Summary
Her præsenterer vi en protokol for en in vitro scratch assay ved hjælp af primære fibroblaster og for en in vivo hud sårheling analyse i mus. Begge assays er enkle metoder til at vurdere in vitro og in vivo sårheling.
Abstract
Nedsat kutane sårheling er et stort problem for patienter, der lider af diabetes og for ældre mennesker, og det er nødvendigt med en effektiv behandling. Passende in vitro-og in vivo-tilgange er afgørende for identifikationen af nye målmolekyler til behandling af lægemidler for at forbedre hudens sårhelings proces. Vi identificerede β3 under enheden af spændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke sårheling i to uafhængige analyser, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Primære mus embryonale fibroblaster (Mef'er), som er akut isoleret fra mus af vildtype (WT) og CAVβ3-mangelfuld (CAVβ3 ko) eller fibroblaster, som er akut isoleret fra WT-mus, som er behandlet med siRNA, til nedregulering af ekspression af Cacnb3 -genet , kodning CAVβ3, blev anvendt. En ridse blev anvendt på en flydende Cell enkeltlags og hullet lukning blev efterfulgt af at tage mikroskopiske billeder på definerede tidspunkter, indtil fuldstændig genbestand af hullet af de migrerende celler. Disse billeder blev analyseret, og celle migrerings hastigheden blev bestemt for hver betingelse. I en in vivo-analyse implanterede vi et dorsale fold kammer på WT og cavβ3 ko-mus, anvendte et defineret cirkulært sår med en diameter på 2 mm, dækkede såret med en glas dækseddel for at beskytte det mod infektioner og udtørring og overvågede den makroskopiske sårlukning over tid. Sårlukningen var signifikant hurtigere i mus med Cacnb3-gener. Da resultaterne af in vivo-og in vitro-assays korrelerer godt, kan in vitro-analysen være nyttig til screening af høj hastighed, før in vitro-hits valideres af in vivo-sårhelings modellen. Hvad vi har vist her for Wild-type og CAVβ3-mangelfulde mus eller celler kan også være gældende for specifikke molekyler bortset fra Cavβ3.
Introduction
Hudsårheling starter umiddelbart efter hudskaden for at genoprette hudens integritet og for at beskytte organismen mod infektioner. Sårhelingsprocessen går gennem fire overlappende faser; Koagulering, inflammation, ny vævs dannelse og vævs remodellering1. Celle migration er afgørende i disse faser. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endotelceller, og fibroblaster aktiveres på forskellige tidspunkter og invadere sårområdet2. Metoder til undersøgelse af sårheling in vitro og in vivo er af stor interesse ikke blot for at forstå de underliggende mekanismer, men også for at afprøve nye lægemidler og udvikle nye strategier, der har til formål at forbedre og accelerere sårheling i huden.
Hvis du vil overvåge og analysere celle migrering, kan du anvende analyse af scratch-migrering. Det er ofte omtales som in vitro sårheling assay. Denne metode kræver en cellekultur facilitet3. Det er en simpel procedure, der er ikke behov for high-end udstyr og analysen kan udføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analyse, et celle-frit område er skabt af den mekaniske afbrydelse af en flydende Cell monolayer, fortrinsvis epitelial-eller endotelekallignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten af bunden vil migrere for at genbefolke den oprettede kløft. Kvantificering af det faldende celle frie område over tid minder om overførselshastigheden og angiver den tid, som cellerne har brug for til at lukke hullet. Til dette formål, efterforskere kan bruge enten akut isolerede celler fra WT mus eller mus mangler et gen af interesse4, eller udødeliggjort celler til rådighed fra pålidelige celle depoter. Scratch assay gør det muligt at studere indflydelsen af farmakologisk aktive forbindelser eller effekten af transficeret cdnas eller sirnas på celle migration.
In vivo, sårheling er en kompleks fysiologisk proces, der kræver forskellige celletyper, herunder keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endotelceller for at genoprette hudens fysiske integritet så hurtigt som muligt1 . Forskellige metoder til at studere in vivo sårheling er blevet udviklet og anvendt i de sidste5,6,7,8. Den dorsale fold kammer beskrevet i denne artikel blev tidligere anvendt til sårheling assays9. Det bruges som en modificeret dorsale fold kammer forberedelse til mus. Den modificerede fold kammer model har flere fordele. 1) det minimerer hud sammentrækning, som forhindrer observere sårheling proces og kan påvirke sårreparation i mus. 2) dette kammer gør brug af dækker såret med en glas dækseddel, reducere vævs infektioner og udtørring, som kan forsinke helbredelsesprocessen. 3) blodgennemstrømning og vaskularisering kan overvåges direkte. 4) det giver mulighed for gentagne topikal anvendelse af farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for at behandle såret og fremskynde healing9,10.
