Summary
我们描述了用于制备卵母细胞和纯化孢子菌的方案，用于研究隐孢子虫的人类肠道和气道器官的感染。我们演示了将寄生虫微注射到肠道器官流明和有机体免疫染色的程序。最后，我们描述了从器官中分离生成的卵母细胞。
Abstract
隐孢子虫是导致人类腹泻病的主要原因之一。为了了解寄生虫的病理学并开发有效的药物，需要一种体外培养系统来概括宿主的条件。有机体与它们起源的组织非常相似，是研究宿主-寄生虫相互作用的理想。有机体是三维（3D）组织衍生结构，从成人干细胞中提取，在培养中长期生长，无需任何基因畸变或转化。它们具有明确的极性，具有尖顶和边面。有机体在药物测试、生物库、疾病建模和宿主微生物相互作用研究方面具有多种应用。在这里，我们提出了一个分步协议，如何准备隐孢子虫的卵母虫和孢子菌感染人类肠道和气道器官。然后，我们演示了如何使用微注射将微生物注射到有机体流明中。有机物可用于宿主-微生物相互作用研究（显微注射、机械剪切和电镀以及制造单层）有三种主要方法。微注射能够维护3D结构，并能够精确控制微生物的寄生虫体积和直接的侧接触。我们提供用于成像或卵母细胞生产的最佳器官生长的详细信息。最后，我们还演示了如何从有机体中分离出新生成的卵母细胞，以便进行进一步的下游处理和分析。
Introduction
治疗和预防隐孢子虫感染的药物或疫苗的开发一直受到缺乏体外系统，精确模仿人体体内情况1，2的阻碍。许多目前可用的系统要么只允许短期感染（<5天），要么不支持寄生虫3，4的完整生命周期。其他能够完全发展寄生虫的系统是基于不朽的细胞系或癌细胞系，它们不能忠实地概括人类的生理状况5，6，7.有机体或"小器官"是3D组织衍生结构，生长在细胞外基质中，辅以各种组织特定的生长因子。有机体是从各种器官和组织发展起来的。它们具有遗传稳定性，可概括其来源器官的大部分功能，可在培养中长期保存。我们开发了一种用隐孢子虫感染人类肠道和肺器官的方法，为研究与肠道和呼吸隐孢子虫病相关的宿主-寄生虫相互作用提供了精确的体外模型8 ，9，10，11，12，13。与其他已发表的培养模型相比，有机体系统代表现实生活中的宿主寄生虫相互作用，允许完成生命周期，以便研究寄生虫生命周期的所有阶段，并保持寄生虫繁殖长达28天10。
隐孢子虫是一种感染呼吸道和肠道上皮的寄生虫，引起长期腹泻病。耐抗环境阶段是卵母细胞，发现在受污染的食物和水14。一旦摄入或吸入，卵囊肿和释放四个附着在上皮细胞的孢子石。孢子石在宿主细胞上滑行，并接合宿主细胞受体，但寄生虫没有完全侵入细胞，似乎诱导宿主细胞吞没它15。寄生虫在细胞内但细胞外质室内化，留在细胞的表层，在寄生性腹腔内复制。它经历了两轮无性繁殖——这个过程叫做美罗戈尼。在美罗戈尼期间，I型美龙特人发育，其中含有八种甲子，它们被释放以侵入新的细胞。这些美罗佐石侵入新的细胞，发展成含有四个美罗索石II型的梅龙特。这些美罗佐特，当被释放，感染细胞，并发展成宏加蒙特和微加蒙特。微配因子被释放，使大玩家受精，产生成熟成卵囊的酶。成熟的卵母细胞随后被释放到流明中。卵囊是薄壁，立即排泄重新感染上皮，或厚壁被释放到环境中，以感染下一个主机14。隐孢子虫生命周期的所有阶段都已在我们的第10组先前开发的有机体培养系统中被确定。
由于人体器官忠实地复制人体组织9，11，13，并支持隐孢子虫10的所有复制阶段，它们是理想的组织培养系统研究隐孢子虫生物学和宿主寄生虫相互作用。在这里，我们描述了感染有机体与隐孢子虫和排泄孢子虫虫的程序，并分离在这个组织培养系统中产生的新卵母细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有组织处理和切除均在患者同意下根据机构审查委员会 （IRB） 批准的协议进行。
1. 制备用于注射的C.帕武姆卵囊
注：隐孢子虫是从商业来源购买的（见材料表）。这些卵母细胞在小牛中生产，并储存在磷酸盐缓冲盐水（PBS）与抗生素。它们可在4°C下储存约3个月，切勿冷冻。我们通常在一个月内使用卵母细胞。有机体可以感染完整的卵囊炎，或孢子石可以从排泄的卵母细胞中分离出来，并被用来感染有机体，如果重要的是不要从原来的接种体携带卵囊。
-
准备隐孢子虫卵细胞感染细胞 （图1A）.
