Användning av atomkraft mikroskopi för att mäta mekaniska egenskaper och turgor trycket av växtceller och växt vävnader

Summary

Här presenterar vi Atom kraftmikroskopi (AFM), som drivs som ett nano-och mikro-indenteringsverktyg på celler och vävnader. Instrumentet möjliggör samtidig förvärv av 3D-ytan topografi av provet och dess mekaniska egenskaper, inklusive cell Wall Youngs Modulus samt saft tryck.

Abstract

Vi presenterar här användningen av atomkraft mikroskopi att strecksats växt vävnader och återvinna dess mekaniska egenskaper. Med hjälp av två olika Mikroskop i indrag läge, visar vi hur man mäter en elastisk Modulus och använda den för att utvärdera cell Väggs mekaniska egenskaper. Dessutom förklarar vi hur man kan utvärdera saft tryck. De viktigaste fördelarna med atomkraft mikroskopi är att det är icke-invasiv, relativt snabb (5 ~ 20 min), och att praktiskt taget alla typer av levande växtvävnad som är ytligt platt kan analyseras utan behov av behandling. Upplösningen kan vara mycket bra, beroende på spets storlek och antalet mätningar per areaenhet. En begränsning av denna metod är att den endast ger direkttillgång till det ytliga cell skiktet.

Introduction

Atomkraft mikroskopi (AFM) tillhör scanning sond mikroskopi (SPM) Familj, där ett tips med en radie av vanligtvis några nanometer skannar ytan av ett prov. Detektering av en yta uppnås inte via optiska eller elektronbaserade metoder, utan via interaktions krafterna mellan spetsen och prov ytan. Således är denna teknik inte begränsad till topografisk karakterisering av ett prov yta (3D-upplösning som kan gå ner till några nanometer), men också möjliggör mätning av någon typ av interaktions styrkor såsom elektrostatisk, van der Waals eller kontakt styrkor. Dessutom kan spetsen användas för att tillämpa krafter på ytan av ett biologiskt prov och mäta den resulterande deformationen, den så kallade "indrag", för att bestämma dess mekaniska egenskaper (t. ex. Youngs Modulus, viskoelastiska egenskaper).

Mekaniska egenskaper hos växternas cellväggar är viktiga att ta hänsyn till när man försöker förstå mekanismerna bakom utvecklingsprocesserna^1,2,3. Faktum är att dessa egenskaper är tätt kontrollerade under utveckling, särskilt eftersom cellväggen mjukgörande krävs för att tillåta celler att växa. AFM kan användas för att mäta dessa egenskaper och studera hur de förändras mellan organ, vävnader eller utvecklingsstadier.

I detta dokument beskriver vi hur vi använder AFM för att mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck. Dessa två applikationer visas på två olika AFM Mikroskop och beskrivs här efter.

Protocol

1. mått på cell Väggs mekaniska egenskaper

Anmärkning: Exempel av den framkallande gynoecium av Arabidopsis framläggas.

