Summary
Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.
Abstract
Wir stellen hier den Einsatz der Atomkraftmikroskopie vor, um Pflanzengewebe einzurücken und seine mechanischen Eigenschaften wiederzuerlangen. Anhand von zwei verschiedenen Mikroskopen im Einzugsmodus zeigen wir, wie man einen elastischen Modul misst und damit mechanische Eigenschaften der Zellwand bewertet. Darüber hinaus erklären wir auch, wie der Turgordruck bewertet wird. Die Hauptvorteile der Atomkraftmikroskopie sind, dass sie nicht-invasiv, relativ schnell (5 bis 20 min) ist und dass praktisch jede Art von lebendem Pflanzengewebe, das oberflächlich flach ist, ohne Behandlungsbedarf analysiert werden kann. Die Auflösung kann sehr gut sein, abhängig von der Spitzengröße und der Anzahl der Messungen pro Flächeneinheit. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur direkten Zugriff auf die oberflächliche Zellschicht gewährt.
Introduction
Die Atomkraftmikroskopie (AFM) gehört zur Scan-Sondenmikroskopie-Familie (SPM), bei der eine Spitze mit einem Radius von in der Regel wenigen Nanometern die Oberfläche einer Probe scannt. Die Detektion einer Oberfläche erfolgt nicht über optische oder elektronenbasierte Methoden, sondern über die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze und der Probenoberfläche. Somit beschränkt sich diese Technik nicht auf die topographische Charakterisierung einer Probenoberfläche (3D-Auflösung, die auf wenige Nanometer sinken kann), sondern ermöglicht auch die Messung jeder Art von Wechselwirkungskräften wie Elektrostatik, Van der Waals oder Kontaktkräften. Darüber hinaus kann die Spitze verwendet werden, um Kräfte an der Oberfläche einer biologischen Probe anzuwenden und die resultierende Verformung, die sogenannte "Einrückung", zu messen, um ihre mechanischen Eigenschaften (z.B. Young-Modul, viskoelastische Eigenschaften) zu bestimmen.
Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellwänden sind wichtig, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die Entwicklungsprozessen zugrunde liegen,1,2,3zu berücksichtigen. Tatsächlich werden diese Eigenschaften während der Entwicklung streng kontrolliert, insbesondere da eine Zellwandenthärtung erforderlich ist, damit Zellen wachsen können. AFM kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und zu untersuchen, wie sie zwischen Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien wechseln.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir AFM verwenden, um sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck zu messen. Diese beiden Anwendungen werden auf zwei verschiedenen AFM-Mikroskopen demonstriert und werden hier danach detailliert beschrieben.
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Protocol
1.Messung der mechanischen Eigenschaften der Zellenwand
HINWEIS: Beispiel für das sich entwickelnde Gynoezium von Arabidopsis wird vorgestellt.
- Vorbereitung der biologischen Proben
- Sammeln Sie eine geschlossene Blütenknospe in Stufe 9 bis 10 (ca. 0,5 mm lang) nach veröffentlichten Stufen Bestimmung für Arabidopsis4. Unter einem Fernglas, mit feiner Pinzette, vorsichtig öffnen Sie die Knospe, um den Entwicklungsstand zu überprüfen und sammeln Sie das Gynoecium in der Mitte der Blume.
- Setzen Sie das Gynoecium auf doppeltes Seitenband in der Mitte der Abdeckung einer kleinen Petrischale (Durchmesser von 5 cm).
HINWEIS: Alternativ kann biokompatibler Klebstoff auch für eine effizientere Immobilisierung der Probe beim Einzug verwendet werden. - Fügen Sie schnell Wasser hinzu, bis die Probe vollständig abgedeckt ist. Dies vermeidet Austrocknung und reduziert die Haftung der Spitze an der Probe. Alternativ tauchen Sie die Probe in flüssiges Medium, wie Arabidopsis apex culture medium5.
- AFM-Kalibrierung
- Stellen Sie die Auslegerfederkonstante k hoch genug ein, um die Verformung der Probenoberfläche bis zum gewünschten Einzug zu ermöglichen, aber nicht zu hoch, um einen Verlust der Empfindlichkeit zu vermeiden.
