para esta finalidade, os investigadores podem usar pilhas aguda isoladas dos ratos ou dos ratos do WT que faltam um gene do interesse4, ou pilhas imortalized disponíveis dos repositórios de pilha de confiança. O ensaio de risco permite estudar a influência de compostos farmacologicamente ativos ou o efeito de cDNAs transfected ou siRNAs na migração celular.
In vivo, cicatrização de feridas é um processo fisiológico complexo, exigindo diferentes tipos de células, incluindo queratinócitos, células inflamatórias, fibroblastos, células imunes e células endoteliais, a fim de restaurar a integridade física da pele o mais rápido possível1 . Diferentes métodos para estudar in vivo cicatrização de feridas foram desenvolvidos e utilizados nos últimos5,6,8. A câmara de dobras cutâneas dorsal descrita neste artigo foi utilizada anteriormente para ensaios de cicatrização de feridas9. É usado como uma preparação de câmara de dobra cutânea dorsal modificada para camundongos. O modelo de câmara de dobras cutâneas modificada tem várias vantagens. 1) minimiza a contração da pele, que impede observar o processo healing da ferida e pôde influenciar o reparo da ferida nos ratos. 2) esta câmara faz uso de cobrir a ferida com uma lamínula de vidro, reduzindo as infecções do tecido e dessecação, o que poderia atrasar o processo de cicatrização. 3) o fluxo sanguíneo e a vascularização podem ser monitorados diretamente. 4) permite a aplicação tópica repetitiva de compostos farmacologicamente ativos e reagentes, a fim de tratar a ferida e acelerar a cicatrização9,10.
Identificamos a subunidade β3 de canais de cálcio de alta voltagem (Cavβ3) como uma molécula alvo potencial para influenciar a cicatrização de feridas cutâneas utilizando dois protocolos independentes, ou seja, o ensaio in vitro de migração de arranhões e o modelo de câmara cutânea dorsal in vivo. Para o ensaio in vitro, utilizamos fibroblastos primários, estas células expressam o gene Cacnb3 que codifica a proteína cavβ3, mas a falta de CA2 + afluxo despolarization-induzida ou tensão-dependente CA2 + correntes. Nós descrevemos uma função nova de Cavβ3 nestes fibroblasto: o Cavβ3 liga-se ao inositol 1, 4, 5-receptor do trisphosphate (IP3R) e liberação do cálcio das limitações do reticulum endoplasmático. O apagamento do gene Cacnb3 nos ratos conduz ao aumento da sensibilidade do IP3R para IP3, migração aumentada da pilha e reparo aumentado da ferida da pele4.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados e realizados de acordo com os regulamentos de ética e os comitês de bem-estar animal da Saarland e da Universidade de Saarland.
1 cultura de pilha preliminar e transfection do siRNA
Nota: no método descrito, os fibroblastos primários são usados. Estas pilhas desempenham um papel crucial na cicatrização de feridas e remodelação tecidual11. Neste experimento, o gene Cacnb3 , codificando a subunidade Cavβ3 de canais de cálcio de alta tensão-gated12 foi regulado para baixo, mostrando assim seu papel na migração celular in vitro e reparo da ferida cutânea in vivo4.
- Preparação de siRNA: antes de reconstituir as siRNAs, centrifugue brevemente os tubos para garantir que o conteúdo está na parte inferior. Reconstituir as siRNAs em 100 μL de tampão livre de RNase (acetato de potássio 100 mM, 30 mM HEPES, pH 7,5) fornecido pelo fabricante a uma concentração de 20 μM. Esta é uma solução de estoque de siRNAs.
- Aliquot esta solução de estoque em 10 μL por tubo (concentração de 20 μM) e armazene a-20 ° c até o uso.
- Usando um marcador permanente ultrafino, marque uma placa de 6 poços com uma linha horizontal na parte inferior de cada poço, a fim de ser capaz de identificar sempre a mesma região de risco de interesse e seguir seu fechamento.