Vi identificerede β3 under enheden af højspændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke huden sårheling ved hjælp af to uafhængige protokoller, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Til in vitro-analyse, vi brugte primære fibroblaster, disse celler udtrykker Cacnb3 genet kodning af Cavβ3 protein, men mangler depolarisering-induceret ca2 + tilstrømning eller spændings afhængige ca2 + strømme. Vi beskrev en roman funktion af cavβ3 i disse fibroblaster: cavβ3 binder sig til inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) og begrænsninger calcium frigivelse fra endoplasmatiske reticulum. Sletning af Cacnb3 genet i mus fører til øget følsomhed af IP3R for IP3, forbedret celle migration og øget sårheling reparation4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med de etiske regler og dyrevelfærds udvalgene i Saarland og Saarland Universitet.
1 primær cellekultur og siRNA transfektering
Bemærk: i den beskrevne metode anvendes primære fibroblaster. Disse celler spiller en afgørende rolle i sårheling og vævs remodeling11. I dette eksperiment, den Cacnb3 genet, kodning af Cavβ3 underenhed af højspændings-gated calcium kanaler12 var ned-reguleret, og derved viser sin rolle i celle migration in vitro og hud sårreparation i vivo4.
- Klargøring af siRNA: inden rekonstitution af Sirna'en centrifugeres rørene kortvarigt for at sikre, at indholdet er nederst. SiRNAs rekonstruere i 100 μL RNase-fri buffer (100 mM kaliumacetat, 30 mM HEPES, pH 7,5), som leveres af fabrikanten i en koncentration på 20 μM. Dette er en bestand opløsning af siRNAs.
- Aliquot denne stamopløsning på 10 μL pr. tube (20 μM koncentration) og opbevares ved-20 °C indtil brug.
- Ved hjælp af en ultrafine permanent markør, markere en 6-brønd plade med en vandret linje i bunden af hver brønd for at være i stand til altid at identificere den samme ridse region af interesse og til at følge sin lukning.
Bemærk: 6-brønd kultur plader blev brugt i denne analyse, fordi de er store nok til at give tilstrækkelig plads og fleksibilitet til at anvende en konsistent, reproducerbar og vertikal ridse ved hjælp af en 200 μL pipettespids på tværs af celle monolayer. Hvis et begrænset antal celler er til rådighed, en alternativ og sandsynligvis den omkostningseffektive måde ville være at bruge 12-eller 24-brønd kultur plader. - Plade primære fibroblaster, isoleret fra Wild-type og β3-mangelfuld mus4, i en 6-brønd plade ved en densitet på 5 x 105 celler/godt i nærværelse af 2 ml Dulbecco's modificerede EAGLE'S medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvægserum (FCS).
Bemærk: 5 x 105 celler pr. brønd er blevet etableret for 6-brønd kultur plade og for primære mus fibroblaster. Tests kan være nødvendige, hvis du bruger 12-eller 24-brønd cellekultur plader eller andre celletyper, som kan være forskellige i størrelse. Celler skal håndteres i et sterilt miljø, såsom biologiske sikkerhedskabinetter i klasse II. - Mærk 6-brønd pladen med celle typen, genotypen og datoen.
- Flyt 6-brønden pladen ind i cellen kultur inkubator og vedligeholde celler ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h.
- Næste dag, tag pladen ud af inkubator, Aspirér cellekulturen medium ud af brønden, kassér det og Udskift det med 2,25 mL frisk kulturmedium ved at tilføje det forsigtigt mod væggen af brønden.
- For at transficere fibroblaster med sirnas, anvendes et lipid-baseret transfektering reagens som anbefalet af producenten.
- For hver transfection etiket to mikrocentrifuge glas. I den første tilsættes 9 μl transfektering reagens og fortyndes med 150 μl reduceret serum medium. I det andet rør tilsættes 1,5 μl siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller røræg siRNA som en negativ kontrol) og fortyndes med 150 μl reduceret serum medium.