1. Beredning av de biologiska proverna
   1. Samla en sluten blomma knopp vid etapp 9 till 10 (ca 0,5 mm lång) enligt publicerade stadier bestämning för Arabidopsis⁴. Under en kikare, med fin pincett, öppna försiktigt knoppen för att kontrollera utvecklingsstadiet och samla in gynoecium ligger i mitten av blomman.
   2. Sätt gynoecium på dubbel sida tejp placeras i mitten av locket på en liten petriskål (diameter på 5 cm).
      Anmärkning: Som ett alternativ kan biokompatibelt lim också användas för effektivare immobilisering av provet vid indraget.
   3. Tillsätt snabbt vatten tills provet är helt täckt. Detta undviker uttorkning och minskar vidhäftning av spetsen till provet. Alternativt kan du dränera provet i flytande medium, till exempel Arabidopsis Apex Culture medium⁵.
2. AFM kalibrering
   1. Ställ in grenställ fjäder konstant k tillräckligt hög för att tillåta deformation av provet ytan upp till önskad indrag, men inte för hög för att undvika förlust av känslighet.
      Anmärkning: Som en grov tumregel, om Youngs Modulus av provet är känd, kan storleksordningen av vårkonstanten väljas som k≈E * δ, där δ är önskad indrag.
   2. Använd en R = 400 nm sfärisk-slutade spets med 15 μm spets-cantilever avstånd.
      Anmärkning: Tip-radien är direkt relaterad till lateral upplösning. I allmänhet, för indrag på biologiskt material, Välj rundade spetsar (R större än 10-20 nm) eller kolloidal sonder. Små kolloidal sonder kan vara knepigt att använda på grund av det lilla avståndet mellan spetsen slutet och grenställ som kan röra provet yta.
   3. Slå på programvaran och placera huvudet horisontellt minst 2-3 h innan experimentet: Detta gör det möjligt för huvudet att thermalize och kommer att undvika termiskt-inducerad cantilever-laser relativa rörelser. Om mikroskopet är utrustat med en CellHesion modul (utvidgning av det tillgängliga Z piezo-intervallet till 100 μm istället för 15 μm), slå på styrenheten först och välj sedan CellHesion läge när du startar programvaran.
   4. Montera cantispaken på glas blocket och montera blocket på huvudet. Placera en droppe av några mikroliter ultrarent vatten på spetsen för att undvika bildandet av luftbubblor när spetsen doppas i vatten.
   5. Placera ett hårt prov (rengjort glas glida eller safir) och tillsätt 30-50 μl ultrarent vatten.
      Anmärkning: Kalibreringsproceduren som beskrivs här är den ibland kallade kontakt kalibreringen. Först, en kraft kurva görs på en styv och platt yta och sedan svängning spektrum av termiskt upphetsad grenställ registreras för att beräkna fjädern konstant. Andra kalibreringsprotokoll finns och kommer kortfattat att beskrivas i diskussions stycket.
   6. Placera huvudet på scenen (var noga med att lyfta Z-motorerna tillräckligt högt). Använd den optiska bilden för att ungefär placera lasern på cantilever.
      1. Flytta lasern längs huvudaxeln av grenställ övervakning av summan signalen på photodiode.
         Anmärkning: När standard cantispakar används, bör ett belopp större än 0,5 V erhållas.
      2. Flytta lasern längs den andra riktningen och maximera summan signalen för att placera lasern i mitten av cantilever. Detta kommer att minimera Cross-Talk mellan lateral och vertikal böjning.
   7. Mätning av deformationen känslighet
      Anmärkning: Den fotodiod läser laser förskjutning och ger en signal i volt. För att mäta deformationen i Metrisk enhet, måste deformationen känslighet mätas.
      1. Ställ in instrumentet i kontakt → kraft spektroskopi. Ställ in ett relativt börvärde på 2 V, Z-längd till 0,5 μm och Förläng hastigheten till 2 μm/s (samplingshastighet till 10000 Hz) och välj z sluten slinga.
      2. Öppna kalibrerings hanteraren och välj kontakt delen av kraft kurvan (som ska vara linjär) för att göra en linjär passning: inversen av lutningen ger deformationen känslighet. Den fotodiod läsning är nu kalibrerad i metriska enhet.
   8. Bestämning av vårkonstant. I kalibrerings hanterareväljer du vårkonstant för att köra ett termiskt spektrum förvärv. Om du vill ha en genomsnittlig signal under en längre tid väljer du ∞-symbolen. Makt spektrumet av termiskt upphetsad grenställ kan visa flera toppar; Rita en markering runt den som placerats på lägsta frekvens för att passa den.
      Anmärkning: Om termisk melodi utförs i vätska, kommer resonans toppen vara bredare och dess frekvens sänks jämfört med nominell en.
3. Force spektroskopi experiment set-up och förvärv
   1. Placera provet på AFM-stadiet och placera huvudet över provet.
      Anmärkning: Se till att huvudet har dragits tillbaka tillräckligt för att undvika en hård kontakt mellan spetsen och provet ytan.
   2. Låt grenställ thermalize i några minuter.
   3. I Qi -läge, tillvägagångssätt med en börvärde kraft på 50 nN.
   4. Ange en Z-längd på 4 μm och ett skanningsområde till 80 x 80 μm² med ett antal pixlar på 40 x 40. I panelen avancerade bildinställningar ställer du in läget på konstant hastighet. Ställ in förlänga och dra tillbaka hastigheten till 200 μm/s och samplingsfrekvenser till 25 kHz.
   5. Börja skanna och använda denna snabba låg-Force skanning för att kontrollera om provet rör sig. Kontrollera att det skannade området är fritt från skräp eller reflekerade celler och lokalisera en region av intresse så platt som möjligt för att utföra mätningarna.
      Anmärkning: För att uppskatta den verkliga prov lutningen, bör linjeutjämning vara inställd på off eller till konstant. En överdriven lutningsvinkel mellan indrags axeln och ytan kommer att påverka den uppmätta Youngs Modulus⁵.
   6. När ett intresseområde har funnits, Välj en region av 40 x 40 till 60 x 60 μm² runt den och öka pixelantalet för att nå 2 pixlar/μm. öka börvärdet till 500 nm för att erhålla 100-200 nm indraget. Justera det här värdet om det behövs i början av experimentet. Minska Z-längden till 2 μm. minska förlänga och dra tillbaka hastigheten till 100 μm/s och öka samplingsfrekvensen till 50 kHz.
   7. Börja skanna och spara utdata (vanligtvis består av en bild och en datafil).
   8. Vid slutet av mät dagen, ta bort spetsen hållaren och skölj den försiktigt med ultrarent vatten och 70% EtOH.
   9. Torka och ta bort cantilever. För ytterligare experiment med samma spets, Överväg att rengöra den med en våt rengöring protokoll och, om möjligt, en uppföljning plasma O₂ behandling. Låt inte vattnet torka på grenställ och/eller spets hållare för att undvika salt kristallisation.
4. Dataanalys (för 6. x data processing programversion)
   1. Öppna databehandlingsprogram och ladda datafilen.
   2. Klick på använda den här karta för baken bearbetningen knapp for att använda den samma analys paramenterna på alla kurvorna om karta.
   3. I den fördefinierade processen för inläsningväljer du Hertz Fit.
   4. Använd den första fliken för att verifiera eller ändra kalibrerings parametrarna.
   5. I den andra fliken tar du bort en förskjutning (eller en förskjutning plus en lutning) från baslinjen för att ange dess medelvärde till 0.
   6. På den tredje fliken uppskattar du positionen för kontaktpunkten (POC) genom att betrakta den som den första punkten som korsar 0-kraften när du kommer ned från börvärdet längs den utsträckta kurvan.
   7. Fliken vertikal spets position beräknar spetsen rörelse genom att subtrahera uthörelsen avböjning från höjd mätt. I det här steget använder du outjämnade höjd (rådata) för följande passning genom att markera motsvarande kryssruta.
   8. På fliken elasticitet passar väljer du lämplig modell för passform. Om ingen eller svag vidhäftning är synlig på dra in kurvor (motsvarande mindre än 10% av börvärdet kraft eller till den högsta genomsnittliga kraften vid det valda indrag djupet), bör modelltypen anges till Hertz/Sneddon och Extend kurva bör användas. Vid starkare vidhäftning, DMT-modellen, som står för Derjaguin-Muller-Toporov modell, bör föredras och passform bör utföras på återkalla kurvor (se manualen för detaljer om tillgängliga kontakt modeller och relaterade formler).
      1. Ställ in spets geometriska parametrar baserade på nominell spets form. Här, spets form är sfär och spets radie är 400 nm.
      2. Ange Poissons förhållande till 0,5 eftersom det är konventionellt gjort för biologiskt material (motsvarande incompressible material).
   9. Anpassa till specifika indrag. Som standard utförs passformen över hela kurvan. Om passformen måste göras upp till en specifik indrag, kontrollera först SKIFT kurvan kryssrutan; Detta kommer att skifta ursprunget för kurvan baserat på nyligen fastställda baslinje och POC värden.
      1. Lägg till en andra elasticitet Fit rutin genom att klicka på ikonen i huvudfönstret.
      2. Ställ igen alla Fit parametrar och ange i X min önskad indrag. Lägg till så många steg som behövs (2 till 3 steg bör räcka) för att förfina bestämningen av POC-positionen och därefter det beräknade indenteringdjupet. Processen kan sparas på denna punkt.
   10. Klicka på Behåll och gäller för alla att iterera föregående steg på alla kurvor på kartan.
   11. Spara resultaten. En bild och en. TSV-filer kommer att erhållas.