Nota: as placas da cultura 6-well foram usadas neste ensaio porque são grandes bastante, para fornecer bastante espaço e flexibilidade para aplicar um risco consistente, reprodutível e vertical usando uma ponta da pipeta de 200 μL através do monocamada da pilha. Se um número limitado de células estiver disponível, uma alternativa e provavelmente a maneira rentável seria usar placas de cultura de 12 ou 24 poços. - Fibroblastos primários de placa, isolados do tipo selvagem e β3-deficientes camundongos4, em uma placa de 6 poços em uma densidade de 5 x 105 células/bem na presença de 2 ml Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FCS).
Nota: 5 x 105 células por poço foi estabelecida para 6-bem placa de cultura e para o mouse primário fibroblastos. Os testes podem ser necessários se usando placas de cultura de células de 12 ou 24 poços ou outros tipos de células, que podem ser diferentes em tamanho. As células devem ser tratadas em um ambiente estéril, como armários de segurança biológica classe II. - Rotule a placa de 6 poços com o tipo de célula, o genótipo e a data.
- Mova a placa 6-well na incubadora da cultura da pilha e mantenha pilhas em 37 ° c e em 5% CO2 para 24 h.
- No dia seguinte, retire a placa da incubadora, aspirar o meio de cultura celular para fora do poço, descartá-lo e substituí-lo com 2,25 mL de meio de cultura fresca, adicionando-o cuidadosamente contra a parede do poço.
- A fim de transfecção fibroblastos com siRNAs, use um reagente de transfecção baseada em lipídios, conforme recomendado pelo fabricante.
- Para cada transfection, rotule dois tubos do microcentrifugador. Na primeira, adicionar 9 μL do reagente de transfecção e diluir com 150 μL de meio sérico reduzido. No segundo tubo, adicione 1,5 μL de siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA mexidos como um controle negativo) e dilui-o com 150 μL de meio sérico reduzido.
- Adicione o siRNA diluído no tubo contendo reagente de transfecção diluído e Vortex para 2 s. Incubar a mistura por 5 min a 21 ° c.
- Rotule poços com Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA mexidos. Adicionar 250 μL da mistura de reagente de siRNA-transfecção à célula.
- Coloc a placa da cultura 6-well de volta na incubadora e mantenha pilhas em 37 ° c e em 5% CO2 para 72 h.
- A fim verificar a eficiência do silenciamento do gene Cacnb3 , coletar pilhas transfected e executar a análise do immunoblot como descrito previamente4.
2. ensaio de cicatrização de feridas in vitro (ensaio de migração de riscos)
- Tome a placa da cultura da pilha fora da incubadora e examine as pilhas o microscópio usando o objetivo 10x. Comece com o teste do risco somente quando alcangaram a confluência de 100%.
Nota: para a exatidão e reprodutibilidade, a confluência de 100% é um fator obrigatório para iniciar o ensaio de migração de arranhões. Conseqüentemente, é importante semear o mesmo número de pilhas nos poços da cultura, examinar cada poço para o confluência e aplicar o risco no mesmo ponto do tempo (confluência do dia 0). Esperando por mais tempo depois que as células atingem 100% confluência pode evocar respostas diferentes. - Uma vez que a célula atinge 100% confluência, aspirar o meio de cultura fora do poço e descartá-lo.
- Use uma ponta de pipeta (200 μL) para criar manualmente um risco vertical para a linha horizontal marcada na parte inferior do poço, através da monocamada de células confluentes no meio do poço.
- Enxague cada poço duas vezes com 2 mL de soro fisiológico tamponado (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2po4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) para remover os fatores liberados de células danificadas, células soltas e detritos da área riscada. Adicionar 2 mL de PBS cuidadosamente contra a parede do poço para evitar a desanexação de células da cultura da célula bem.
- Adicione 2 mL de meio de cultura celular contendo um soro de 10% ou 1% de soro com cuidado para cada poço.
