Summary
Her presenterer vi Atomic Force mikroskopi (AFM), opererte som en nano-og mikro-innrykk verktøyet på celler og vev. Instrumentet tillater samtidig oppkjøp av 3D overflate topografi av prøven og dens mekaniske egenskaper, inkludert celle veggen Youngs modul så vel som turgor trykk.
Abstract
Vi presenterer her bruk av Atomic Force mikroskopi å rykke plante vev og gjenopprette sine mekaniske egenskaper. Ved hjelp av to forskjellige mikroskop i Innrykks modus viser vi hvordan man måler en elastisk modul og bruker den til å evaluere mekaniske egenskaper for celle veggen. I tillegg forklarer vi også hvordan man evaluerer turgor trykk. De viktigste fordelene med Atomic Force mikroskopi er at det er ikke-invasiv, relativt rask (5 ~ 20 min), og at nesten alle typer levende plante vev som er overfladisk flat kan analyseres uten behov for behandling. Oppløsningen kan være veldig god, avhengig av spissen størrelse og på antall målinger per enhet området. En begrensning av denne metoden er at den bare gir direkte tilgang til det overfladiske celle laget.
Introduction
Atomic Force mikroskopi (AFM) tilhører skanning sonde mikroskopi (SPM) familie, der et tips med en radius av vanligvis noen nanometer skanner overflaten av en prøve. Påvisning av en overflate er ikke oppnådd via optiske eller elektron-baserte metoder, men via samspillet krefter mellom spissen og prøven overflaten. Dermed er denne teknikken ikke begrenset til topografisk karakterisering av en prøve overflate (3D-oppløsning som kan gå ned til noen få nanometer), men også tillater måling av alle typer interaksjon styrker som elektrostatisk, Van der Waals eller kontakt krefter. Videre kan spissen brukes til å anvende styrker på overflaten av en biologisk prøve og måle den resulterende deformasjon, den såkalte "innrykk", for å bestemme dens mekaniske egenskaper (for eksempel Young ' s modul, viskoelastiske egenskaper).
Mekaniske egenskaper av anlegget celle vegger er viktig å bli tatt hensyn til når du prøver å forstå mekanismer underliggende utviklingsmessige prosesser1,2,3. Faktisk er disse egenskapene strengt kontrollert under utvikling, spesielt siden celle veggen mykgjørende er nødvendig for å tillate cellene å vokse. AFM kan brukes til å måle disse egenskapene og studere hvordan de skifter mellom organer, vev eller utviklingsmessige stadier.
I denne utredningen, beskriver vi hvordan vi bruker AFM å måle både celle veggen mekaniske egenskaper og turgor trykk. Disse to programmene er demonstrert på to forskjellige AFM mikroskop og er detaljert her etter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mål av Cell Wall mekaniske egenskaper
Merk: Eksempel på utvikling gynoecium av Arabidopsis presenteres.
- Utarbeidelse av biologiske prøver
- Samle en lukket blomst knopp på trinn 9 til 10 (ca 0,5 mm lang) i henhold til publiserte stadier bestemmelse for Arabidopsis4. Under en kikkert, ved hjelp av fin pinsett, forsiktig åpne knopp for å sjekke utviklingstrinn og samle gynoecium som ligger i sentrum av blomsten.
- Sett gynoecium på dobbel side tape plassert i midten av dekselet av en liten Petri parabolen (diameter på 5 cm).
Merk: Som et alternativ kan biokompatible lim også brukes til mer effektiv immobilisering av prøven ved innrykk. - Legg til vann raskt til prøven er fullstendig tildekket. Dette unngår dehydrering og reduserer vedheft av spissen til prøven. Alternativt kan du senke prøven i flytende medium, for eksempel Arabidopsis Apex Culture medium5.
- AFM kalibrering
- Sett cantilever fjær konstant k høy nok til å tillate deformasjon av prøven overflaten opp til ønsket innrykk, men ikke for høy til å unngå tap av følsomhet.
Merk: Som en grov tommelfingerregel, hvis unge ' s modul av prøven er kjent, rekkefølgen av omfanget av våren konstant kan velges som k≈E * δ, der δ er ønsket innrykk. - Bruk en R = 400 nm sfærisk-endte spiss med 15 μm tip-cantilever avstand.
Merk: Spissen radius er direkte relatert til lateral oppløsning. Vanligvis, for innrykk på biologiske materialer, Velg avrundet tips (R større enn 10-20 NM) eller kolloidalt sonder. Små kolloidalt sonder kan være vanskelig å bruke på grunn av den lille avstanden mellom tuppen enden og cantilever som kan berøre prøven overflaten. - Slå på programvaren og plasser hodet horisontalt minst 2-3 h før eksperimentet: Dette vil tillate hodet å thermalize og vil unngå termisk-indusert cantilever-laser relative bevegelser. Hvis mikroskopet er utstyrt med en CellHesion-modul (som utvider det tilgjengelige Z piezo-området til 100 μm i stedet for 15 μm), må du slå på kontrolleren først og deretter velge CellHesion-modus når du starter programvaren.