- Tilsæt fortyndet siRNA i røret, der indeholder fortyndet transfektering reagens og vortex i 2 s. Inkubér blandingen i 5 minutter ved 21 °c.
- Mærk brønde med enten Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller røræg siRNA. Tilsæt 250 μl af siRNA-transfection reagens blandingen dråbevis til cellerne.
- Placer 6-brønden kultur pladen tilbage i inkubator og hold cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for 72 h.
- For at kontrollere effektiviteten af Cacnb3 genhæmning, indsamle transficeret celler og udføre immunanalyse som beskrevet tidligere4.
2. in vitro sårheling assay (scratch migration assay)
- Tag cellekultur pladen ud af inkubator og Undersøg cellerne under mikroskopet ved hjælp af 10x-målet. Start med Scratch assay kun når de har nået 100% konfluency.
Bemærk: for nøjagtighed og reproducerbarhed er 100% konfluency en obligatorisk faktor for start af scratch migration assay. Derfor er det vigtigt at lægge det samme antal celler ind i kultur brøndene, at undersøge hver brønd for konflughed og at anvende bunden på samme tidspunkt (dag 0 konflughed). Venter længere efter cellerne nå 100% konfluency kan fremkalde forskellige svar. - Når cellen når 100% konfluency, Aspirér kulturmediet ud af brønden og kassér det.
- Brug en pipettespids (200 μl) til manuelt at oprette en ridse lodret til den vandrette linje markeret i bunden af brønden, på tværs af flydende Cell enkeltlags i midten af brønden.
- Skyl hver brønd to gange med 2 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2po4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) for at fjerne de frigivne faktorer fra beskadigede celler, løse celler og snavs fra det ridsede område. Tilsæt 2 mL PBS forsigtigt mod væggen af brønden for at undgå at løsne celler fra cellekulturen godt.
- Tilsæt 2 mL cellekulturmedium, der indeholder enten 10% serum eller 1% serum omhyggeligt til hver brønd.
Bemærk: det anbefales at udføre scratch assay under 10% serum og under 1% serum for at bekræfte, at den observerede effekt er forårsaget af celle spredning og migration eller ved celle migration kun. - Flyt pladen til mikroskop scenen og Fang lyse feltbilleder af det celle frie område (to områder pr. brønd) umiddelbart efter ridser (t = 0h) ved en 10x forstørrelse ved hjælp af et let mikroskop. At billedet altid den samme region i bunden, skal du bruge den vandrette linje, som blev udarbejdet i trin (1,3), og tage et billede over denne linje og et billede under denne linje. Gem billeder som TIFF eller JPEG.
- Da mikroskopet ikke bevarer cellevækst betingelsen, skal du flytte pladen tilbage til celle kulturinkubatoren og holde cellerne ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter 6, 10 og 30 timer skal du flytte pladen til mikroskop scenen igen og optage billeder på samme måde som beskrevet i trin 2,6.
Bemærk: disse tidspunkter er fastlagt for den beskrevne procedure og for primære fibroblaster. Under det første piloteksperiment blev der testet flere tidspunkter for at se, hvor hurtigt fibroblasterne genbefolker hullet. Selv om 0, 6, 10 og 30 timer er rimelige starttids punkter, bør investigatorerne optimere og fastsætte passende tidspunkter for hver applikation og for hver celletype. Den mere præcise alternativ, hvis det er muligt, ville være at bruge time-lapse mikroskopi. - Ved hjælp af ImageJ13kvantificeres det indledende celle frie område (100%) og det resterende område efter 6, 10 og 30 timer (figur 1). Den procentdel af arbejdsområdet, der er genbefolket ved at overflytte celler, beregnes derefter i forhold til det oprindelige arbejdsområde.
3. analyse af arbejdsområdet
- Åbn ImageJ software13.
- Upload det første billede som JPEG (f. eks. 24-bit RGB-billeder 1360x1024) ved at slippe billedet ind i ImageJ menulinjen.
- Vælg knappen frihånds valg , og Marker det celle frie område
- Klik på Analysér og vælg mål. Et vindue med resultaterne vises med område værdien.
- Overfør denne værdi til et analyse regneark.