Nota: recomenda-se realizar o teste do risco o soro de 10% e o soro de 1% para confirmar que o efeito observado está causado pela proliferação e pela migração de pilha ou pela migração da pilha somente. - Mova a placa para o estágio do microscópio e Capture imagens de campo brilhantes da área livre de células (duas áreas por poço) imediatamente após arranhar (t = 0h) a uma ampliação de 10x usando um microscópio de luz. Para a imagem sempre a mesma região do zero, use a linha horizontal, que foi preparada na etapa (1,3), e tomar uma imagem acima desta linha e uma imagem abaixo desta linha. Salvar imagens como TIFF ou JPEG.
- Porque o estágio do microscópio não mantem a condição de crescimento da pilha, mova a placa de volta à incubadora da cultura da pilha e mantenha as pilhas em 37 ° c e em 5% CO2.
- Após 6, 10 e 30 h, mova a placa para o estágio do microscópio novamente e capture as imagens da mesma maneira descrita na etapa 2,6.
Nota: estes pontos temporais foram estabelecidos para o procedimento descrito e para os fibroblastos primários. Durante o primeiro experimento piloto, mais pontos de tempo foram testados para ver o quão rápido os fibroblastos repovoam a lacuna. Embora 0, 6, 10 e 30 h sejam pontos de tempo de partida razoáveis, os investigadores devem otimizar e estabelecer os pontos de tempo apropriados para cada aplicação e para cada tipo de célula. A alternativa mais precisa, se disponível, seria usar a microscopia de lapso de tempo. - Usando o ImageJ13, quantifique a área sem célula inicial (100%) e a área remanescente após 6, 10 e 30 h (Figura 1). A porcentagem da área de rascunho repovoada por células migratórias é calculada em relação à área inicial do rascunho.
3. análise da área de arranhão
- Abra o software ImageJ13.
- Carregue a primeira imagem como JPEG (por exemplo, imagens RGB de 24 bits 1360x1024) soltando a imagem na barra de menus do ImageJ.
- Selecione o botão de seleções da mão livre e marque a área sem célula
- Clique em analisar e selecione Measure. Aparecerá uma janela com os resultados que contém o valor da área.
- Transfira esse valor para uma planilha de análise.
- Repita os passos 3.2-3.5 para cada imagem do ponto de tempo 0 h e, em seguida, iniciar novamente para a próxima vez pontos 6, 10 e 30 h.
- Calcule a porcentagem de área de rascunho repovoada migrando células após 6, 10 e 30 h para cada arranhão usando a seguinte equação:
a = área livre de células do zero inicial, b = área livre de células após 6 h - Calcule a média e o erro padrão da média (M.E.V.) para a porcentagem de área de rascunho repovoada pela migração de células após 6 h. mostrar dados como um gráfico de barras de colunas ou uma plotagem de dispersão.
4. ensaio de cicatrização da ferida cutânea in vivo
Nota: C57BL/6 machos selvagens (8-12 semanas de idade com 22-26 g de peso corporal) e camundongos com deficiência de Cavβ3 como controle são utilizados para este estudo.
- Um dia antes de iniciar o experimento, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, parafusos, porcas e quadros de titânio para ser usado para a preparação da câmara de dobras cutâneas.
Nota: o quadro de titânio é composto por duas metades complementares simétricas e tem uma janela de observação circular onde a ferida será aplicada e seguida por microscopia (ver Figura 2a). - Anestesie um rato de tipo selvagem ou β3 deficiente (22-26 g de peso corporal) por injecção intraperitoneal (i.p.) de 0,1 mL de soro fisiológico/10 g de peso corporal contendo uma mistura de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) e xilazina (25 mg/kg de peso corporal). Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a uma pitada de dedo do pé.
Nota: esta injecção dá cerca de 30 min de anestesia cirúrgica e a profundidade da anestesia deve ser controlada através do procedimento cirúrgico, verificando os reflexos do rato. - Para evitar a secura ou o dano dos olhos, aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos e repita a aplicação se necessário.