2. mått på turgor-tryck

Anmärkning: Ett exempel på den oryzalin-behandlade Blomställningen meristem av Arabidopsis presenteras.

1. Beredning av biologiskt prov
   1. Samla Arabidopsis blomställning meristem (im) som behandlats med mikrotubuli depolymerizing Drug oryzalin från in vitro plantlet odlas på medium som innehåller Polar auxin transport hämmare 1-N-naftylftalaminsyra (NPA) efter publicerad metod ⁶.
   2. Montering av IM-prov efter ett av de två alternativen
      1. För långsiktig övervakning: Montera provet i en petriskål som innehåller Arabidopsis Apex Culture medium (ACM)^7,8 och 0,1% växtskydds blandning (ppm), för att förhindra kontaminering. Suspendera IM spetsen ovan ACM yta och stödja basen av IM med en droppe 2% Agreste.
      2. För mätning med snabba lösnings förändringar: Montera provet i en petriskål som håller en liten bit lim, och snabbt täta gapet mellan mastix och provet bas med bio-kompatibelt lim. Vänta tills limmet stelnar (mindre än 2 min) och sänk sedan samman provet i flytande ACM som innehåller 0,1% PPM.
         Anmärkning: Se till att prov ytan inte är belagd med Agam eller lim vid fastställandet av prov underlaget. AFM-mätningen av saft-trycket kräver att provet monteras stabilt och att de tidigare monterings metoderna ger godtagbar stabilitet. Beroende på provet, andra monteringsmetoder kan användas, som dubbelhäftande tejp, Poly-lysin, etc.
2. AFM kalibrering
   1. Slå på AFM förvärvs programvara och välj Peakforce QNM (Large amplitud) mätningsläge.
   2. Utför kalibreringen enligt samma princip som beskrivs i steg 2,1 till 2,6.
   3. I fönstret Kontrollera parametrar anger du skanningsstorlek till 0. I rampfönstret , ange ramp storlek mellan 200 nm och 500 Nm, Trig tröskel mellan 2 v och 5 v och antal prover till 2048 eller högre.
   4. Justera grenställ spetsen med kalibrerings provet och klicka på Approach.
   5. Vid kontakt, gå till ramp fönster och klicka på knappen kontinuerlig ramp. På kurvans linjära regim bestämmer du lutningen genom att klicka på knappen Uppdatera känslighet . Upprepa mätningen av deformationskänsligheten flera gånger och uppdatera kalibreringen manuellt med mät medelvärdet genom att öppna Flikdetektorn från meny kalibreringen.
   6. Dra tillbaka AFM-huvudet och ta bort kalibrerings provet.
      Anmärkning: Det föreslås att helt dra tillbaka AFM huvudet genom att välja Tab skede → initiera för att förhindra oavsiktlig hård kontakt vid prov förändring.
3. Force spektroskopi experiment set-up och förvärv
   1. Om provet inte är nedsänkt ännu, Sänk den med flytande ACM som innehåller PPM.
   2. I anskaffningsprogram varan anger du mätningsparametrar enligt följande:
      1. I Kontrollera parameter fönster, Ställ fjäder konstant till cantilever tillverkas våren konstant eller den bestämda fjädern konstant som i steg 2,8. I det här exemplet är det inställt på 42 N/m.
      2. Ställ spets radie till 400 nm i det här exemplet.
      3. Ställ in provet Poissons förhållande till 0,5, eftersom vatten bidrar främst till saft tryck.
      4. Ställ in prov/linje till 128 för att säkerställa snabb förvärv.
      5. Ställ in skanningshastighet på 0,2 Hz.
      6. Ställ in skanningsstorlek på 1 μm.
         Anmärkning: Ange skanningshastighet och skanningsstorlek liten kan effektivt förhindra AFM Scan-utlöst prov skada. Det rekommenderas att minska dessa två parametrar vid varje prov ändring.
      7. Ställ rampens storlek på 5 μm i rampfönstret .
         Anmärkning: Det är bättre att ställa ramp storlek större än avsett indrag djup för bättre baslinje förvärv.
      8. Ställ in Trig-tröskeln på maximum.
      9. Ange antal prover till 4608.
      10. Alternativt, i Mikroskop → engagemang parametrar fliken, minska följande parametrar för att förhindra stark kontakt-inducerad prov skada. Ställ in Peak Force Engage börvärde till 0,3 v (standard 0,5 V). Ange engagera int. Gain till 0,5 (standard 0,75). Ställ in SPM Engage steg till 4 μm (standard 15 μm).
   3. Placera och rikta in provet under AFM-huvudet och närma sig tills grenställ är nedsänkt men inte i kontakt med prov ytan.
      Anmärkning: När du närmar dig, lätt blåsa på ytan av flytande ACM tills en flytande bro bildas mellan grenställ och flytande yta. Detta förhindrar vanligtvis hård kontakt.
   4. Med omsorg, manuellt närma sig mot provet. När sonden är relativt nära prov ytan klickar du på metod.
   5. Vid kontakt, gradvis öka skanningsstorlek och/eller skanningshastighet tills en önskad balans utan att skada provet och/eller cantilever.
      Anmärkning: Skanningsstorleken begränsas av provets yta krökning och grovhet. När det gäller oryzalin-behandlade IM, 50 x 50 μm² skanningsområdet kan uppnås med skanningshastighet på 0,3 Hz.