- 在所有操作过程中，将卵囊动物放在冰上，直到它们被添加到有机体中。
- 计算全六孔板的有机体所需的卵母细胞数量（通常约为 5 x 105+2.5 x 105的板）。计数细胞计中的卵母细胞数量，以验证数量并转移到离心管。
注：为了帮助可视化，在加载到血细胞计之前，卵母细胞可以与卵母体特异性荧光抗体（见材料表）混合1：1。然后，可以使用荧光显微镜轻松可视化和枚举带有荧光标记的卵囊。我们建议注射约100~1，000个卵囊/有机体。一般来说，1，000~2，000个有机物可以在六孔板中生长。 - 使用 PBS 将卵囊悬浮液的体积达到 900 μL。加入100 μL次氯酸钠（如Clorox）漂白剂（在4°C下）。在冰上孵育10分钟。
- 在4°C下在8，000 x g的微离心机中离心3分钟。将离心机中的管定向，将盖子朝向朝向。颗粒可能很难看到，所以知道寄生虫在管中颗粒的位置是必不可少的。
- 去除上清液，小心避免颗粒。添加 1 mL 的 Dulbecco 改良鹰介质 （DMEM） 和涡旋混合。
- 在4°C下在8，000 x g的微离心机中离心3分钟。
- 再重复用 DMEM 进行两次。
- 制备扩张介质（OME）或分化有机体介质（OMD），其陶罗雄酸盐已添加到0.5%（w/v）的最终浓度中（参见材料表）。陶罗乔酸盐应始终准备和添加新鲜。
注：我们已经成功地在感染测定中使用0.5%taurocholate，其中接种液是完整的卵囊，并且看到感染率提高，而不会对宿主细胞产生有害影响。然而，陶罗雄酸盐可能对细胞产生意想不到的影响，在感染测定16中已成功使用了较低的浓度。 - 在100μL的有机体培养基中重新悬浮卵母细胞，辅以0.5%（w/v）陶罗雄酸钠。如步骤 1.1.2 中所述，再次计数卵母细胞。
- 将快速绿色染料添加到悬浮液中，以可视化注射。
- 用卵囊悬浮液填充微型装载机尖端（见材料表），并用它来填充拉毛细血管。
警告：整个过程应在具有2级安全协议的组织培养罩中进行。建议使用口罩，因为隐孢子虫在空气中也会具有传染性。
2.从C.parvum Oocysts中分离孢子石的体外纯化
-
在漂白并清洗上述漂白剂后，从C.parvum卵囊中纯化孢子石。
- 将卵母细胞转移到 15 mL 管中。在室温排泄介质中重新悬浮卵母细胞（0.75% w/v DMEM 中的陶罗菌酸钠），以获得 1 x 107卵囊/mL。陶罗雄酸盐的加入提高了卵母细胞的排泄率，提高了孢子石的产量。
- 在37°C下孵育卵母细胞悬浮液1~1.5小时。
- 微观检查样品的排泄范围;60~80%的排泄物对于孢子菌的良好恢复是合理的。如果排泄液水平低，孵育时间更长（再孵30分钟至1小时）。
- 确定相对于起始卵母细胞数量的排泄百分比。排泄值的计算方式如下：
%排泄物 = [1 ] （开始时完整的卵囊数量/卵母细胞数量）= x 100 - 通过加入14 mL的PBS或培养基，混合和恢复细胞（松状卵囊、卵囊壳和孢子虫）在3，400 x g下角20分钟，以恢复孢子石，以去除排泄物试剂。小心吸气，以避免失去细胞。
- 在 DMEM 的 1⁄2 mL 中重新悬浮孢子球，以获得 3 x 107卵母细胞/mL（基于起始卵母细胞的数量）。
- 要去除剩余的卵泡和壳体，请通过 3 μm 过滤器过滤悬浮液（图 1B）。使用装有聚碳酸酯过滤器（3 μm 孔径）的 47 mm 过滤器支架设备，该装置连接到 10 mL 注射器筒上。将过滤器支架装置放在 15 mL 管的顶部。将组件放在冰桶或冷藏室中。