- Cuidadosamente raspar o dorso do rato, usando um barbeador elétrico seguido pela aplicação de um creme de depilação para a área raspada para remover qualquer cabelo restante. Tome cuidado para não ferir a pele do rato. Deixe o creme de depilação por cerca de 10 min para remover completamente todo o cabelo.
- Prepare a câmara de titânio, tomando uma parte do quadro de câmara de titânio simétrica e fixar os parafusos de conexão com porcas de um lado. Estas porcas servirão como espaçador para manter 400-500 μm entre as duas partes simétricas da câmara para evitar a compressão dos vasos sanguíneos na pele.
- Retire o creme da parte de trás do rato e limpe a região sem pêlos com água quente (35-37 ° c) da torneira.
- Certifique-se de que o lugar para realizar a cirurgia é limpo, morno (37 ° c) e humidificado.
- Desinfete a área sem pêlos do rato com desinfetante de pele. Tome uma dobra da pele traseira do rato na frente de uma fonte luminosa e posicione a linha média da camada dobro da pele onde a câmara Titanium será implantada. Depois disso, fixar a dobra cutânea com uma sutura de polipropileno cranialmente e caudalmente e aperte o outro lado da sutura em uma cremalheira de metal para levantar a pele dobrada do mouse. Ajuste a altura do rack para permitir que o mouse se sente confortavelmente.
- Implante a câmara de titânio na dobra da pele traseira do mouse de forma a sanduíche a camada de pele dorsal dobrada entre as duas metades simétricas do quadro de titânio. Prenda a primeira metade do quadro de titânio por suturas de polipropileno em sua borda superior para a parte de trás da dobra cutânea dorsal.
Nota: no quadro de titânio, há 8 furos na borda superior (Figura 2a) e a pele dobrada deve ser bem fixada por suturas de polipropileno em cada um dos oito furos. - Antes de passar para a próxima etapa, verifique os reflexos do mouse para se certificar de que a profundidade da anestesia é mantida.
- Na base da dobra cutânea, passe os dois parafusos de conexão, anexados à primeira metade da câmara de titânio, para penetrar a dobra cutânea de volta para a frente. Faça pequenas incisões na pele (usando tesouras finas) para ajudar a penetração suave dos parafusos de conexão.
- Retire o mouse do rack e coloque-o em uma posição lateral. Coloque a segunda metade complementar da câmara de titânio em cima dos 3 parafusos de ligação (ver Figura 2a) e aplique uma ligeira pressão com os dedos para passar estes parafusos através da segunda metade da armação de titânio. Em seguida, fixar ambas as partes simétricas com porcas de aço inoxidável.
- Preste atenção ao aperto dos parafusos nesta etapa, uma vez que pode se destacar, se ele é muito solto. Em contraste, se for muito apertado, ele irá espremer a dobra cutânea, reduzir o fluxo sanguíneo e pode levar ao comprometimento tecidual e necrose.
Nota: as porcas preparadas na etapa 4,5 servem como espaçador para manter uma distância de 400-500 μm entre as duas metades simétricas da câmara de titânio. As porcas devem ser apertadas até que uma ligeira resistência seja sentida. - Corte a parte restante dos parafusos usando alicates.
Nota: é necessário nesta etapa usar vidros de segurança do laboratório para a proteção de olho caso que o parafuso sai da maneira errada. - Marcar a área da ferida por um perfurador de biópsia padronizado (2 mm de diâmetro), no centro da pele dentro da janela de observação (ver Figura 2a) da câmara de dobras cutâneas, a fim de garantir tamanhos de feridas reprodutíveis.
- Usando o fórceps fino e as tesouras, crie uma ferida circular dentro da área marcada removendo a pele completa com epiderme e derma. A área final da ferida será em torno de 3,5-4,5 mm2, ver Figura 2b. Limpe a ferida com 0,5 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl, 37 ° c).
- Cubra a ferida com uma lamínula de vidro e fixe esta lamínula de vidro com um anel de pressão usando o alicate de anel de pressão na câmara de titânio.