   6. Kontrollera om mätnings området är som önskat vid skanning. Flytta om det behövs. När du är nöjd, klicka på knappen peka och skjuta för att initiera punkt och skjuta fönster.
   7. Innan du registrerar skanningen väljer du en lämplig bild kanal som kan underlätta tydlig identifiering av cell konturer. Ofta är Peak Force error, DMT Modulus, LogDMT Modulus eller Dissipation lämplig. Ange Spara katalog-och filnamn. Klicka sedan på ramp vid nästa skanning för att initiera inspelningen.
      Anmärkning: En sträng med en punkt och tre nummer kommer automatiskt att läggas till efter ditt angivna filnamn (som. 000). Siffran ökas automatiskt med 1 vid varje Sparad skannings repetition.
   8. När skanningen är klar kommer programvarugränssnittet automatiskt att omdirigeras till rampfönstret . Klicka på den skannade bilden för att ange positionerna som ska indraget.
      Anmärkning: Innan du spelar in indrag, är det bättre att välja flera landmärken för att utföra test indragningar genom att klicka ramp endast, i fall parametern Alternerings krävs (för ramp storlek, piezo position, etc.). Indrag djupet måste vara större än cell Väggs tjockleken (helst bestäms separat av transmissionselektronmikroskopi).
   9. Välj minst tre indrags platser per cell nära dess barycenter och upprepa indrag tre gånger per webbplats. Detta skulle ge minst nio kraft kurvor per cell för vidare analys. När du är nöjd med placeringen av indenteringen klickar du på ramp och Capture. Kraft indrags kurvor sparas automatiskt i den angivna katalogen.
   10. När ramperna är slutförda, flytta till en annan position för kakel mätning, eller dra tillbaka Scan Head och ändra prov.
   11. När du är klar, rengör grenställ som i steg 1.3.8 och 1.3.9.
4. Data analys
   1. Öppna filen *. MCA i analysprogram varan. Detta visar positionen för varje kraft kurva på den skannade bilden. Om så önskas, pre-Select kraft kurvor för analys.
   2. Öppna en kraft kurva som ska analyseras, vanligtvis i formatet x0000y. 00Z, där x är det angivna filnamnet i Spara katalog medan y och z är automatiskt registrerade nummer som betecknar indrag sekvens och Scan Number.
   3. Klicka på knappen baslinjekorrigering och dra de blå streck linjerna på kraft kurvan tills utöka källans Originalplans start och Förläng källans baslinje stopp är 0% respektive 80%. Klicka på Kör.
      Anmärkning: Alternativt kan utöka källa baslinje stopp anges till olika värden, så länge det fortfarande är inom baslinjen och inte utanför kontaktpunkten.
   4. Klicka på knappen Boxcar filter och klicka på utför för att utjämna kraft kurvan.
   5. Klicka på knappen indrag .
      1. I inmatnings fönstret anger du att den aktiva kurvan ska utökas.
      2. Ställ in Fit-metoden på linearized-modellen och Inkludera vidhäftningskraft till Ja.
      3. Ställ in Max Force Fit-gränsen på 99% och min Force Fit-gräns till 75%.
      4. Ställ in fit modell på styvhet (linjär).
         Anmärkning: Denna inställning kommer att beräkna den skenbara styvheten k för saft tryck avdrag. I det här exemplet återspeglar passform gränserna en styvhet på runt 1,5 μm indenteringdjup.
   6. Kraft kurvor kan analyseras i batch. Klicka på knappen körhistorik , ange rapportkatalog och Lägg till alla andra kraft kurvor som kräver samma behandling. När du är nöjd klickar du på Kör. Som standard kommer passformen att lagras som en *. txt-fil.
   7. När k är batch monterad klickar du på Historik → 5 indrag för att återgå till indenteringfönstret.
      1. Ändra Max Force Fit-gränsen till 10% och min Force Fit-gränsen till 0%.
      2. Ställ in passform modell till hertzian (sfäriska).
         Obs: detta kommer att beräkna cell Wall Youngs Modulus E för saft tryck avdrag. I det här exemplet återspeglar passa gränserna en hertzian Fit (med sfäriska sond) på cirka 0,4 μm indrag djup.
   8. Upprepa steg 2.4.6 för satsvis passning för E.
   9. Öppna *. 00Z-filen (z är det automatiskt registrerade skannings numret) för att visa de olika skannings kanalerna. I fönstret höjd kanal klickar du på avsnitts knappen. Detta kommer att möjliggöra mätning av provets yta krökning som krävs för saft tryck avdrag.
      1. Rita en linje över den långa axeln i en cell, flytta streck linjens gränser till cellkanterna och registrera Radievärdet r₁. Upprepa detta för den korta axeln för att hämta RADIUS r₂. Beräkna cellens yta medel krökning κ_M och Gaussian krökning κ_G med hjälp av två radier mätning enligt följande:
         Och 
   10. Härleda saft tryck P med tunna skal modellen publicerad⁹ enligt följande:
        