HINWEIS: Als grobe Faustregel kann die Größenordnung der Federkonstante als k-E - ,wobei der gewünschte Einzug der Fall ist, gewählt werden, wenn Youngs Modul der Probe bekannt ist. - Verwenden Sie eine R = 400 nm kugelförmige Spitze mit 15 m Spitzen-Bindetilever-Abstand.
HINWEIS: Der Spitzenradius steht in direktem Zusammenhang mit der seitlichen Auflösung. Im Allgemeinen wählen Sie für die Einrückung auf biologische Materialien abgerundete Spitzen(R größer als 10-20 nm) oder kolloidale Sonden. Kleine kolloidale Sonden können aufgrund des geringen Abstands zwischen Spitze und Ausleger, der die Probenoberfläche berühren kann, schwierig zu bedienen sein. - Schalten Sie die Software ein und platzieren Sie den Kopf vor dem Experiment mindestens 2-3 h horizontal: Dies ermöglicht es dem Kopf, sich zu thermischisieren und wird thermisch induzierte Freischwinger-Laser-relative Bewegungen vermeiden. Wenn das Mikroskop mit einem CellHesion-Modul ausgestattet ist (erweitert den verfügbaren Z-Piezo-Bereich auf 100 statt 15 m), schalten Sie zuerst den Controller ein und wählen Sie dann beim Starten der Software den CellHesion-Modus.
- Montieren Sie den Ausleger auf dem Glasstein und montieren Sie den Block auf dem Kopf. Legen Sie ein Tröpfchen von ein paar Mikroliter Reinstwasser auf die Spitze, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wenn die Spitze in Wasser getaucht wird.
- Legen Sie eine harte Probe (gereinigtes Glasschlitten oder Saphir) und fügen Sie 30-50 l Reinstwasser hinzu.
HINWEIS: Das hier beschriebene Kalibrierverfahren ist die manchmal so genannte Kontaktkalibrierung. Zuerst wird eine Kraftkurve auf einer steifen und flachen Oberfläche gemacht und dann wird das Schwingungsspektrum des thermisch angeregten Auslegers aufgezeichnet, um die Federkonstante zu berechnen. Andere Kalibrierprotokolle existieren und werden im Diskussionsabsatz kurz beschrieben. - Legen Sie den Kopf auf die Bühne (achten Sie darauf, die Z-Motoren hoch genug zu heben). Verwenden Sie das optische Bild, um den Laser grob auf den Ausleger zu legen.
- Bewegen Sie den Laser entlang der Hauptachse des Auslegers, der das Summensignal auf der Photodiode überwacht.
HINWEIS: Bei Verwendung von Standardauslegern sollte eine Summe von mehr als 0,5 V ermittelt werden. - Bewegen Sie den Laser in die andere Richtung und maximieren Sie das Summensignal, um den Laser in der Mitte des Auslegers zu positionieren. Dadurch wird das Quergespräch zwischen seitlicher und vertikaler Durchbiegung minimiert.
- Bewegen Sie den Laser entlang der Hauptachse des Auslegers, der das Summensignal auf der Photodiode überwacht.
- Messung der Ablenkempfindlichkeit
HINWEIS: Die Photodiode liest Laserverschiebung und liefert ein Signal in Volt. Um die Verformung in metrischer Einheit messen zu können, muss die Ablenkempfindlichkeit gemessen werden.- Stellen Sie das Gerät in Kontakt - Kraftspektroskopie. Legen Sie einen relativen Sollwert auf 2 V, eine Z-Länge auf 0,5 m und die Geschwindigkeit auf 2 m/s(Abtastrate auf 10000 Hz) zu verlängern, und wählen Sie Z Closed Loopaus.
- Öffnen Sie den Kalibrierungs-Manager, und wählen Sie den Kontaktteil der Kraftkurve (der linear sein sollte), um eine lineare Anpassung zu machen: Die Umkehrung der Neigung ergibt die Ablenkempfindlichkeit. Der Photodiodenwert wird nun in metrischer Einheit kalibriert.