- Monter cantilever på glass blokken og Monter blokken på hodet. Plasser en dråpe av et par mikroliter av ultrarent vann på spissen for å unngå dannelse av luftbobler når spissen er dyppet i vann.
- Plasser en hard prøve (renset glass Slide eller safir) og tilsett 30-50 μL av ultrarent vann.
Merk: Kalibreringsprosedyren som beskrives her, er den noen ganger såkalte kontakt kalibreringen. For det første er en styrke kurve laget på en stiv og flat overflate, og deretter registreres det varme cantilever for å beregne fjær konstanten. Det finnes andre kalibrerings protokoller og vil kort bli beskrevet i diskusjons avsnittet. - Plasser hodet på scenen (pass på å løfte Z-motorene høyt nok). Bruk det optiske bildet til omtrent å plassere laseren på cantilever.
- Flytt laseren langs hoved aksen til cantilever som overvåker sum signalet på PHOTODIODE.
Merk: Når standard utkragning brukes, skal en sum som er større enn 0,5 V, anskaffes. - Flytt laseren langs den andre retningen og Maksimer summen signalet for å posisjonere laseren i midten av cantilever. Dette vil minimere kryss-snakk mellom lateral og vertikal utslag.
- Flytt laseren langs hoved aksen til cantilever som overvåker sum signalet på PHOTODIODE.
- Måling av følsomhet for utslag
Merk: PHOTODIODE leser laser forskyvning og gir et signal i volt. For å kunne måle utslag i metrisk enhet, må det måles følsomhet.- Sett instrumentet i kontakt → Tving spektroskopi. Angi et relativt settpunkt til 2 V , Z-lengde til 0,5 μm, og Utvid hastigheten til 2 μm/s (samplingsfrekvens til 10000 Hz) og velg Z lukket sløyfe.
- Åpne kalibrerings behandleren og velg kontakt delen av kraft kurven (som skal være lineær) for å lage en lineær passform: den inverse av skråningen gir utslag følsomhet. PHOTODIODE avlesning er nå kalibrert i metrisk enhet.
-
Fastsettelse av våren konstant. I kalibrerings behandlingvelger du vår konstant for å kjøre et termisk spektrum oppkjøp. Hvis du vil gjennomsnittlig signal for en lengre tid, velger du ∞-symbolet. Kraft spekteret til de varme spente cantilever kan vise flere topper; tegn en markering rundt den som er plassert på laveste frekvens for å passe den.
Merk: Hvis termisk melodi er utført i væske, vil resonans peak være bredere og dens frekvens senket i forhold til nominell en.
- Sett cantilever fjær konstant k høy nok til å tillate deformasjon av prøven overflaten opp til ønsket innrykk, men ikke for høy til å unngå tap av følsomhet.
- Fremtving oppsett og anskaffelse av spektroskopi eksperiment
- Plasser prøven på AFM scenen og plassere hodet over prøven.
Merk: Pass på at hodet har blitt trukket tilbake nok til å unngå en vanskelig kontakt mellom spissen og prøveoverflaten. - La cantilever thermalize i noen minutter.
- I Qi Mode, tilnærming med et settpunkt styrke på 50 nn.
- Sett en Z lengde på 4 μm og et skanneområde til 80 x 80 μm2 med en rekke piksler på 40 x 40. I panelet avanserte bildeinnstillinger setter du modusen til konstant hastighet. Sett forlenge og trekke tilbake hastigheten til 200 μm/s og sample priser til 25 kHz.
- Start skanningen, og bruk denne raske skanningen med lav styrke til å kontrollere om prøven beveger seg. Kontroller at det skannede området er fri for rusk eller forandret retning celler og finne en region av interesse så flatt som mulig for å utføre målingene.
Merk: For å verdsette den virkelige prøven Tilt, linjen nivellering bør settes til av eller til konstant. En overdreven skrå vinkel mellom Innrykks aksen og overflaten vil ha en effekt på den målte Youngs modul5. - Når et område av interesse har blitt funnet, velger du et område på 40 x 40 til 60 x 60 μm2 rundt den og øke piksel nummeret for å nå 2 piksler/μm. Øk settpunkt til 500 nm for å få 100-200 NM i innrykk. Juster om nødvendig denne verdien i begynnelsen av eksperimentet. Reduser Z-lengden til 2 μm. Reduser forlenge og trekke tilbake hastigheten til 100 μm/s og øke samplingsfrekvensen til 50 kHz.
- Start skanning og lagre utdataene (vanligvis komponert av et bilde og en data fil).
- På slutten av målingen dagen, fjerne spissen holderen og skyll den forsiktig med ultrarent vann og 70% EtOH.
- Tørk og fjern cantilever. For ytterligere eksperimenter med samme tupp, bør du vurdere å rengjøre den med en våt rense protokoll og, hvis mulig, en oppfølgings plasma-O2 -behandling. Ikke la vannet tørke på cantilever og/eller spiss holde ren for å unngå salt krystallisering.
- Plasser prøven på AFM scenen og plassere hodet over prøven.