- 将 7.5 mL 的孢子石悬浮液悬浮液添加到过滤器组件中，并允许通过重力过滤。用另一个 7.5 mL 的 DMEM 洗涤。
注：确保孢子石分离的成功新鲜卵母细胞和良好的排泄物是至关重要的。如果有太多的未切除的卵母细胞，悬浮物将不会通过重力。对注射器施加压力可以迫使未切除的卵母细胞通过。孢子石的显微注射比卵母细胞更具挑战性，因为孢子石可能会团状并阻塞毛细管。为了避免这种情况，我们建议在注射孢子球体时做一个较宽的毛细管尖端。为了达到足够的感染水平，与感染卵囊虫的有机体相比，需要将孢子菌注射到每个器官中的2⁄4倍。 - 使用摆动铲斗转子将过滤的孢子石悬浮液在 3，400 x g下离心 20 分钟，以颗粒孢子石。
- 在 50–100 μL 的 OME 或 OMD 有机体培养基（参见材料表）中重新悬浮，辅以 0.05% （w/v） 快速绿色染料和 L-谷胱甘肽、βine、L-半胱氨酸、亚油酸和含牛磺酸还原缓冲液5（参见材料表）。
注：孵育过长可能导致孢子石的溶化和恢复不良，因此应避免。
3. 微注射人体肠道和肺器官的体外培养
- 培养肠道器官在扩张和分化培养条件下。
注意：肠道和肺器官传播的细节之前在其他文章中已经描述过8,13（参见材料表媒体食谱）。在这里，我们简要地描述了有机体培养方法，具体参考了Cryptosporidium注射和增长。我们发现，在有机体中对寄生虫进行成像时，在扩张培养基中生长的有机体比生长的分化介质中的有机体更可取，因为与在分化培养基中生长的有机体相比，碎片堆积较少。然而，如果目标是分离卵母细胞，在分化培养物中生长的有机体会产生数量大得多的卵母细胞。- 在37°C的细胞外基质（见材料表）中保持3D培养物中的有机体。在上面添加 OME（扩展媒体），每天刷新。
注：对于肺器官，我们没有单独的扩张和分化介质。 - 要分割和板式有机体进行显微注射，请从含有人体器官的 6 孔板上取出介质，并将 F12+（参见材料表）添加到井中，并通过多次移液器移液来分解基质。将细胞收集到15 mL管中（每管2 mL F12+足以进行进一步手术）。
- 将 10⁄12 mL 的 F12+ 添加到另一根 15 mL 管中，并将一个消防抛光玻璃移液管放入介质中，上下移液器上下 3 次，以分解人体肠道和肺器官。
注：使用长玻璃移液管（20~30 厘米），并短暂抛光。请勿使开口（直径为 1 mm）非常小，因为有机物可能会损坏。通过短暂抛光移液管的尖端使其光滑。将有机物分解成更小的±50 μm。 肺器官具有较厚的外膜，因此与肠道器官相比，需要用玻璃移液器进行更坚固的剪切。此外，它们的生长速度比肠道器官慢（每次通过之间长达14天）。 - 加入F12+至5~7 mL，以350 x g离心5分钟。
注：此步骤中的离心速度高于正常值，以便产生与细胞外基质很好地分离的良好细胞颗粒（参见材料表）。我们观察到，与小鼠小肠类物相比，人类小肠器官更难破坏。 - 在不干扰细胞的情况下，尽可能多地去除介质，然后用基质保持在4°C的颗粒重新悬浮;六孔板每孔需要200~300μL的基质。有机体应分三分之一，以保持相当高的细胞密度。
- 在六孔板的井中，将有机体以约5~10μL的基质液滴板。在 37°C 下孵育 20-30 分钟，然后在顶部添加膨胀介质 （OME）。
- 每 2⁄3 天更换一次介质。