- Gentag trin 3.2-3.5 for hvert billede fra tidspunkt 0 h og derefter starte igen til næste gang punkt 6, 10 og 30 h.
- Beregn procentdelen af arbejdsområdet, som er genbefolket ved at overflytte celler efter 6, 10 og 30 timer for hver ridse ved hjælp af følgende ligning:
a = celle frit område af den oprindelige ridse, b = celle frit område efter 6 h - Beregn middelværdien og standardfejlen for middelværdien (S.E.M.) for den procentdel af arbejdsområdet, der er genbefolket ved at overflytte celler efter 6 timer. Vis data som en søjle bjælke graf eller et punktplot.
4. analyse af hudsårheling in vivo
Bemærk: C57BL/6 vild-type hanner (8-12 uger gammel med 22-26 g legemsvægt) og Cavβ3-mangelfulde mus som en kontrol anvendes til denne undersøgelse.
- En dag før forsøget påbegyndes, autoklave alle de kirurgiske instrumenter, skruer, møtrikker og Titanium rammer, der skal anvendes til fold kammer forberedelse.
Bemærk: Titanium rammen er sammensat af to symmetriske komplementære halvdele, og den har et cirkulært observationsvindue, hvor såret vil blive anvendt og efterfulgt af mikroskopi (Se figur 2a). - Bedøvelse en Wild-type eller β3-mangelfuld mus (22-26 g legemsvægt) af intraperitoneal (IP) injektion af 0,1 mL saltvand/10 g legemsvægt indeholdende en blanding af ketamin (75 mg/kg legemsvægt) og xylazin (25 mg/kg legemsvægt). Kontroller dybden af anæstesi ved manglende reaktion på en tå knivspids.
Bemærk: denne injektion giver omkring 30 min kirurgisk anæstesi og dybden af anæstesi skal styres gennem den kirurgiske procedure, ved at kontrollere reflekser af musen. - For at undgå tørhed eller beskadigelse af øjnene, anvende oftalmisk salve til begge øjne og gentage ansøgningen, hvis det er nødvendigt.
- Barberer forsigtigt musen dorsum, ved hjælp af en elektrisk shaveren efterfulgt af anvendelsen af en hårfjerning creme til det barberede område for at fjerne eventuelle resterende hår. Pas på ikke at beskadige muse huden. Forlad hårfjerning creme i omkring 10 minutter til helt at fjerne alt hår.
- Forbered titanium kammeret ved at tage en del af den symmetriske titanium kammer ramme og fastgør tilslutnings skruerne med møtrikker på den ene side. Disse nødder vil fungere som et afstandsstykke til at holde 400-500 μm mellem de to symmetriske dele af kammeret for at undgå komprimering af blodkar i huden.
- Fjern cremen fra bagsiden af musen og Rengør den hårfri region med varmt (35-37 °C) ledningsvand.
- Sørg for, at stedet for at udføre kirurgi er rent, varmt (37 °C) og befuret.
- Desinficer det hårfrie område af musen med huddesinfektions middel. Tag en fold af den bageste hud af musen foran en lyskilde og Placer den midterste linje af det dobbelte lag af huden, hvor titanium kammer vil blive implanteret. Derefter Fastgør fold med en polypropylen sutur cranially og caudally og stram den anden side af suturen på et metalstativ for at løfte musen foldet hud. Juster højden på stativet, så musen kan sidde komfortabelt.
- Implantat titanium kammeret i folden af bagsiden hud af musen på en måde at sandwich den foldede dorsale hudlag mellem de to symmetriske halvdele af titanium rammen. Fastgør den første halvdel af titanium rammen med polypropylen suturer på sin overlegne kant på bagsiden af rygskindet.
Bemærk: på titanium rammen er der 8 huller på den overlegne kant (figur 2a), og den foldede hud skal være godt fastgjort af polypropylen suturer på hver af de otte huller. - Før du flytter til det næste trin, kontrollere reflekser af musen for at sikre, at dybden af anæstesi vedligeholdes.
- Ved bunden af fold, passere de to tilslutnings skruer, der er fastgjort til første halvdel af titanium kammer, at trænge ind i fold fra tilbage til forsiden. Lav små snit på huden (ved hjælp af fine saks) for at hjælpe glat penetration af tilslutnings skruerne.