- Dataanalyse (for 6. x data Processing programvareversjon)
- Åpne data Processing programvare og laste inndatafilen.
- Klikk på Bruk dette kartet for satsvis behandling knappen for å bruke de samme analyseparametrene på alle kurvene på kartet.
- Velg Hertz-tilpasningi den forhåndsdefinerte prosessen.
- Bruk den første kategorien til å kontrollere eller endre kalibrerings parametrene.
- I den andre kategorien fjerner du en forskyvning (eller en forskyvning pluss en helling) fra den opprinnelige planen for å sette gjennomsnittsverdien til 0.
- I den tredje kategorien, estimere poenget med kontakt (POC) posisjon ved å vurdere det som det første punktet krysset 0 kraft når kommer ned fra sett verdien langs forlenge kurven.
- Den vertikale spissen på tappen beregner spiss bevegelse ved å trekke cantilever fra høyde målt. På dette trinnet, kan du bruke unsmoothed høyde (rådata) for følgende tilpasning, ved å merke av i tilsvarende avmerkingsboksen.
- I kategorien elastisitet passer , velger du riktig passer modell. Hvis ingen eller svak vedheft er synlig på tilbakekall kurver (tilsvarer mindre enn 10% av innstillings kraften eller den maksimale gjennomsnitts kraften ved den valgte Innrykks dybden), må modelltypen settes til Hertz/Sneddon og forlenge kurven skal brukes. Ved sterkere vedheft bør DMT-modellen, som står for Derjaguin-Muller-Toporov-modellen, foretrekkes og passformen skal utføres på trekk kurver (se bruksanvisningen for detaljer om tilgjengelige kontakt modeller og relaterte formler).
- Angi spiss geometriske parametre basert på nominell tupp form. Her, tips Shape er sfære og tip radius er 400 nm.
- Sett Poisson-tallet til 0,5 som det er konvensjonelt gjort for biologisk materiale (tilsvarende incompressible materiale).
-
Passer opp til spesifikke innrykk. Som standard utføres passformen over hele kurven. Hvis passformen må gjøres opp til et bestemt innrykk, sjekk først SKIFT kurve boksen; Dette vil forskyve opprinnelsen til kurven basert på nylig fastsatte Baseline og POC verdier.
- Legg til en ekstra elastisitet Fit rutine ved å klikke på ikonet i hovedvinduet.
- Sett igjen alle passer parametrene og angi i X min ønsket innrykk. Legg til så mange skritt som nødvendig (2 til 3 trinn bør være nok) for å avgrense fastsettelse av POC posisjon og deretter beregnet innrykk dybde. Prosessen kan lagres på dette punktet.
- Klikk på Behold og gjelder for alle å gjenta de forrige trinnene på alle kurvene på kartet.
- Lagre resultatene. Et bilde og en TSV-filer vil bli innhentet.
2. måling av turgor trykk
Merk: Et eksempel på den oryzalin-behandlede Blomsterstanden meristem av Arabidopsis er presentert.
- Utarbeidelse av biologisk prøve
- Samle Arabidopsis Blomsterstanden meristem (IM) behandlet med mikrotubulinettverket depolymerizing narkotika oryzalin fra in vitro plantlet dyrket på medium som inneholder Polar auxin transport hemmer 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) følgende publisert metode 6i den.
- Montering IM eksempel etter en av de to alternativene
- For langsiktig overvåking: montere prøven i en Petri-parabolen inneholder Arabidopsis Apex kultur medium (ACM)7,8 og 0,1% plante bevaring blanding (ppm), for å hindre forurensning. Suspendere IM spissen over ACM overflaten og støtte basen av IM med en dråpe på 2% agarose.
- For måling med rask løsning endringer: Monter prøven i en Petri-parabolen holder et lite stykke lim mastik, og raskt forsegle gapet mellom mastik og prøven base med bio-kompatible lim. Vent til limet stivne (mindre enn 2 min), deretter Senk prøven i flytende ACM som inneholder 0,1% PPM.
Merk: Pass på at prøve flaten ikke er belagt med agarose eller lim ved festing av prøve basen. AFM måling av turgor trykk krever at prøven skal være stabilt montert, og de tidligere monterings metodene gir akseptabel stabilitet. Avhengig av prøven, kan andre monteringsmetoder brukes, som dobbeltsidig tape, Poly-lysin, etc.
- AFM kalibrering
- Slå på AFM oppkjøpet programvare og velge PEAKFORCE QNM (stor amplitude) måle modus.
- Utfør kalibrering etter samme prinsipp beskrevet i trinn 2,1 til 2,6.
- Inne sjekken parameterene vindu, sette avsøke størrelse å 0. I rampe vinduet, sett rampe størrelse mellom 200 NM og 500 NM, Trig terskel mellom 2 v og 5 v og antall prøver til 2048 eller høyere.
- Juster cantilever spissen med kalibrerings prøven og klikk tilnærmingen.