       Med
       
       där t är cell Väggs tjockleken bestäms av t ex elektronmikroskopi.
       Anmärkning: Avdrag för saft trycket är en passande process, där iterationer krävs. Fyra iterationer kan i allmänhet återge en stabil produkt, men fler iterationer går att göra (till exempel 100 gånger).
   11. Beräkna medelvärde E, k och P per cell. Registrera också den intracellulära variationen (t. ex. standardavvikelse) för dokumentation.

Representative Results

Figur 1a och figur 1b visar en skärmdump som illustrerar resultatet av stegen 1.3.4 till 1.3.6 i protokollet, som används för att lokalisera en region av intresse där att förvärva Qi kartan. Det är värt att nämna att regionen av intresse har valts för att inte vara på en lutande yta (dvs. så platt som möjligt). Faktiskt, som märkte av Routier et al.⁵, om indenteringen axeln inte är vinkelrät mot ytan, den unge Modulus mätt kan underskattas. Denna effekt syns i det övre högra hörnet på C-eller D-panelerna i figur 1, där en del av cellernas kant ser mjukare ut än resten av cellen. De artefakter som induceras av denna effekt kommer att vara mycket starkare när det gäller meristems, där den lokala lutningsvinkeln lätt kan övervinna 40 ° över 50 x 50 μm² skanningsområden. I vårt laboratorium utvecklar vi för närvarande en algoritm, baserad på den metod som beskrivs av Routier et al.⁵, för att korrigera dessa artefakter (papper under utarbetande). Figur 1c och figur 1d visar Youngs Modulus-kartor som erhållits efter den analys som beskrivs i protokollets fjärde stycke. I synnerhet representerar panel C den unge Modulus erhålls analysera hela indraget, upp till den användardefinierade kraft börvärde, medan panel D visar resultatet av analysen av den första 100 nm indraget (som beskrivs i steg 1.4.9). Här, de 2 kartorna ser mycket lika, eftersom under experiment set-up, börvärdet har valts för att få genomsnittliga indrag runt 100 nm. Variationen av den analyserade indenteringen kan ibland leda till bättre Markera exempel heterogen, som kan vara till hjälp för att identifiera platsen eller för att ge information om beteendet hos interna strukturer (t. ex., Costa et al.¹⁰)