- Imediatamente após o término do procedimento cirúrgico, coloque o mouse sobre o estágio de imagem de um estereomicroscópio equipado com uma câmera e tire imagens (dia 0) iluminação. Use a ampliação de 40X e salve as imagens para futura análise off-line.
Observação: o investigador deve examinar as imagens imediatamente após a captura para garantir que a qualidade seja suficiente para futuras análises off-line. A preparação da câmara de dobras cutâneas e o desempenho da ferida cutânea levam cerca de 30 minutos. - Mantenha o rato em um lugar morno durante a recuperação da anestesia para pelo menos 2 h. Depois disso, os ratos de transferência em gaiolas individuais de volta para a instalação animal (12 h de luz/ciclo escuro) e certifique-se que os ratos têm acesso a alimentos e água.
- Três dias post-Wounding colocar o mouse em um mouse-contenção e fixar a restrição em cima do estágio de imagem.
- Coloque o palco um estereomicroscópio equipado com uma câmera. Tirar imagens iluminação com ampliação de 40x, gravar todas as imagens e salvá-los para futuras análises off-line
- Repita as etapas 4,20 e 4,21 novamente no dia 6, 10 e dia 14 post-Wounding.
- Use as imagens da ferida, para análise off-line no ImageJ13. A área da ferida no dia 0 é considerada como 100% e o fechamento da ferida ao longo do tempo é plotado em relação à área da ferida inicial. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2c, d.
- Calcule a porcentagem (%) da área da ferida em cada ponto de tempo usando a seguinte equação:
x: ponto de tempo (dia 0, 3, 10 ou 14), a: área da ferida no dia 0, b: área da ferida no ponto de tempo x
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Representative Results
O teste do risco foi executado em um monocamada da pilha confluente do selvagem-tipo e β3-deficientes mefs (Figura 1c). Depois de executar o "Scratch" usando uma ponta de pipeta de 200 μL, as células de ambos os genótipos migram para a área de arranhão e fecham a lacuna. As imagens foram realizadas após 6, 10 e 30 h (Figura 1a). A migração celular foi quantificada como percentual (%) da área de rascunho repovoada migrando células 6 horas após a execução do arranhão. A migração de MEFs com deficiência de Cavβ3 fechou a área de arranhão significativamente mais cedo do que MEFs de camundongos de tipo selvagem (Figura 1a, b). Para excluir qualquer efeito da proliferação celular, o ensaio de migração de arranhões foi realizado na presença de 10% ou 1% de FCS. Em 10% FCS ambos os processos estão atuais, a proliferação e a migração de pilha, visto que em 1% a proliferação de pilha de FCS é minimizada. Os fibroblastos em 10% (Figura 1b, esquerda) ou 1% FCS (Figura 1b, direita) mostraram um padrão de migração semelhante, descartando a possibilidade de contribuição da proliferação celular para o fenótipo observado por cavβ3. Os MEFs deficientes de cavβ3 fecharam a abertura significativamente mais cedo do que o selvagem-tipo MEFs ambas as circunstâncias. Para confirmar o efeito de Cavβ3-dependent observado em fibroblastos β3-deficientes, o selvagem-tipo fibroblastos foi transfected com o siRNA para baixo-regula a proteína de Cavβ3 (Figura 1e). Como controle para o baixo-regulamento, os immunoblots foram executados para confirmar a eficiência do tratamento de siRNA. Foram utilizados dois siRNAs Cacnb3 específicos independentes (SiRNA1 e siRNA2) e um siRNA codificado (como controle). Os fibroblastos tratados com os siRNAs Cacnb3-específicos comportam-se como fibroblastos β3-deficientes (Figura 1d), ou seja, a migração é aumentada na ausência de proteína cavβ3 (Figura 1e).