- Ved kontakt, gå til ramp vinduet og klikk på knappen kontinuerlig rampen. På kurven er lineær regime, bestemme skråningen ved å klikke på Oppdater følsomhet knappen. Gjenta målingen følsomhet måling flere ganger og manuelt oppdatere kalibreringen med målingen gjennomsnittet ved å åpne tab Detector fra menyen kalibrering.
- Trekk tilbake til AFM-hodet og fjern kalibrerings prøven.
Merk: Det foreslås å helt trekke AFM hodet ved å velge kategorien Stage → Initialiser for å hindre utilsiktet hard kontakt ved prøve endring.
- Fremtving oppsett og anskaffelse av spektroskopi eksperiment
- Hvis prøven ikke senkes ennå, Senk den med flytende ACM som inneholder PPM.
- I anskaffelses programvaren angir du målings parametere på følgende måte:
- Inne Sjekk parameter vindu, sette fjær bestandig å det cantilever ' fabrikasjon fjær bestandig eller det besluttet vår bestandig idet i takt 2,8. I dette eksempelet er det satt til 42 N/m.
- Sett tips radius til 400 nm i dette eksempelet.
- Sett sample Poisson ' s forhold til 0,5, siden vann bidrar hovedsakelig til turgor trykk.
- Sett prøve/linje til 128 for å sikre rask anskaffelse.
- Sett skannehastighet til 0,2 Hz.
- Sett skannestørrelse til 1 μm.
Merk: Innstilling skannehastighet og skannestørrelse små kan effektivt hindre AFM skanning utløst prøveskade. Det anbefales å redusere disse to parametrene ved enhver prøve endring. - I rampe vindu, sett rampe størrelse til 5 μm.
Merk: Det er bedre å sette rampen størrelse større enn beregnet innrykk dybde for bedre Baseline oppkjøpet. - Sett Trig terskelen til maksimum.
- Angi antall prøver til 4608.
- Alternativt, i mikroskop → engasjements parametre , reduserer du følgende parametre for å forhindre sterk kontakt indusert prøveskade. Sett peak Force engasjere punktverdien til 0,3 v (standard 0,5 v). Sett engasjere int. Gain til 0,5 (standard 0,75). Sett spm engasjere seg trinn til 4 μm (standard 15 μm).
- Plasser og justere prøven under AFM hodet, og tilnærming til cantilever er neddykket, men ikke i kontakt med prøven overflaten.
Merk: Mens du nærmer deg, blåser du lett på overflaten av flytende ACM til en flytende bro dannes mellom cantilever og væskeoverflaten. Dette hindrer vanligvis hard kontakt. - Med forsiktighet, tilnærming manuelt mot prøven. Når sonden er relativt nær prøve overflate, klikker du tilnærming.
- Ved kontakt gradvis øke skannestørrelse og/eller skannehastighet til en ønsket balanse uten å skade prøven og/eller cantilever.
Merk: Skannestørrelsen er begrenset av overflaten krumning og ujevnheter i prøven. I tilfelle av oryzalin-behandlet IM, 50 x 50 μm2 Scan området kan oppnås med skannehastighet på 0,3 Hz. - Når du skanner, bør du finne ut om måleområdet er som ønsket. Flytt om nødvendig. Når fornøyd, klikker du på knappen pek og skyt for å starte pek og skyt vinduet.
- Før du registrerer skanningen, må du velge en passende bilde kanal som kan gjøre det lettere å identifisere celle konturer. Ofte er peak Force Error, DMT modul, LogDMT modul eller spredning egnet. Angi lagringsmappe og filnavn. Deretter klikker du på rampe ved neste skanning for å starte opptaket.
Merk: En streng med et punktum og tre tall vil automatisk bli lagt til etter det angitte filnavnet (for eksempel 000). Dette tallet øker automatisk med 1 ved hver lagrede skanning repetisjon. - Når skanningen er fullført, vil programvaregrensesnittet automatisk bli omdirigert til ramp window. Klikk på det skannede bildet for å angi posisjonene som skal rykkes inn.
Merk: Før du registrerer innrykk, er det bedre å velge flere landemerker for å utføre test innrykk ved bare å klikke på rampe, i tilfelle parameter veksling kreves (for rampe størrelse, piezo posisjonosv.). Innrykks dybden må være større enn cellevegg tykkelsen (ideelt bestemt separat ved overføring elektron mikroskopi). - Velg minst tre Innrykks områder per celle i nærheten av barysenter, og gjenta innrykk tre ganger per område. Dette ville gi minst ni Force kurver per celle for videre analyse. Når fornøyd med innrykk nettsted plassering, klikk ramp og fangst. Innrykks kurvene lagres automatisk i den angitte mappen.
- Når ramper er ferdig, flytte til en annen posisjon for flis måling, eller tilbakekalle skannehodet og endre prøven.
- Når du er ferdig, rengjør du cantilever som i trinn 1.3.8 og 1.3.9.
- Data analyse
- Åpne *. MCA-filen i analyseprogramvaren. Dette viser posisjonen til hver kraft kurve på det skannede bildet. Hvis ønskelig, forhånds Velg styrke kurver for analyse.