Kraft kurvan i figur 2 visar två effekter som är värda att nämnas. Först och främst kan man konstatera att om metoden del av kraft kurvan faktiskt slutar vid börvärdet kraft 500 nN, den nedåtgående spetsen rörelsen håller på att gå, vilket innebär att den slutliga kraft som tillämpas av spetsen är högre än väntat (här 1 000 nN). Detta beror på det faktum att feedbackslingan övervakning av grenställ deformationen inte agera omedelbart, så dess ändliga reaktionstid introducerar en fördröjning mellan avböjning tröskel detektering och piezo rörelse stopp. Dessutom, särskilt när du använder CellHesion som flyttar provhållaren, kommer trögheten hos de rörliga delarna i spel, vilket gör att denna tid blir längre. Denna fråga kan begränsas genom att använda huvudet piezo, i vilket fall användaren måste vara riktigt försiktig när det gäller mätningar på mycket grov eller lutande prover, eller genom att minska rampens hastighet, som ändå begränsar upplösningen och/eller antalet prover skannas ( Dessutom för alltför långsamma kartor, urvalet växer kan bli ett problem). I allmänhet, om kraft kurvorna är tillräckligt långt från varandra (baserat på indrags modellen val, kan radien för det indenterade området beräknas med tanke på indrag djupet och används som minsta separationsavstånd), mätningarna utförs i olika positioner längs provet bör inte korreleras och om analysen utförs på metoden kurvan, övervinna kraft tröskeln bör inte vara ett problem. Hur som helst, om provet är delikat eller om upprepade skanningar görs på samma område, kan vetenskapsmannen vill försöka minimera denna överskridandet. Tyvärr finns det inte en tumregel för att bestämma mängden av denna överskridandet, eftersom det beror på piezo används, på rampen hastigheter, men också på materialegenskaper: styvare materialet, desto snabbare variation av deformationen signalen i tid och , med tanke på en ändlig återkoppling responstid, desto högre överskridandet.

Den andra saken att märka är att vinka på dra tillbaka kurvan lyfts fram av ellipsen. Sådana viftande kan vara en indikator på provet flyttar/vibrerar under verkan av spetsen. I detta fall kan användaren försöka ändra det skannade området (ibland andra delen av mikroskopet, men spetsen kan röra provet, eller provet kan vara otillräckligt fixerade till sitt stöd) eller provet om flera av dem har utarbetats på samma stöd. Om funktionen är alltid där, är det bättre att ändra fixeringsmetoden, i detta fall byta från dubbelhäftande tejp fixering till biokompatibla lim.

Figur 3 visar fastställandet av nyckelparametrar för saft tryck avdrag. Varje parameter, med undantag för cell Väggs tjock lek¹¹ som var separat bestäms av elektronmikroskopi vara ~ 740 nm, kan hämtas från AFM skanningar och indragningar. Efter montering processen i steg 2.4.10, är saft trycket härledas till 1,50 MPa för denna kraft kurva. Poolning av alla arton kraft kurvor i denna cell ger medelvärdena E = 6,77 ± 1,02 MPA, k = 14,18 ± 2,45 N/m och P = 1,45 ± 0,29 MPa (medelvärde ± standardavvikelse).

Figur 1 : Topografikartor (uppmätt höjd) som vanligtvis förvärvas under ett experiment. (A) en första lågupplöst/låg kraft karta registreras för att hitta en lämplig region att skanna. (B) en mindre högupplöst/högre kraft karta förvärvas för beräkning av Youngs modulus (på det område som lyfts fram av den svarta prickade kvadraten). C) de Modulus-kartor för unga som beräknats på B-kartan, enligt beskrivningen i steg 1,4. Här har den unge Modulus karta erhållits analysera hela indrag på varje kraft kurva. D) Youngs Modulus Map erhålls analysera endast den första 100 nm indraget. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Exempel på Force Curve. I blått närma sig, i rött dra tillbaka segmentera. Styrka maximum (lokaliserat på dra tillbaka kurvan) är olik från styrka börvärde på grund av ändlig feedback ögla reaktionstiden och på grund av trögheten. Den vinka i dra tillbaka kurvan kan vara representativa för en brist i provet fixering till dess stöd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : AFM mätningar för saft tryck avdrag. (A) DMT Modulus karta visar Clear cell Contour att övervaka placeringen av djup-indentation platser nära cell barycenter. Indenteringssajter markeras med kors. (B) kraft kurva för djup inbuktning vid Röda korset position i A. Cell Wall Youngs Modulus E (grön) och prov skenbar styvhet k (röd) monteras på olika regimer av kurvan som beskrivs i steg 2,4. R ² betecknar koefficienten för bestämning av passformar. C) höjd karta med manuellt fastställda långa och korta axlar av a, avbildade med vita linjer, av samma cell som analyseras i panelerna a och B.D) höjdprofil för de långa och korta axlarna i cellen i panel C (blå, lång axel röd, kort axel) och Fitte d krökningsradie (r₁ och r₂). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Uppkomsten av former i växter bestäms främst av den samordnade takten och riktningen av tillväxten under tid och rum. Växtceller är inneslutna i en styv cell vägg gjord av en polysackarid matris, som livar ihop dem. Som ett resultat, cell expansion styrs av balansen mellan saft tryck dra på cellväggen, och stelhet i cellväggen motstå detta tryck. För att förstå mekanismerna bakom utvecklingen är det viktigt att kunna mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck i olika vävnader eller celler i ett givet organ. Som framgår av detta dokument, AFM är den metod för val i detta sammanhang.