注：在大约5~7天内，在EM中生长的有机体达到100~200μm，并准备注射。 - 为了区分有机体，在EM中5~6天后，将介质更改为分化介质（DM）条件，并在注射寄生虫前再保留5~6天。
注：对于有机物的膨胀，建议将有机物密集地板。对于显微注射，建议使用六孔板，以较低的密度镀有有机物。例如，将六孔板的三口井的板体放入一个完整的六孔板中，用于显微注射。基质应保持在-20°C进行长期储存，并在4°C或冰上解冻， 然后再使用。肺器官的膨胀是类似的方式，但使用肺器官特异性介质成分（表1）8。
- 在37°C的细胞外基质（见材料表）中保持3D培养物中的有机体。在上面添加 OME（扩展媒体），每天刷新。
4. 将卵囊虫/孢子石微注射到有机体流明中
-
将微注射寄生虫进入3D类化合物的杏状侧（图2）。
- 使用微移液器拉拔器制备直径为 1 mm 的玻璃毛细管。
注：微移液器拉拔器上使用的设置（参见材料表）为：热 = 663、拉 = 100、速度 = 200、时间 = 40 ms。 - 用钳子切毛细管的尖端。毛细管端尺寸/直径约9~12微米;这使得卵母细胞容易流动（4⁄5 μm大小）。
- 使用微型装载机尖端向毛细血管填充卵囊或孢子石悬浮液。
- 将填充的卵囊毛细管加载到显微注射器上。
- 在5倍放大倍率的倒置显微镜下，将100~200 nL悬浮液微注入每个有机体，保持压力恒定。微注射后，每天用OME或OMD刷新介质，并将板保持在37°C。
注：我们不使用显微操作器进行显微注射。建议在整个实验中使用相同的毛细管，以确保在每个样品中进行相同的注射。
- 使用微移液器拉拔器制备直径为 1 mm 的玻璃毛细管。
5. 有机体的免疫荧光染色
- 使用 P1000 移液器将有机物（1⁄2 x 24 口）收集到含有冷 F12+ 的 15 mL 管中。
- 颗粒在 300 x g下 2 分钟，去除上清液而不破坏颗粒，并轻轻地将颗粒移入剩余体积。
- 在PBS中加入5mL2%的甲醛。为了防止有机物粘在墙壁上，不要使管倒置。让有机物沉降到管底，在室温下过夜或1小时固定在4°C。
- 取出固定剂，并添加10 mL的渗透缓冲液（PBS 中 0.2% Triton）。
- 在室温下旋转管子 20 分钟（这可确保所有有机物都保持悬浮状态）。
- 在300 x g下将有机物颗粒2分钟，然后丢弃上清液。
- 在500μL的阻滞溶液中轻轻悬浮有机物（见材料表），并转移到2 mL微离心管中。
- 在室温下在摇床上孵育20分钟。让有机物通过重力沉降到管的底部。用原抗体溶液（见材料表）替换阻断溶液，在室温下孵育1~2小时或在4°C过夜。
- 用含有0.1%补间的PBS洗涤3次。每次让有机物沉淀下来，去除上清液。
- 加入二级抗体溶液（见材料表），在室温下孵育2小时。
- 用含有0.1%补间的PBS洗涤3次。第三次洗涤后，离开 50 μL 的 PBS。
- 通过移液悬挂在幻灯片上 50 μL 的 PBS 中的有机体，安装在幻灯片上。取出多余的PBS，添加一滴安装剂（参见材料表），并在顶部添加盖玻片。用指甲油密封两侧，让它干燥。
6. 卵囊与有机体的隔离
- 从有机体流明中分离出新形成的卵母细胞。
注意：卵囊通过免疫磁分离使用卵囊分离试剂盒从器官中分离出来（参见材料表）与下面描述的修改。然后可以通过免疫荧光和电子显微镜分析分离的卵囊。- 从在OMD中保存5~7天且未感染、感染1天和感染5天的分化器官开始。使用前两个作为负控件。