- Åpen ettall Force kurven å bli analysert, vanligvis inne formatet av x0000y. 00z, der hvor x er det spesifiserte arkiv navnet inne det bevare adresseliste stund y og z er automatisk registrert numrene betegner innrykk orden og avsøke antallet.
- Klikk knappen grunnlinje korrigering , og dra de blå strek linjene på styrke kurven til Utvid kilde planlagt start og Utvid kilde grunnlinje stopp er ved henholdsvis 0% og 80%. Klikk Kjør.
Merk: Alternativt kan Utvid kilde Baseline stopp settes til forskjellige verdier, så lenge det er fortsatt innenfor den opprinnelige planen, og ikke utenfor kontaktpunktet. - Klikk på Boxcar filter knappen og klikk Execute å glatte Force kurve.
- Klikk inn Rykk knappen.
- Angi den aktive kurven som skal utvides, i inn data vinduet.
- Sett Fit metode til linearized modell og inkluderer vedheft kraft til Ja.
- Sett Max Force Fit grensen til 99% og min Force fit grensen til 75%.
- Sett passform modell til stivhet (lineær).
Merk: Dette oppsettet vil beregne den tilsynelatende stivhet k for turgor trykk fradrag. I dette eksempelet reflekterer passform grensene en stivhet tilpasning på rundt 1,5 μm innrykk dybde.
- Force kurver kan analyseres i batch. Klikk Kjør historikk -knappen, angi rapport katalog og Legg til alle andre kraft kurver som krever samme behandling. Klikk Kjørnår du er fornøyd. Som standard vil passformen bli lagret som en *. txt-fil.
- Når k er montert satsvis, klikker du på historikk → 5 innrykk for å gå tilbake til Innrykks vinduet.
- Endre Maks kraft Fit grensen til 10% og min kraft Fit grensen til 0%.
- Sett Fit-modell til Hertzian (sfærisk).
Merk: Dette vil beregne celle veggen Youngs modul E for turgor trykk fradrag. I dette eksempelet reflekterer passe grensene en Hertzian passform (ved hjelp av sfærisk sonde) på rundt 0,4 μm Innrykks dybde.
- Gjenta trinn 2.4.6 for satsvis tilpassing for E.
- Åpne *. 00z-filen (z er det automatisk registrerte skanne nummeret) for å vise de ulike skanne kanalene. Klikk på inndelings knapp i vinduet høyde kanal. Dette gjør at målingen av prøve overflate krumning er nødvendig for turgor trykk fradrag.
- Tegn en linje på tvers av den lange aksen i én celle, Flytt strek linje grensene til celle kantene, og noter radius verdien r1. Gjenta dette for den korte aksen for å hente radius r2. Beregn cellenes overflate gjennomsnittlig krumning ĸM og Gaussian krumning ĸG med de to radier målingen som følger:
Og
- Tegn en linje på tvers av den lange aksen i én celle, Flytt strek linje grensene til celle kantene, og noter radius verdien r1. Gjenta dette for den korte aksen for å hente radius r2. Beregn cellenes overflate gjennomsnittlig krumning ĸM og Gaussian krumning ĸG med de to radier målingen som følger:
- Utlede turgor trykk P bruke tynn-Shell-modellen publisert9 som følger:
Med
der t er cellevegg tykkelse bestemmes av f. eks elektron mikroskopi.
Merk: Fradraget for turgor trykk er en tilpasnings prosess der det kreves gjentakelser. Fire gjentakelser er vanligvis i stand til å reprodusere stabilt produkt, men flere gjentakelser kan gjøres (for eksempel 100 ganger). - Beregn gjennomsnitt E, k og P per celle. Registrer også intracellulære variasjon (f.eks. standardavvik) for dokumentasjon.