Det finns flera kritiska steg i protokollet. Den första är vävnads beredningen som bör vara snabb nog för att undvika uttorkning. Detta kan vara kritiskt i synnerhet om vi vill mäta saft tryck. Mycket viktigt är också en korrekt fixering av provet till dess substrat: ett instabilt prov kan leda till mycket uppenbara effekter som en makroskopisk rörelse som lätt kan upptäckas optiskt, eller en stark deformation av kraft kurvor. Hur som helst kan prov vibrationer eller böjning vara subtila att upptäcka, införa artefakter i resultaten. Slutligen, ett annat kritiskt steg gäller valet av indenteringsparametrarna. Detta är avgörande för kvaliteten på resultaten.

Vid mätning av mekaniska egenskaper på stora ytor (över 40-50 μm skannings storlekar), höjdskillnader kan vara hög, vilket gör det svårt att korrekt spåra ytan och realisera kraft kurvor utan att nå gränserna för Z piezo Range. För att lösa problemet har en CellHesion-modul använts. Denna modul lägger till en extra Z piezo, som ligger i provet skede, med en 100 μm sortiment, som tillåter stora områden förvärv utan närmar farligt Z piezo gränser.

Den första begränsningen av metoden är att vi bara kan mäta ytliga cellskikt. Men nyligen författare har använt AFM på vävnad avsnitt^12,13,14. Även om detta måste göras på fast material, det kan ge tillgång till mekaniska egenskaper av djupa cellskikt. Alternativt, djupare fördjupningar har också utförts för att dra slutsatser mekaniska egenskaper hos inre vävnader på levande prover, om än med större uppoffringar på rumslig upplösning¹⁵. En andra begränsning kan kopplas till prov geometri, eftersom en yta med brant lutning kan vara problematisk eftersom spetsen inte är mer vinkelrät mot provet. Vi måste begränsa de olika vinklar inom vilka åtgärderna är tillförlitliga och vi håller på att utveckla en algoritm för att korrigera potentiella artefakter kopplade till detta fenomen. Också, vissa vävnader är täckta med trichomes som kan blockera mätningarna. Slutligen mäter indrag mekaniska egenskaper i en vinkelrät riktning när det gäller cellytan och vi kan undra om detta lätt kan kopplas till cellväggen utökningsbarhet i samband med tillväxtkapacitet. Flera studier tyder på att det är fallet^15,16.

Det är värt att göra här en mer allmän observation om mätning/tillämpning av styrkor genom AFM. Som beskrivs i protokollet avsnitt, för att kunna omvandla laser förskjutningar på fotodiod till styrkor, en kalibrering måste utföras. I denna kalibrering en parameter, den deformationskänslighet, gör det möjligt att omvandla laser förskjutningar till faktiska grenställ deformationen (i allmänhet mätt i nm), så denna faktor kalibrerar fotodiod utspänningar (längs de vertikala axlarna) till förskjutningar i Nm. Understödja dela upp i faktorer är fjädra konstanten K, mätt i N/m, som konverterar lodlinje grenställ deformeringar i styrka enheter (allmänt nN), sedan de böjliga cantispakarna uppför något liknande fjädrar. Även om förfarandet verkar enkelt, en robust och reproducerbar kalibrering av K för AFM Force spektroskopi mätningar är fortfarande ett problem, på grund av olika felkällor som kan påverka de olika stegen i förfarandet. Till exempel kan mätningen av deformationen känslighet inser en kraft kurva på en styv yta, leda till felaktiga värden om spetsen glider på ytan, eller om ytan inte är perfekt rengjorda eller även om ytan laddning inducera elektrostatisk avsky. I alla tidigare fall kommer kontakt delen av kraft kurvan att deformeras (ytterligare lutas eller krökt i stället för linjär).