注：我们发现，分化的有机体比肺或扩大的肠道器官产生更多的卵囊。 - 将有机物收集到15 mL离心管中。在3，000 x g和10°C下使有机体离心20分钟。
注：这种高速是必要的，以确保没有卵囊丢失任何器官，可能会被打破。 - 取出有机体介质，用 5 mL 的水将其更换。
- 使用火抛光玻璃巴斯德移液器反复进行剧烈移液，破坏有机体。
- 如果块可见，将有机体悬浮液转移到玻璃上，并同质化，直到有机物被很好地破坏。大数均化剂不会影响卵母细胞。
- 一旦没有可见的团块，从卵母细胞隔离套件中加入5 mL的缓冲A。混合并加入120 μL的磁珠涂层抗卵母体IgM。
- 在室温下孵育细胞悬浮液和磁珠2小时，在摇臂平台上连续混合。
- 在孵育结束时，将含有细胞和珠子的管子放在专为15 mL管设计的磁性分离架上。
- 手动旋转磁性分离机架中的管 3 分钟。磁珠将粘附在磁体旁边的管侧。
- 小心，用10mL移液器，从珠子上取下上清液。在450 μL缓冲液B中重新悬浮珠子，并转移到1.5 mL微离心管中。
注：保持上清液，直到确认卵母细胞的隔离。 - 要收集任何剩余的珠子和卵泡，用450μL的缓冲液B清洗15 mL管，并将这种清洗添加到微离心管中的磁珠中。
- 重复步骤 6.1.11 再次。所有珠子和捕获的卵母细胞现在应该转移到微离心管。
- 将微离心管放在用于固定微离心管的磁性分离架上。
- 用手旋转磁性分离机架中的管 3 分钟。
- 用移液器小心地将上清液放入新管中。
注：保持上清液，直到确认卵母细胞的隔离。 - 从磁分离架上拆下含有磁珠和卵囊的微离心管。
- 将 100 μL 的 0.1 N HCl 添加到磁珠中，使卵母细胞从珠子上脱落。涡流30s。
注：涡流应设置为略低于最大速度。 - 在室温下在0.1 N HCl中孵育珠子10分钟。
- 漩涡再次。然后，将管子放回磁分离架上。等待珠子粘附在管侧，然后将上清液转移到新的微离心管中。
- 重复步骤 6.1.17 到 6.1.19，并将第二个洗脱液与第一个洗脱相结合。
- 用 20 μL 的 1 N NaOH 或其他中和缓冲液（如 1 M Tris、pH 8）中和。
- 要计算卵母细胞，请取 10 μL 的 eluate，将其与 10 μL 的卵母体特异性抗体（参见材料表）结合，并在流细胞计上计数荧光卵母细胞。
注：分离的卵泡可以储存在4°C或立即用于免疫荧光或电子显微镜成像。
- 从在OMD中保存5~7天且未感染、感染1天和感染5天的分化器官开始。使用前两个作为负控件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这里介绍的协议导致卵囊和孢子石的有效纯化（图1A）准备显微注射。排泄物协议导致从大约 70-80% 的卵母细胞中释放孢子菌，因此必须通过 3 μm 过滤器过滤掉剩余的卵母细胞和壳。过滤可产生近100%的孢子石纯化（图1B）。此外，添加绿色染料有助于确保注射所有有机物，并允许注射的有机物在注射后至少24小时可视化（图2B）。
这些用于制备卵母细胞和孢子菌的规程是直接的，并已使用多年，因此预计经过处理的卵母细胞和纯化孢子石将可行和具有传染性。然而，在我们的研究中，我们使用扫描电子显微镜，以确保排泄过程不损坏孢子或卵虫（图2A）10。通过简单的显微成像（图2C），可以在视觉上证实向器官流明中注入等量的卵母细胞。应设置部分受感染的有机体，以验证寄生虫通过定量PCR传播，正如我们所描述的10。