- Frigør musen fra stativet og Placer den på en lateral position. Sæt den anden komplementære halvdel af titanium kammeret oven på de 3 tilslutnings skruer (Se figur 2a) og Påfør let tryk med fingrene for at passere disse skruer gennem anden halvdel af titanium rammen. Fastgør derefter begge symmetriske dele med møtrikker af rustfrit stål.
- Vær opmærksom på stramningen af skruerne på dette trin, da det kan løsne sig, hvis det er for løs. I modsætning hertil, hvis det er for stramt, vil det klemme skinfold, reducere blodgennemstrømningen og kan føre til vævs svækkelse og nekrose.
Bemærk: nødder fremstillet i trin 4,5 tjener som afstandsstykke til at holde en afstand på 400-500 μm mellem de to symmetriske halvdele i titanium kammeret. Møtrikkerne skal strammes, indtil der mærkes en svag modstand. - Skær den resterende del af skruerne ved hjælp af tænger.
Bemærk: det er nødvendigt på dette trin at bruge laboratorie sikkerhedsbriller til Øjenværn, hvis skruen kommer ud af den forkerte vej. - Marker sårområdet ved hjælp af en standardiseret biopsi punch (2 mm i diameter), i midten af huden i observationsvinduet (Se figur 2a) i fold kammeret for at sikre reproducerbare sårstørrelser.
- Ved at bruge fine pincet og saks, oprette en cirkulær sår i det markerede område ved at fjerne den komplette hud med epidermis og dermis. Det endelige sårområde vil være omkring 3,5-4,5 mm2, se figur 2b. Såret rengøres med 0,5 mL sterilt saltvand (0,9% NaCl, 37 °C).
- Dæk såret med en glas dækseddel og fastgør denne glas dækseddel med en snap ring ved hjælp af snap ringen PLIER på titanium kammeret.
- Umiddelbart efter afslutningen af den kirurgiske procedure, skal du placere musen på billedbehandlings fasen af en stereomicroskop udstyret med et kamera og tage billeder (dag 0) under belysning. Brug 40X forstørrelse og gemme billederne til fremtidig off-line analyse.
Bemærk: investigator bør undersøge billederne umiddelbart efter indfangning for at sikre, at kvaliteten er tilstrækkelig til fremtidige off-line analyser. Forberedelsen af fold kammeret og ydeevnen af huden sår tager omkring 30 minutter. - Hold musen på et varmt sted under genopretning fra anæstesi i mindst 2 h. Derefter overføre mus i individuelle bure tilbage til dyret facilitet (12 h lys/mørk cyklus) og sørg for, at mus har adgang til mad og vand.
- Tre dage post-wounding placere musen i en mus-fastholdelses og fastsætte fastholdelses på toppen af Imaging fase.
- Placer scenen under et stereomicroskop udstyret med et kamera. Tag billeder under belysning med 40x forstørrelse, Optag alle billeder og gem dem til fremtidige off-line analyser
- Gentag trin 4,20 og 4,21 igen på dag 6, 10 og dag 14 post-wounding.
- Brug de sår billeder, for off-line analyse i ImageJ13. Sårområdet på dag 0 betragtes som 100%, og sårlukningen over tid afbildes i forhold til det oprindelige sårområde. Repræsentative resultater er vist i figur 2c, d.