In vivo, a câmara de dobra cutânea dorsal foi implantada (Figura 2a, b) e uma ferida circular definida de 2 mm de diâmetro foi gerada na parte traseira raspada (Figura 2b) dos camundongos com deficiência de tipo selvagem e cavβ3 (8 animais por genótipo, 8-12 semanas de idade e 22-26 g de peso). A ferida foi realizada removendo-se a pele completa com epiderme e derme. Para comparar a cicatrização da ferida cutânea entre os dois genótipos, a área da ferida na câmara da prega cutânea foi fotografada diretamente após o ferimento (dia 0) e, em seguida, foram tiradas fotos de 3, 6, 10 e 14 dias após a lesão (Figura 2c). Os tamanhos das feridas foram medidos nestas imagens digitais e a área da ferida em um determinado dia foi expressa como a porcentagem (%) da área da ferida inicial (Figura 2d). O fechamento da ferida é aumentado em camundongos β3-deficientes em comparação com controles do tipo selvagem. Em contraste com o selvagem-tipo, a ferida em β3-deficientes camundongos foi quase completamente fechado já após 10 dias. No dia 14 pós-ferimento, as feridas foram completamente fechadas em ambos os genótipos (Figura 2c, d).
Figura 1 : Ensaio in vitro de migração de riscos. (a) imagens representativas de culturas do tipo selvagem (WT, Left) e Cavβ3 KO (β3 ko, direita) fibroblastos embrionários do rato primário (mefs) imediatamente, 6, 10 e 30 h após a realização de um arranhão. As imagens foram convertidas em escala de cinza de 8 bits, e o contraste, bem como o brilho, foram adaptados para visualizar a área livre de células de forma maximamente. A análise da área livre de células (% da área de rascunho repovoada por células migratórias) foi realizada nas imagens RGB de 24 bits originais. (b) gráficos de barras mostrando porcentagens (%) da área de arranhão repovoada por células migratórias após 6 horas, quer na presença de soro bovino fetal de alto (10%, esquerdo) ou baixo (1%, direito) (FCS) em experimentos de tipo selvagem (preto) e Cavβ3 KO (vermelho) (c) immunoblot: extratos proteicos do cérebro do tipo selvagem (50 μg por via) e fibroblastos (MEFs, 100 μg por via) utilizando um anticorpo específico Cavβ3. A proteína β3 (55 kDa) está presente no cérebro do tipo selvagem (usado como controle), e fibroblastos, mas está ausente em extratos proteicos de cérebro deficiente de Cavβ3 e fibroblastos preparados a partir de camundongos com deficiência de Cavβ3. (d) Resumo do percentual de área de risco repovoada por células migratórias após 6 horas em células do tipo selvagem tratadas com siRNA mexidos (controle, preto) ou duas siRNAs Cacnb3 independentes (siRNA1 e siRNA2, barras abertas vermelhas). (e) o immunoblot correspondente do experimento em (d). Os dados são mostrados como média ± SEM, os valores de p foram calculados utilizando-se o teste t de Student bicaudal não pareado. Os painéis a e b foram modificados a partir de [belkacemi et al., 2018]4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Cicatrização in vivo da ferida cutânea em camundongos. (a) vista lateral interior do frame titanium que mostra uma metade da câmara Titanium e da vista lateral dianteira que mostram a câmara Titanium montada com as duas metades simétricas anexadas com parafusos e porcas. (b) rato após raspar a pele dorsal e montar a câmara de dobra cutânea dorsal composta por dois quadros de titânio simétricos (o peso do quadro de titânio é de cerca de 2 g) e aplicando uma ferida circular (2 mm de diâmetro). (c) imagens da ferida diretamente após a cicatrização (dia 0) e 3, 6, 10 e 14 dias após o ferimento. O processo contínuo de fechamento da ferida, com epitelização completa, é mostrado ao longo de 14 dias em camundongos Wild-Type (WT, Top) e Cavβ3 KO (β3 KO, Bottom). (d) nos pontos de tempo indicados, a área da ferida foi determinada por meio de um programa de análise de imagem assistida por computador e plotada como uma porcentagem da área da ferida imediatamente após a lesão no dia 0 (média ± sem de n = 8, camundongos Β3 ko e o tipo selvagem correspondente ratos de controle). Os valores de P foram calculados por meio de ANOVA bidirecional e teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Os painéis c e d foram modificados a partir de [belkacemi et al., 2018]4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste manuscrito, descrevemos um ensaio in vitro e in vivo de cicatrização de feridas e