Kontakt proceduren som beskrivs i avsnittet protokoll är bara en av flera befintliga kalibrerings procedurer. Det finns minst 2 fler metoder som kan användas på ett relativt enkelt och billigt sätt: Sader metod (även kallad icke-kontakt när de genomförs i vissa AFM programvara) eller referens grenställ metod. Sader metod¹⁷ har ursprungligen utvecklats av John Sader för V-formade cantispakar och sedan för rektangulära¹⁸ och behöver inte förvärvet av en kraft kurva på ett stelt substrat. I stället måste användaren specificera (ut ur temperaturen som i kontaktmetoden), längden och bredden av grenställ och densiteten och viskositeten hos vätskan där grenställ är (i allmänhet luft, vatten eller en vattenliknande vätskor). Därefter fås ett termiskt Spectrum, och både deformationkänslighet och fjädrar konstanten mätas. Denna metod är fördelaktigt när du använder mycket vassa eller funktionaliserade tips som kan skadas gör en kraft kurva på ett stelt substrat.

Båda de tidigare metoderna relaterar till förvärvet av oscillationsspektrat av en termiskt upphetsad cantilever. När stela cantispakar används vid rumstemperatur, kan medelvärdet svängning amplitud vara lägre än 0,1 Nm, vilket gör resonans toppmindre och svårare att upptäcka. Hur som helst, åtminstone för båda instrumenten som används i detta papper, resonans toppen kan faktiskt detekteras i luft och i vatten och monteras för att mäta vårkonstanten (med tanke på att när mätningen görs i vätska, resonansfrekvens skiftar mot lägre värden och Peak broadens).

En tredje metod använder inte en termisk melodi, utan istället en referens grenställ eller en referens elastisk struktur, med en känd vårkonstant (i allmänhet med en osäkerhet runt eller under 5%), för att bestämma grenställ K. I detta fall måste en första kraft kurva förvärvas på ett styvt substrat för att mäta deformationen känslighet (som kommer igen tillsammans med alla möjliga artefakter som påverkar formen av kurvan). Då ersätts det stela underlaget med referens grenställ (i allmänhet en Tip-less grenställ med en kalibrerad vårkonstant) och en annan (eller några andra) kraft kurva utförs, inspelning igen värdet av avböjning känslighet. Den grenställ våren konstanten beräknas sedan som:

där K_Ref är fjäderkonstanten för referens cantilever, S_Ref den Deformationskänslighet mätt på den, är L dess längd och S_Stiff är deformationen känslighet mätt på den stela Substrat. ΔL är förskjutningen mellan spetsen och änden på referens grenställ och beror på justeringen som görs av användaren och slutligen α är lutningsvinkeln för grenställ, som anges av AFM tillverkaren. Samma metod kan användas på elastiska konstruktioner speciellt konstruerade för grenställ eller källkodsindenterare kalibrering. Fördelen med dessa strukturer (som i allmänhet är cirkulär) är att K i deras centrum är konstant och inte beror på någon geometrisk parameter eller på exakt positionering av AFM spetsen på dem, så ta bort l och Δl från föregående formel.

AFM användaren måste ha i åtanke att alla dessa kalibreringsmetoder påverkas av olika felkällor (avböjning känslighet bestämning i första och tredje, användning av termisk melodi i fråga om stela cantispakar för första och andra och geometriska parametrar och justering för den tredje liksom kalibrerings noggrannheten K_Ref i fallet referens grenställ används) och att kontaktmetoder är potentiellt skadliga för spetsen (särskilt den tredje, där kalibrering innebär användning av två olika prover). Detta innebär att vårkonstanten alltid kommer att bestämmas upp till en viss precision och så kommer att vara den uppmätta/tillämpade krafter (se Sikora¹⁹ för en omfattande översyn av olika kalibreringsmetoder och deras precision. Detta innebär att Youngs moduli-och saft-tryck också kommer att påverkas av grenställ kalibrering. Hur som helst, andra ännu viktigare felkällor är inblandade vid beräkningen av dessa kvantiteter (som användning av förenklade modeller för Youngs Modulus beslutsamhet) så det kommer alltid att vara en utmaning att få absoluta värden av dessa typer av mätningar. Vad som är viktigt är att få värden som är av rätt storleksordning och som är samstämmiga med varandra, vilket innebär att om experimentet upprepas av samma användare på samma prov, bör värdena vara förenliga. För att få det måste kalibreringen göras noggrant, och felkällor måste minimeras (till exempel att begränsa så mycket som möjligen akustisk brus/vibrationer). En möjlig strategi inriktad på att öka samstämmigheten i upprepade kalibreringar har nyligen föreslagits i ett dokument av Schillers et al.²⁰, där man tack vare samarbetet med 11 europeiska laboratorier, ett protokoll (kallat Snap) för att kompensera för fel i bestämning av deflektionskänslighet har utvecklats. I detta dokumentförfattarna använder direkt kalibrerade cantispakar för sina mätningar, i alla fall samma protokoll kan tillämpas på icke-kalibrerade cantispakar, helt enkelt kalibrera dem första gången med den metod för val och sedan med tanke på den första våren konstant som referens värde ("kalibrerat").

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.