- Beregn procentdelen (%) sårområdet ved hvert tidspunkt ved hjælp af følgende ligning:
x: tidspunkt (dag 0, 3, 10 eller 14), a: sårområde på dag 0, b: sårområde på tidspunkt x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ridse analysen blev udført på et konflydende celle-enkeltlags af vildt-type-og β3-mangelfulde mef'er (figur 1c). Efter at have udført "bunden" ved hjælp af en 200 μL pipettespids, migrerer cellerne fra begge genotyper ind i arbejdsområdet og lukker hullet. Billeder blev taget efter 6, 10 og 30 h (figur 1a). Celle migration blev kvantificeret som procentdelen (%) af arbejdsområde genbefolket ved at migrere celler 6 timer efter at have udført bunden. Migrerende Cavβ3-mangelfulde Mef'er lukkede arbejdsområdet betydeligt tidligere end MEFs fra vild-type mus (figur 1a, b). For at udelukke enhver effekt af celle spredning blev analysen af scratch migration udført i nærværelse af enten 10% eller 1% FCS. Ved 10% FCS begge processer er til stede, celle proliferation og migration, hvorimod ved 1% FCS celle spredning er minimeret. Fibroblaster i 10% (figur 1b, venstre) eller 1% FCS (figur 1b, højre) viste et lignende migrations mønster, udelukker muligheden for celleproliferation bidrag til cavβ3 observerede fænotype. Cavβ3-mangelfulde MEFs lukkede hullet betydeligt tidligere end Wild-type MEFs under begge betingelser. For at bekræfte den Cavβ3-afhængige effekt observeret i β3-mangelfulde fibroblaster blev Wild-type fibroblaster transficeret med siRNA til nedregulering af Cavβ3-proteinet (figur 1e). Som kontrol for nedreguleringen blev der udført immunoblots for at bekræfte effektiviteten af siRNA-behandlingen. To uafhængige Cacnb3 specifikke Sirnas (SiRNA1 og siRNA2), og en forvrænget siRNA (som en kontrol) blev brugt. Fibroblaster behandlet med Cacnb3-specifikke sirnas opfører sig som β3-mangelfulde fibroblaster (figur 1d), dvs., migrationen er steget i fravær af cavβ3 protein (figur 1e).
In vivo blev det dorsale skinfoldede kammer implanteret (figur 2a, b), og et defineret cirkulært sår med en diameter på 2 mm blev genereret på den barberede ryg (figur 2b) af de vildtype-og cavβ3-mangelfulde mus (8 dyr pr. genotype, 8-12 uger gamle og 22-26 g vægt). Såret blev udført ved at fjerne hele huden med epidermis og dermis. For at sammenligne sårheling af huden mellem begge genotyper blev sårområdet i hudfoldnings kammeret fotograferet direkte efter såret (dag 0), og derefter blev der taget billeder 3, 6, 10 og 14 dage efter at have såret (figur 2c). Størrelsen af sårene blev målt på disse digitale billeder, og sårområdet på en given dag blev udtrykt som procentdelen (%) af det indledende sårområde (figur 2d). Sårlukningen øges i β3-mangelfulde mus sammenlignet med Wild-type kontrol. I modsætning til Wild-typen blev såret i β3-mangelfulde mus næsten helt lukket allerede efter 10 dage. På dag 14 efter såret var sårene helt lukkede i begge genotyper (figur 2c, d).
Figur 1 : In vitro-scratch migration assay. (a) repræsentative billeder af kulturer fra vildtype (WT, venstre) og Cavβ3 ko (β3 ko, højre) primær mus embryonale fibroblaster (mefs) straks, 6, 10 og 30 h efter at have udført en ridse. Billeder blev konverteret til 8-bit grå skala, og kontrasten, samt lysstyrke, blev tilpasset til maksimalt visualisere celle frit område. Analyse af det celle frie område (% af arbejdsområdet, der blev genbefolket af migrerende celler) blev udført på de oprindelige 24-bit RGB-billeder. b) søjlediagrammer, der viser procenter (%) af arbejdsområde genbefolket ved at migrere celler efter 6 timer enten i nærværelse af høj (10%, venstre) eller lav (1%, højre) føtal kvægserum (FCS) i vildtype (sort) og Cavβ3 KO (rød) eksperimenter (c) immunoblot: protein ekstrakter fra vild-type hjernen (50 μg pr. Lane) og fibroblaster (MEFs, 100 μg pr. Lane) ved hjælp af et Cavβ3-specifikt antistof. Den β3 protein (55 kDa) er til stede i vild-type hjernen (anvendes som en kontrol), og fibroblaster, men er fraværende i proteinekstrakter af Cavβ3-mangelfuld hjerne og fibroblaster fremstillet af Cavβ3-mangelfuld mus. (d) Resumé af procentdelen af arbejdsområdet genbefolket ved at migrere celler efter 6 timer i vild-type celler behandlet med enten forvrænget siRNA (kontrol, sort) eller to