correlacionamos os resultados obtidos. Para o ensaio invitro, utilizamosfibroblastos primários do camundongo4,14,15 que desempenham um papel importante na cicatrização de feridas e remodelação tecidual11. Outros tipos de células aderentes crescendo como monocamadas (por exemplo, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos) também podem ser usados. Chapeamento o mesmo número de células viáveis e saudáveis e aplicando o risco no mesmo grau de confluência é de suma importância, a fim de obter resultados precisos e reprodutíveis. É altamente recomendável realizar repetições biológicas e técnicas. No método atual, as placas de 6 poços foram usadas, mas as placas 12 ou 24-well podem igualmente ser usadas especial quando as pilhas estão disponíveis somente em números limitados. No caso do tratamento com siRNA, a análise de immunoblot após cada conjunto de experimentos é obrigatória para se certificar de que a proteína alvo é eficientemente regulada para baixo. O reagente do transfection e a janela de tempo devem ser testados e selecionados para cada tipo da pilha antes de começar com o ensaio da migração. No caso dos fibroblastos e do gene Cacnb3 , demorou 3 a 4 dias para atingir o nível desejado de regulação para baixo. Por outro lado, o ensaio de migração de arranhões precisa de tempos mais curtos (6 h a 24 h). Para evitar alta variabilidade no tamanho do arranhão, é obrigatório que o mesmo investigador aplique o arranhão para cada conjunto de experimentos, que a pressão igual é administrada pela ponta da pipeta e para manter a ferida tanto quanto possível vertical para a linha marcada no parte inferior da placa através da monocamada celular. A aplicação de um risco mecânico através do monocamada da pilha conduz à liberação de fatores celulares diferentes (por exemplo, ATP) das pilhas danificadas no espaço extracelular. Estes fatores induziriam a sinalização parácrina que inclui o CA2 +-sinalização nas pilhas vizinhas, que por sua vez influenciaria respostas celulares16. Para evitar esses efeitos, inserções de cultura pode ser usado para células de chapeamento e após a remoção dessas inserções de uma lacuna livre de células é criado sem danificar as células vizinhas17. Para a triagem de alta taxa de transferência, os investigadores podem considerar o uso de instrumentos disponíveis no mercado para criar arranhões reprodutíveis e consistentes em placas 96-well. Para acompanhar a cinética de migração de células continuamente ao longo do tempo, os usuários também podem considerar o uso de sistemas comerciais high-end para captura automática de imagem. Entretanto, os sistemas automatizados para a aplicação do risco e a captação da imagem não estão sempre disponíveis por causa dos custos elevados. Uma solução mais acessível e rentável para imagens de lapso temporal seria, por exemplo, utilizando o sistema (ATLIS: um sistema de imagem e incubação de lapso de tempo acessível) descrito por Hernandez Vera e colegas18.
Na ausência de qualquer inibidor de proliferação celular, a repovoação da lacuna no ensaio de migração de riscos é uma combinação de migração celular e proliferação celular. Para monitorar apenas a migração celular, a proliferação celular pode ser suprimida, por exemplo, pelo tratamento com Actinomycin C19 ou mitomycin c20. Concentrações adequadas desses compostos devem ser cuidadosamente determinadas e testadas para evitar os efeitos tóxicos desses compostos, o que pode afetar a viabilidade das células e sua capacidade de migrar. Como descrito no presente artigo, a inanição sérica ou a redução da concentração sérica no meio de cultura é outra forma de reduzir os efeitos da proliferação celular. A fome sérica é usada em vários outros ensaios baseados em células. Pode induzir um elevado número de respostas celulares, o que pode interferir nos resultados obtidos e nas interpretações21. A fome sérica deve ser cuidadosamente aplicada e seu efeito na viabilidade celular deve ser avaliado antes de iniciar o experimento. No presente artigo, a migração de fibroblastos primários na presença de 10% ou 1% de soro é mostrada (ver Figura 1b). A taxa de migração, como esperado, é mais lenta em baixas concentrações de soro. Entretanto, os fibroblastos β3-deficientes migram mais rapidamente do que as pilhas do selvagem-tipo em ambas as circunstâncias; concentração sérica baixa e alta.