Og
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a og figur 1B viser et skjermbilde som illustrerer resultatet av trinnene 1.3.4 til 1.3.6 av protokollen, brukes til å finne en region av interesse hvor å erverve Qi kartet. Det er verdt å nevne at den regionen av interesse har blitt valgt for ikke å være på en skråstilt overflate (dvs. så flat som mulig). Egentlig, som lagt merke til av routier et al.5, hvis Innrykks aksen ikke er vinkelrett på overflaten, Young ' s modul målt kan undervurderes. Denne effekten er synlig i øvre høyre hjørne av C-eller D-panelene i figur 1, der en del av cellens kantlinje ser mykere ut enn resten av cellen. Gjenstandene indusert av denne effekten vil være langt sterkere i tilfelle av meristems, der den lokale vippe vinkelen lett kan overvinne 40 ° over 50 x 50 μm2 skanneområder. I laboratoriet vårt utvikler vi for tiden en algoritme basert på tilnærmingen beskrevet av routier et al.5, for å korrigere disse gjenstandene (papir i forberedelse). Figur 1C og figur 1d viser Young ' s modul kart innhentet etter analysen beskrevet i fjerde ledd av protokollen. Spesielt representerer panel C Young ' s modul innhentet analysere hele innrykk, opp til den brukerdefinerte styrken settpunkt, mens panel D viser resultatet av analysen av de første 100 NM av innrykk (som beskrevet i trinn 1.4.9). Her ser de 2 kartene svært like ut, fordi under eksperimentoppsettet er sett valget valgt for å oppnå gjennomsnittlig innrykk rundt 100 NM. Variasjonen av analysert innrykk kan noen ganger føre til bedre markere sample heterogeniteter, som kan være nyttig for å identifisere plasseringen eller for å gi informasjon om atferden til interne strukturer (f. eks Costa et al.10)
Kraften kurve i figur 2 viser to effekter som er verdt å nevne. Først av alt, kan det bli lagt merke til at hvis tilnærmingen del av styrken kurven faktisk ender på sett kraft av 500 nN, den nedadgående spissen bevegelsen holder på å gå, noe som betyr at den endelige kraften som brukes av spissen er høyere enn forventet (her 1 000 nN). Dette skyldes det faktum at feedback loop overvåking av cantilever utslag ikke handle umiddelbart, så den begrensede reaksjonstiden introduserer et lag mellom utslag terskel deteksjon og piezo bevegelse stoppe. Videre, spesielt når du bruker CellHesion som beveger prøven holderen, treghet i bevegelige deler kommer inn i bildet, noe som gjør denne gangen lag lenger. Dette problemet kan begrenses ved hjelp av hodet piezo, i så fall brukeren må være veldig forsiktig i tilfelle av målinger på svært grov eller skråstilt prøver, eller ved å redusere rampen hastighet, noe som likevel begrenser oppløsningen og/eller antall prøver skannet ( videre for langsom kart, kan prøven vokser bli et problem). Generelt, hvis kraften kurvene er langt nok fra hverandre (basert på innrykk modell av valget, kan radius av det innrykkede området beregnes gitt innrykk dybden og brukes som minimum avstands avstand), målingene utført i ulike posisjoner langs prøven bør ikke være korrelert og hvis analysen er utført på tilnærming kurve, overvinne styrken terskelen bør ikke være et problem. Uansett, hvis prøven er delikat eller hvis gjentatte skanninger er gjort på samme område, kan forskeren ønsker å prøve å minimere denne overshoot. Dessverre er det ikke en tommelfingerregel å bestemme mengden av denne overshoot, siden det avhenger av piezo som brukes, på rampen hastigheter, men også på materielle egenskaper: den stivere materialet, jo raskere variasjonen av utslag signal i tid og , gitt en begrenset responstid for tilbakemelding, jo høyere overshoot.
Den andre tingen å legge merke til er det vinket på tilbakekall kurve uthevet av ellipsen. Slike vinker kan være en indikator på prøven flytting/vibrerende under handlingen av spissen. I dette tilfellet, kan brukeren prøve å endre det skannede området (noen ganger andre deler av mikroskopet, men spissen kan berøre prøven, eller prøven kan være utilstrekkelig godt festet til sin støtte) eller prøven hvis flere av dem har blitt utarbeidet på samme støtte. Hvis funksjonen er alltid der, er det bedre å endre fiksering metoden, i dette tilfellet bytter fra dobbeltsidig tape fiksering til biokompatible lim.
Figur 3 viser fastsettelse av nøkkelparametre for turgor trykk fradrag. Hver parameter, med unntak av cellevegg tykkelse11 som ble separat bestemmes av elektron mikroskopi å være ~ 740 NM, kan hentes fra AFM skanninger og fordypninger. Etter tilpasningsprosessen i trinn 2.4.10, er det turgor trykket utledet til å være 1,50 MPa for denne kraft kurven. Pooling alle atten makt kurver i denne cellen gir gjennomsnittlige verdier av E = 6,77 ± 1,02 MPA, k = 14,18 ± 2,45 N/m og P = 1,45 ± 0,29 MPA (gjennomsnitt ± standardavvik).