uafhængige Cacnb3 sirnas (siRNA1 og siRNA2, røde åbne bjælker). e) det tilsvarende immun fra forsøget i (d). Data vises som Mean ± SEM, p-værdier blev beregnet ved hjælp af ikke-parrede to-sidet Student's t-test. Paneler a og b er blevet modificeret fra [belkacemi et al., 2018]4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : In vivo hud sårheling i mus. (a) titanium ramme indvendige sidevisning viser den ene halvdel af titanium kammer og front sidevisning viser den samlede titanium kammer med to symmetriske halvdele fastgjort med skruer og møtrikker. (b) mus efter barbering af rygskind og montering af dorsale fold kammer bestående af to symmetriske titanium rammer (vægten af titanium rammen er omkring 2 g) og anvendelse af et cirkulært sår (2 mm diameter). (c) billeder af såret direkte efter såret (dag 0) og 3, 6, 10 og 14 dage efter såret. Den kontinuerlige proces med sårlukning, med komplet epitelialisering, vises over 14 dage i Wild-type (WT, top) og Cavβ3 KO (β3 KO, bottom) mus. d) på de angivne tidspunkter blev sårområdet fastlagt ved hjælp af et computerstøttet billedanalyse program og afbildet som en procentdel af sårområdet umiddelbart efter skaden på dag 0 (gennemsnit ± SEM af n = 8, Β3 ko-mus og tilsvarende vildtype kontrollere mus). P værdier blev beregnet ved hjælp af to-vejs ANOVA og Bonferroni's multiple sammenligninger test. Paneler c og d er blevet modificeret fra [belkacemi et al., 2018]4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en in vitro og in vivo sårhelings analyse og korrelerer de opnåede resultater. Til in vitro-analysen brugte vi primære mus fibroblaster4,14,15 , som spiller en vigtig rolle i sårheling og vævs remodeling11. Andre vedlige celletyper, der vokser som monolag (f. eks. epiteliale celler, endotelceller, keratinocytter), kan også anvendes. Plating det samme antal levedygtige og sunde celler og anvendelse af bunden på samme grad af konflughed er af afgørende betydning for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. Det anbefales stærkt at udføre biologiske og tekniske replikater. I den nuværende metode blev der brugt 6-brønd plader, men 12-eller 24-brønd plader kan også bruges, især når cellerne kun er tilgængelige med begrænsede tal. I tilfælde af siRNA-behandling er immun-analyse efter hvert sæt af eksperimenter obligatorisk for at sikre, at målproteinet er effektivt nedreguleret. Transfection reagens og tidsvindue skal testes og vælges for hver celletype, før du begynder med migrations analysen. I tilfælde af fibroblaster og Cacnb3 genet, det tog 3 til 4 dage at nå det ønskede niveau af ned-regulering. I modsætning hertil behov for scratch migration assay kortere tider (6 h til 24 h). For at undgå høj variation i ridse størrelsen, er det obligatorisk, at den samme investigator anvender bunden for hvert sæt eksperimenter, at samme tryk administreres af pipettespidsen og for at holde såret så meget som muligt lodret til den markerede linje ved bunden af pladen på tværs af cellen monolayer. Anvendelse af en mekanisk ridse på tværs af cellen enkeltlags fører til frigivelse af forskellige cellulære faktorer (f. eks ATP) fra beskadigede celler i det ekstracellulære rum. Disse faktorer ville fremkalde paracrine signalering, herunder ca2 +-signalering i de tilstødende celler, hvilket igen ville påvirke cellulære svar16. For at undgå disse effekter, kultur skær kan bruges til plating celler og efter fjernelse af disse indsætter en celle-fri hul er skabt uden at beskadige de tilstødende celler17. Ved screening med høj gennemløb kan efterforskerne overveje at bruge instrumenter, der er tilgængelige på markedet, til at skabe reproducerbare og konsistente ridser i 96-brønd plader. For at følge celle migrering kinetik kontinuerligt over tid, kan brugerne også overveje at bruge high-end kommercielle systemer til automatisk billedoptagelse. Men automatiserede systemer til scratch-applikation og billedoptagelse er ikke altid tilgængelige på grund af høje omkostninger. En mere tilgængelig og omkostningseffektiv løsning for tidsforskudt billeddannelse ville være for eksempel ved hjælp af systemet (ATLIS: en overkommelig tidsforskudt billeddannelse og inkubations system) beskrevet af Hernandez Vera og kolleger18.