寄生虫生命周期的进展可以通过在感染后的不同时间点收集受感染的有机物，并通过传输电子显微镜或免疫荧光与4+，6-二酰胺-2-phenylindole（）进行分析来可视化。DAPI） 寄生虫核染色10.例如，对美罗佐特表面抗原的抗体，如gp40和gp1517可用于识别美龙阶段;I型梅龙将具有8个核和II型梅龙，4核10。最近，一组单克隆抗体特异性对肉体动物，美罗佐特，I型与II重子，和宏加蒙特已经18。这些抗体也将非常有效的标记进展的寄生虫通过其在有机体的不同生命周期阶段的进展。
免疫荧光测定也可用于探索哪些细胞类型被隐孢子虫感染。这在气道器官中观察尤其重要，因为对呼吸隐孢子虫病知之甚少，而且寄生虫的确切宿主细胞也不得而知。我们对受感染的隐孢子虫有机物进行了免疫荧光测定，共同将CC10（俱乐部细胞的标记物）本地化，发现隐孢子虫感染了CC10阴性细胞和阳性细胞（图3）。这些结果得到了TEM的证实，在TEM中，我们观察到隐孢子虫感染气道类有机体10中的分泌和非分泌细胞。
在分化的有机体被感染五天后，应该有大量的卵母细胞被生产。在我们手中，从一个六孔板感染的有机物产生了大约4000个卵母细胞，这可以很容易地识别，并通过标记与卵囊特异性抗体的细胞仪计数。卵囊中四个孢子球的存在可以通过将部分卵母细胞干燥到粘合滑道上，用甲醇固定，并将DAPI染色与卵囊特异性抗体结合（图4）来证实。通过TEM分析10，可以验证厚壁卵母细胞的生产。
图1：隐孢子虫和孢子虫的制备和纯化。（A） 用于卵母细胞和孢子石制备感染的方法的原理表示。（B） 显示卵囊体体外排泄物的图像。对未渗出的卵母细胞和贝壳的过滤，提供孢子石的纯化溶液。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：将卵囊微注射到有机体流明中。这个数字已由Heo等人10修改。（A） 扫描电子显微镜 （SEM） 卵母细胞和孢子石的图像.（B） 图像显示卵囊注射的有机体。绿色染料有助于可视化每个有机体的注射，并持续至少24小时（C）图像的器官注射卵囊。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：隐孢子虫-感染气道器官的免疫荧光图像。粘蛋白在有机体的流明中标有抗粘蛋白5抗体（红色），俱乐部细胞标有抗CC10（黄色），隐孢子虫被检测为卵囊特异性抗体（绿色），细胞核与DAPI（蓝色）染色。面板 B 是面板 A 中正方形中指示的面积的放大，请单击此处查看此图的较大版本。
图4：从分化的肠道器官中分离出的卵囊免疫荧光图像。卵囊壁在绿色中标有卵囊特异性抗体，四个孢子球核被形象化为DAPI（蓝色），请点击这里查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肠道和气道类有机物中隐孢子虫寄生虫的培养为研究宿主-寄生虫相互作用提供了一个精确的模型，但还有许多其他应用。例如，目前选择和传播转基因隐孢子虫寄生虫的方法要求在小鼠19中通过，这不允许分离对体内感染至关重要的寄生虫。隐孢子虫的有机体培养提供了这个程序的替代方案。然而，我们注意到，电孔孢子团聚集在一起，并阻止微移液器。为了选择转基因寄生虫，有机体可以在分化条件下以二维形式在胶原蛋白涂层的透水井上生长，以便感染转染孢子菌，从而选择转基因卵母细胞。横井允许进入表皮表面和边面表面，并且长期稳定。