Figur 1 : Topografi kart (høyde målt) vanligvis ervervet under et eksperiment. (A) en første lav oppløsning/lav styrke kartet er registrert for å finne et egnet område for å skanne. (B) en mindre høy oppløsning/høyere makt kart er ervervet for beregning av Young ' s modul (på området markert med den svarte stiplede firkanten). (C) Youngs modul kart beregnet fra B-kart, som beskrevet i trinn 1,4. Her har Young ' s modul kartet er innhentet analysere hele innrykk på hver styrke kurve. (D) Young ' s modul kart innhentet analysere bare de første 100 NM av innrykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempel på kraft kurve. I blått tilnærmingen, i rødt trekke segmentet. Force maksimum (plassert på tilbakekall kurve) er forskjellig fra styrken settpunkt på grunn av begrenset feedback loop reaksjonstid og på grunn av treghet. Den vinket i trekke kurve kan være representativt for en mangel i prøve fiksering til sin støtte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : AFM målinger for turgor trykk fradrag. (A) DMT modul kart viser klar celle kontur for å overvåke plasseringen av dyp-Innrykks nettsteder nær celle barysenter. Innrykk nettsteder er preget av kors. (B) Force kurve av dyp fordypning på det røde korset posisjon i A. Cell Wall Youngs modul E (grønn) og prøve tilsynelatende stivhet k (rød) er montert på ulike regimer av kurven som beskrevet i trinn 2,4. R 2 betegner koeffisient av bestemmelse av anfall. (C) høyde kart med manuelt fastsatte lange og korte akser av en, avbildet av hvite linjer, av samme celle analysert i panelene a og B. (D) høydeprofil av lange og korte akser i cellen i panel C (blå, lang akse rød, kort akse) og d radier av krumning (r1 og r2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremveksten av former i planter er i hovedsak bestemt av koordinert hastighet og retning av vekst i tid og rom. Plant celler er innkapslet i en stiv cellevegg laget av en polysaccharidic matrise, som lim dem sammen. Som et resultat, er celle ekspansjon styres av likevekt mellom turgor trykk trekke på celle veggen, og stivhet av celle veggen motstå dette presset. For å forstå mekanismene underliggende utvikling, er det viktig å kunne måle både celle veggen mekaniske egenskaper samt turgor trykk i ulike vev eller celler av et gitt organ. Som demonstrert i dette papiret, AFM er metoden for valg i denne sammenhengen.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. Den første er vevet forberedelse som bør være rask nok til å unngå dehydrering. Dette kan være avgjørende spesielt hvis vi ønsker å måle turgor trykk. Svært viktig er også en riktig fiksering av prøven til underlaget sitt: en ustabil prøve kan føre til svært åpenbare effekter som en makroskopisk bevegelse som lett kan oppdages optisk, eller en sterk deformasjon av makt kurver. Uansett, prøve vibrasjon eller bøying kan være subtile å oppdage, innføre gjenstander inn i resultatene. Til slutt, en annen kritisk trinn gjelder valget av innrykk parametere. Dette er avgjørende for kvaliteten på resultatene.
Ved måling av mekaniske egenskaper på store områder (over 40-50 μm skanne størrelser) kan høydeforskjellene være høye, noe som gjør det vanskelig å spore overflaten og realisere styrke kurvene uten å nå grensene for Z-piezo rekkevidde. For å løse dette problemet har en CellHesion-modul blitt brukt. Denne modulen legger til en ekstra Z-piezo, som ligger i prøvefasen, som har en 100 μm-serie, som tillater oppkjøp av store områder uten å nærme seg farlig Z-piezo grenser.
Den første begrensningen av metoden er at vi bare kan måle overfladiske celle lag. Men nylig forfatterne har brukt AFM på vev seksjoner12,13,14. Selv om dette må gjøres på fast materiale, kan det gi tilgang til mekaniske egenskaper av dype celle lag. Alternativt, dypere fordypninger har også blitt utført for å antyde mekaniske egenskaper av indre vev på levende prøver, men med større offer på romlig oppløsning15. En annen begrensning kan knyttes til prøve geometri, som en overflate med en bratt skråning kan være problematisk siden spissen er ikke mer vinkelrett på prøven. Vi må begrense omfanget av vinkler innenfor hvilke tiltak er pålitelige og vi utvikler for tiden en algoritme for å korrigere potensielle gjenstander knyttet til dette fenomenet. Dessuten er noen vev dekket med trichomes som kan blokkere målingene. Endelig innrykk måler mekaniske egenskaper i en vinkelrett retning om celleoverflaten, og vi kan lure på om dette lett kan knyttes til cellevegg utvidelsesmuligheter knyttet til vekst kapasitet. Flere studier tyder på at det er tilfellet15,16.
Det er verdt å gjøre her en mer generell observasjon om måling/anvendelse av krefter ved AFM. Som beskrevet i protokollen delen, for å kunne transformere laser forskyvninger på PHOTODIODE til krefter, en kalibrering må utføres. I denne kalibreringen en parameter, den utslag følsomhet, gjør det mulig å konvertere laser forskyvninger til faktiske cantilever utslag (vanligvis målt i NM), så denne faktoren kalibrerer PHOTODIODE output spenninger (langs vertikale akser) til forskyvninger i Nm. Den andre faktoren er våren konstant K, målt i N/m, som konverterer vertikale cantilever krengingen i kraft enheter (vanligvis nN), siden de fleksible utkragning oppfører seg som fjærer. Selv om prosedyren vises enkel, en robust og reproduserbar kalibrering av K for AFM Force spektroskopi målinger er fortsatt et problem, på grunn av forskjellige feilkilder som kan påvirke de ulike trinnene i prosedyren. For eksempel kan målingen av bøye følsomhet realisere en kraft kurve på en stiv overflate, føre til uriktige verdier hvis spissen glir på overflaten, eller hvis overflaten ikke er helt rengjort eller også hvis overflate ladning induserer elektrostatisk frastøting. I alle tidligere tilfeller vil kontakt delen av kraft kurven bli deformert (videre vippet eller buet i stedet for lineær).