-
Bestimmung der Federkonstante. Wählen Sie im Kalibrierungs-Manager die Federkonstante aus, um eine thermische Spektrumerfassung auszuführen. Um das Signal für eine längere Zeit zu durchschnittlich, wählen Sie das Symbol . Das Leistungsspektrum des thermisch angeregten Auslegers kann mehrere Spitzen aufweisen; zeichnen Sie eine Auswahl um diejenige, die mit der niedrigsten Frequenz platziert ist, um sie zu passen.
HINWEIS: Wenn die thermische Melodie in Flüssigkeit durchgeführt wird, wird die Resonanzspitze breiter und ihre Frequenz im Vergleich zu nominal verringert.
- Stellen Sie die Auslegerfederkonstante k hoch genug ein, um die Verformung der Probenoberfläche bis zum gewünschten Einzug zu ermöglichen, aber nicht zu hoch, um einen Verlust der Empfindlichkeit zu vermeiden.
- Kraftspektroskopie-ExperimentAufbau und -Erfassung
- Platzieren Sie die Probe auf der AFM-Stufe, und legen Sie den Kopf über die Probe.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf so eingefahren wurde, dass ein harter Kontakt zwischen der Spitze und der Probenoberfläche vermieden wird. - Lassen Sie den Ausleger für ein paar Minuten thermischisieren.
- Im QI-Modus nähern Sie sich mit einer Sollwertkraft von 50 nN.
- Stellen Sie eine Z-Länge von 4 m und eine Scanfläche auf 80 x 80 m2 mit einer Pixelanzahl von 40 x 40 ein. Stellen Sie im Bedienfeld Erweiterte Bildeinstellungen den Modus auf konstante Geschwindigkeit ein. Stellen Sie die Verlängerungs- und Einziehgeschwindigkeit auf 200 m/s und die Abtastraten auf 25 kHz ein.
- Starten Sie das Scannen und verwenden Sie dieses schnelle Scannen mit niedriger Kraft, um zu überprüfen, ob sich das Beispiel bewegt. Stellen Sie sicher, dass der gescannte Bereich frei von Schmutz oder umgelenkten Zellen ist, und suchen Sie einen Bereich von Interesse so flach wie möglich, um die Messungen durchzuführen.
HINWEIS: Um die reale Stichprobenneigung zu schätzen, sollte die Zeilennivellieren auf OFF oder auf Konstantegesetzt werden. Ein übermäßiger Neigungswinkel zwischen der Einzugsachse und der Oberfläche wirkt sich auf den gemessenen Young-Modul5aus. - Sobald ein Interessengebiet gefunden wurde, wählen Sie einen Bereich von 40 x 40 bis 60 x 60 x2 2 um ihn herum aus und erhöhen Sie die Pixelzahl auf 2 Pixel/m. Erhöhen Sie den Sollwert auf 500 nm, um 100-200 nm Einzug zu erhalten. Passen Sie diesen Wert ggf. zu Beginn des Experiments an. Verringern Sie die Z-Länge auf 2 m. Verringern Sie die Verlängerungs- und Einziehgeschwindigkeit auf 100 m/s und erhöhen Sie die Abtastrate auf 50 kHz.
- Starten Sie das Scannen und speichern Sie die Ausgabe (in der Regel aus einem Bild und einer Datendatei zusammengesetzt).
- Am Ende des Messtages den Spitzenhalter entfernen und vorsichtig mit Reinstwasser und 70% EtOH abspülen.
- Trocknen und entfernen Sie den Ausleger. Für weitere Experimente mit der gleichen Spitze sollten Sie es mit einem Nassreinigungsprotokoll und, wenn möglich, einer Nachbehandlung mit Plasma O2 reinigen. Lassen Sie das Wasser nicht auf dem Ausleger und/oder Spitzenhalter trocknen, um eine Salzkristallisation zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Probe auf der AFM-Stufe, und legen Sie den Kopf über die Probe.