目前，我们以二维格式培养有机体，用于癌症组织衍生器官药物的高通量筛查（未公布的数据）。这种有机体培养方法也可以被调整用于测试抗隐孢子虫药物使用转基因荧光素酶标记隐孢子菌株19。此外，即使感染不是紧密同步的，感染孢子菌的有机物提供了足够的同步的生命周期，药物可以测试其疗效对特定的生命周期阶段。
有机体共培养系统正在开发中，考虑到宿主系统的一些其他方面，如微生物群和免疫细胞20。因此，解剖寄生虫和宿主细胞、免疫细胞和微生物群之间的相互作用的能力将很快在体外成为可能。隐孢子虫的遗传操作现在也是可能的19，和荧光报告菌株的隐孢子虫和有机体培养的组合将提供受感染细胞的单细胞测序的工具，更具体地说，对感染寄生虫特定阶段的细胞进行单细胞测序。
这里描述的实验的成功在很大程度上取决于卵母细胞的可行性和感染性。不同批次的隐孢子虫卵细胞在出位率和感染宿主细胞的能力方面可能有很大差异。孢子石的充分产量取决于良好的排泄率，并且排泄率并不总是与传染性相关。如果与一批特有卵母细胞观察到低感染水平或不良排泄物，可以通过获得大量卵母细胞来节省时间和精力，而不是试图增加卵母细胞数量，或延长孵育时间。
组织文化媒体应每隔一天刷新一次。最好使用早期器官培养的段落。如果有机体在后来的通道中开始分化，因为有机体文化的健康极大地决定寄生虫的生存能力，解冻一个新的类有机物小瓶是很重要的。感染后，应每天刷新有机体介质，以避免有毒物质在介质中积聚。
隐孢子虫的有机体培养是有限的，因为寄生虫不能无限期地传播，并且感染在28天10天三次传播后逐渐消失。我们所描述的小鼠实验用微注射足够的有机物可能非常耗时，而且需要物理负担。然而，迄今为止，没有其他方法能够使体外系统的完整生命周期完全代表人类感染，也没有描述任何培养系统，允许探索宿主-病原体相互作用的重要性呼吸道感染。隐孢子虫的有机体培养提供了一个强大的新工具，为探索隐孢子虫以前不可能的宿主-寄生虫相互作用开辟了途径。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢美国亚利桑那州亚利桑那大学农业和生命科学学院动物和比较生物医学学院的Deborah A. Schaefer帮助我们进行卵母细胞生产和分析。我们还感谢弗朗切斯基显微镜和成像中心和D.L.Mullendore在华盛顿州立大学的TEM准备和成像的分离器官卵母细胞。
D.D. 是荷兰科学研究组织（NWO-ALW， 016.Veni.171.015） 的 VENI 赠款的接受者。I.H. 是荷兰科学研究组织（NWO-ALW，863.14.002）的 VENI 赠款的接受者，并得到欧盟委员会玛丽·居里研究金（提案 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF）的支持。根据ERC高级赠款协议第67013号，从欧洲研究理事会获得第67013号高级赠款协议，从NIH NIAIH获得R21 AT009174至RMO的资助。这项工作是Oncode研究所的一部分，该研究所部分由荷兰癌症协会资助，由荷兰癌症协会的赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M.
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A.
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