Kontakt prosedyren som er beskrevet i protokoll delen, er bare én av flere eksisterende kalibreringsprosedyrer. Det er minst 2 flere metoder som kan brukes på en relativt enkel og rimelig måte: den Sader metoden (også kalt ikke-kontakt når implementert i noen AFM programvare) eller referanse cantilever metoden. Sader metode17 har opprinnelig blitt utviklet av John Sader for V-formet utkragning og deretter for rektangulære de18 og trenger ikke oppkjøpet av en styrke kurve på en stiv substrat. I stedet må brukeren angi (ut av temperaturen som i kontakt metoden), lengden og bredden på cantilever og tettheten og viskositet av væsken der cantilever er (vanligvis luft, vann eller en vann-lignende væsker). Da et termisk spektrum er ervervet og både utslag følsomhet og våren konstant måles. Denne metoden er fordelaktig når du bruker svært skarpe eller funksjonalisert tips som kan være skadet gjør en kraft kurve på en stiv substrat.
Begge de tidligere metodene forholder seg til oppkjøpet av en termisk-spent cantilever. Når stive utkragning brukes ved romtemperatur, kan gjennomsnittlig bevegelse amplitude være lavere enn 0,1 NM, noe som gjør resonans peak mindre og vanskeligere å oppdage. Uansett, iallfall for begge instrumentene som brukes i denne utredningen, den resonans peak kan faktisk oppdages i luft og i vann og utstyrt for å måle våren konstant (med tanke på at når målingen er gjort i væske, den resonans frekvens Skift mot lavere verdiene og toppen utvides).
En tredje metode bruker ikke en termisk melodi, men i stedet en referanse cantilever eller en referanse elastisk struktur, med en kjent fjær konstant (vanligvis med en usikkerhet rundt eller under 5%), for å bestemme cantilever K. I dette tilfellet må en første styrke kurve anskaffes på et stivt underlag for å måle følsomheten for utslag (som kommer igjen sammen med alle mulige gjenstander som påvirker formen på kurven). Deretter er stiv underlaget erstattet av referanse cantilever (vanligvis en tip-mindre cantilever med en kalibrert våren konstant) og en annen (eller noen få andre) Force kurve er utført, opptak igjen verdien av å bøye følsomhet. Den cantilever fjær konstanten beregnes deretter som:
der KREF er fjær konstanten til referanse cantilever, SREF .-følsomheten som måles på den, er L dens lengde og er stiv er det som er målt på den stive Substrat. ΔL er offset mellom spissen og slutten av referansen cantilever og avhenger av justeringen gjort av brukeren og til slutt α er vippe vinkelen på cantilever, spesifisert av AFM produsenten. Den samme metoden kan brukes på elastiske strukturer spesielt utformet for cantilever eller indenter kalibrering. Fordelen med disse strukturene (som er generelt sirkulær) er at K på sitt senter er konstant og ikke avhengig av noen geometriske parameter eller på nøyaktig posisjonering av AFM spissen på dem, så fjerner l og Δl fra forrige formel.
Den AFM brukeren har å huske på at alle disse kalibrering metoder er påvirket av ulike feilkilder (utslag følsomhet bestemmelse i første og tredje, bruk av termisk melodi i tilfelle av stiv utkragning for første og andre og geometriske parametere og justering for den tredje, samt kalibrerings nøyaktigheten til KREF i tilfelle referanse cantilever brukes) og at kontakt metoder er potensielt skadelige for spissen (spesielt den tredje, hvor kalibrering pålegger bruk av to forskjellige prøver). Dette innebærer at våren konstant vil alltid bli bestemt opp til en viss presisjon og så vil være målt/anvendt styrker (se Sikora19 for en omfattende gjennomgang av ulike kalibrering metoder og deres presisjon. Dette betyr at Youngs moduli og turgor Press også vil bli påvirket av cantilever kalibrering. Uansett, andre enda viktigere feilkilder er involvert ved beregning av disse mengdene (som bruk av forenklede modeller for Young ' s modul bestemmelse) så det vil alltid være en utfordring å få absolutte verdier ut av slike målinger. Det som er viktig er å få verdier som er av riktig størrelsesorden og som er sammenhengende med hverandre, noe som betyr at hvis eksperimentet gjentas av den samme brukeren på samme prøve, bør verdiene være kompatible. For å få det, må kalibreringen gjøres nøye, og feilkilder må minimeres (for eksempel begrense så mye som mulig akustisk støy/vibrasjoner). En mulig strategi fokusert for å øke sammenhengen i gjentatte kalibreringer har nylig blitt foreslått i en artikkel av Schillers et al.20, der takket være samarbeid med 11 europeiske laboratorier, en protokoll (kalt snap) for å kompensere for feil i bestemmelse av følsomhet er utviklet. I dette papiret forfatterne bruker direkte kalibrert utkragning for sine målinger, uansett den samme protokollen kan brukes til ikke-kalibrert utkragning, bare kalibrere dem første gang med metoden for valg og deretter vurderer den første våren som referanse ("kalibrert") verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke PLATIM-teamet for deres tekniske støtte, samt Arezki Boudaoud og medlemmer av Biophysic-teamet på RDP-laboratoriet for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y.
- Cosgrove, D. J.
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