O ensaio de cicatrização de feridas cutâneas utilizando a câmara de dobras cutâneas dorsal é um procedimento relativamente simples para investigar o fechamento da ferida cutânea ao longo do tempo in vivo. A implantação da câmara de pregas cutâneas de titânio foi descrita pela primeira vez em ratos22. SORG et al. utilizaram esta técnica em camundongos sem pêlos SKH1-HR para seguir cicatrização de feridas e formação de novos vasos sanguíneos9. O modelo de câmara de dobras cutâneas descrito neste artigo tem muitas vantagens sobre os ensaios clássicos de cicatrização de feridas realizados na pele dorsal, na orelha23 ou membro Hind7 de camundongos. Cobrindo a área da ferida com uma lamínula de vidro previne infecções e trauma tecidual e limita a dessecação da ferida. A câmara de observação coberta com a lamínula de vidro pode ser aberta a qualquer momento durante o processo de cicatrização, permitindo a aplicação tópica de diferentes compostos farmacologicamente ativos (por exemplo, siRNA para Cavβ3 como soluções ou pomadas) e a câmara pode ser fechado novamente. O processo de cicatrização de feridas cutâneas murinas é composto de contração e epitelização24. Usando a câmara de dobra cutânea dorsal em camundongos minimiza a contração da pele e dá a oportunidade de estudar principalmente o processo de epitelização. Ele fornece também uma janela clara para observar e monitorar o processo de fechamento da ferida. Uma desvantagem da câmara de titânio é que o mouse tem que transportar a câmara de titânio, que tem um peso de cerca de 2 g (7,7% do peso de um mouse de 26 g), por 14 dias. Isso pode causar algum desconforto para o mouse, embora pareça que os ratos toleram bem esta câmara e eles são confortáveis e podem facilmente chegar a comida e água. O modelo de cicatrização de feridas cutâneas apresentado neste artigo pode estudar apenas uma ferida por rato. Outros métodos publicados25,26 sugerem a aplicação de duas feridas por rato, o que reduziria o número de animais necessários para um estudo. É de grande importância para criar uma ferida circular de tamanho semelhante para todos os ratos para obter informações objetivas, bem como resultados confiáveis e reprodutíveis. Para tirar imagens das feridas ao longo do tempo, os camundongos foram fixados em um refreador de rato, colocados em um palco, e a câmara de dobras cutâneas é posicionada um estereomicroscópio. Usando o contido ajuda a evitar a anestesia e minimizar o stress para os ratos. Os camundongos podem ser sacrificados e os tecidos da área ferida podem ser explantados e coletados em diferentes estágios do processo de cicatrização (seja após a cicatrização completa ou em pontos de tempo anteriores) para análise histológica, coleta de RNA ou bioquímica protéica.
Em resumo, nós mostramos duas técnicas, um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Em ambos os ensaios, o fechamento da cicatrização/abertura da ferida é aumentado na ausência da subunidade de Cavβ3 de canais de cálcio com voltagem fechada. Assim como em camundongos ou células com deficiência de tipo selvagem e Cavβ3, ambos os ensaios podem estar bem correlacionado na ausência ou presença de outras moléculas específicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Petra Weissgerber e à unidade transgênica da instalação animal SPF (projeto P2 da SFB 894) da faculdade de medicina e da instalação animal no Instituto de cirurgia clínica e experimental da faculdade de medicina da Universidade de Saarland, Homburg. Agradecemos ao Dr. Andreas Beck pela leitura crítica do manuscrito. Este estudo foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projeto a3 para A.B. e V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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