I mangel af nogen celleproliferation hæmmere, genbestand af hullet i scratch migration assay er en kombination af celle migration og celle spredning. For at overvåge kun celle migration, kan celle spredning undertrykkes for eksempel ved behandling med enten Actinomycin C19 eller mitomycin c20. Passende koncentrationer af disse forbindelser skal nøje bestemmes og testes for at undgå de toksiske virkninger af disse forbindelser, som kan påvirke levedygtigheden af cellerne og deres evne til at migrere. Som beskrevet i denne artikel, serum sult eller reduktion af serumkoncentrationen i dyrkningsmediet er en anden måde at reducere virkningerne af celle spredning. Serum sult anvendes i flere andre cellebaserede assays. Det kan fremkalde et stort antal cellulære reaktioner, som kan forstyrre de opnåede resultater og fortolkninger21. Serum sult skal anvendes omhyggeligt, og dets virkning på cellens levedygtighed bør vurderes, før forsøget påbegyndes. I denne artikel vises migrationen af primær fibroblaster ved tilstedeværelse af enten 10% eller 1% serum (Se figur 1b). Migrations raten, som forventet, er langsommere ved lave koncentrationer af serum. Men, β3-mangelfuld fibroblaster migrere hurtigere end Wild-type celler på begge betingelser; lav og høj serumkoncentration.
Den hud sårheling analyse ved hjælp af dorsale fold kammer er en forholdsvis ligetil procedure til at undersøge hud sår lukning over tid in vivo. Implantation af titanium dorsale fold kammer blev beskrevet for første gang i rotter22. Sorg et al. brugte denne teknik i SKH1-hr hårløse mus til at følge sårheling og dannelse af nye blodkar9. Den fold kammer model, der er beskrevet i denne artikel har mange fordele i forhold til de klassiske sårheling assays udført på rygskind, på øret23 eller bagben7 af mus. Dækker sårområdet med en glas dækseddel forhindrer infektioner og vævs traumer og begrænser udtørring af såret. Det observations kammer, der er dækket med glas dæksedlen, kan åbnes på ethvert tidspunkt under helingsprocessen, hvilket giver mulighed for aktuel anvendelse af forskellige farmakologisk aktive forbindelser (f. eks. siRNA for Cavβ3 som opløsninger eller salver), og kammeret kan lukket igen. Murine hud sår healing proces er sammensat af både sammentrækning og epitelialisering24. Ved hjælp af dorsale fold kammer i mus minimerer hud sammentrækning og giver mulighed for at studere primært epitelialisering proces. Det giver også et klart vindue til at observere og overvåge sårluknings processen. En ulempe ved titanium kammer er, at musen har til at bære titanium kammer, som har en vægt på omkring 2 g (7,7% af vægten af en 26 g mus), for 14 dage. Dette kan forårsage nogle ubehag for musen, selv om det lader til, at mus tolerere godt dette kammer, og de er komfortable og kan nemt nå mad og vand. Huden sårheling model præsenteret i denne artikel kan studere kun ét sår per mus. Andre offentliggjorte metoder25,26 tyder på at anvende to sår per mus, som ville reducere antallet af dyr, der er nødvendige for en undersøgelse. Det er af stor betydning at skabe et cirkulært sår af samme størrelse for alle mus for at få objektive oplysninger samt pålidelige og reproducerbare resultater. For at tage billeder af sårene over tid, mus blev fastsat på en mus fastholdelses, placeret på en scene, og fold kammer er placeret under en stereomikroskopet. Ved hjælp af fastholdelses hjælper med at undgå anæstesi og minimere stress for musene. Mus kan ofres og væv fra det sårede område kan blive forklarende og indsamlet på forskellige stadier af helbredelsesprocessen (enten efter fuldstændig helbredelse eller på tidligere tidspunkter) for histologisk analyse, RNA-samling eller protein biokemi.
Sammenfattende har vi vist to teknikker, en in vitro scratch assay ved hjælp af primære fibroblaster og en in vivo hud sårheling analyse i mus. I begge analyser øges sårheling/Gap-lukningen i fravær af Cavβ3-under enheden af spændings gated calcium kanaler. Som med Wild-type og Cavβ3-mangelfuld mus eller celler, begge assays kan godt korrelere i fravær eller tilstedeværelse af andre specifikke molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene enhed af SPF Animal facilitet (projekt P2 af SFB 894) af det medicinske fakultet og dyret facilitet på Institut for klinisk og eksperimentel kirurgi på det medicinske fakultet ved Saarland Universitet, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk læsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 til A.B. og V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