- Datenanalyse (für 6.x Data Processing Software Version)
- Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware, und laden Sie die Datendatei.
- Klicken Sie auf Diese Karte für die Stapelverarbeitung verwenden, um dieselben Analyseparameter für alle Kurven der Karte zu verwenden.
- Wählen Sie im vordefinierten Vorgang Load Hertz fitaus.
- Verwenden Sie die erste Registerkarte, um die Kalibrierungsparameter zu überprüfen oder zu ändern.
- Entfernen Sie auf der zweiten Registerkarte einen Versatz (oder einen Versatz plus eine Neigung) von der Basislinie, um den Durchschnittswert auf 0 festzulegen.
- Schätzen Sie in der dritten Registerkarte die Position des Kontaktpunkts (POC), indem Sie sie als den ersten Punkt betrachten, der die 0-Kraft kreuzt, wenn sie vom Sollwert entlang der Extendkurve herunterkommt.
- Die Registerkarte Vertikale Spitzenposition berechnet die Spitzenbewegung, indem die Auslegerablenkung von der Höhe gemessen subtrahiert wird. Verwenden Sie in diesem Schritt die Ungsmoothed height (Rohdaten) für die folgende Anpassung, indem Sie das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Elastizitätsanpassung das entsprechende Anpassungsmodell aus. Wenn keine oder eine schwache Haftung auf Rückzugskurven sichtbar ist (entsprechend weniger als 10 % der Sollwertkraft oder der maximalen Durchschnittskraft bei der ausgewählten Einzugstiefe), sollte der Modelltyp auf Hertz/Sneddon gesetzt werden und die Verlängerungskurve verwendet werden. Bei stärkerer Haftung sollte das DMT-Modell, das für das Derjaguin-Muller-Toporov-Modell steht, bevorzugt werden und die Anpassung sollte auf Einziehkurven erfolgen (details zu den verfügbaren Kontaktmodellen und verwandten Formeln finden Sie im Handbuch).
- Legen Sie geometrische Spitzenparameter basierend auf der nominalen Spitzenform fest. Hier ist Tip Shape Kugel und Tip Radius ist 400 nm.
- Stellen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,5 fest, wie es konventionell für biologisches Material (entsprechend inkompressiblem Material) durchgeführt wird.
-
Passen Sie sich an eine bestimmte Einbuchtungan. Standardmäßig wird die Anpassung über die gesamte Kurve ausgeführt. Wenn die Passung bis zu einem bestimmten Einzug erfolgen muss, aktivieren Sie zuerst das Kontrollkästchen Umschaltkurve; Dadurch wird der Ursprung der Kurve basierend auf neu ermittelten Basislinien- und POC-Werten verschoben.
- Fügen Sie eine zweite Elasticity Fit-Routine hinzu, indem Sie auf das Symbol im Hauptfenster klicken.
- Stellen Sie alle Anpassungsparameter erneut ein und geben Sie in X min den gewünschten Einzug an. Fügen Sie so viele Schritte wie nötig hinzu (2 bis 3 Schritte sollten ausreichen), um die Bestimmung der POC-Position und anschließend die berechnete Einzugstiefe zu verfeinern. Der Prozess kann an dieser Stelle gespeichert werden.
- Klicken Sie auf Behalten und gelten, um die vorherigen Schritte auf allen Kurven der Karte zu durchlaufen.
- Speichern Sie die Ergebnisse. Ein Bild und eine .tsv-Datei werden abgerufen.
2. Messung des Turgordrucks
HINWEIS: Ein Beispiel für das mit Oryzalin behandelte Blütenstand-Meristem der Arabidopsis wird vorgestellt.
- Herstellung einer biologischen Probe
- Collect Arabidopsis inflorescence meristem (IM) behandelt mit dem Mikrotubuli-Depolymerisationsmedikament Oryzalin aus In-vitro-Pflanzen, die auf einem Medium angebaut werden, das den polaren Auxin-Transportinhibitor 1-N-Naphthylphthalamsäure (NPA) nach veröffentlichter Methode enthält 6.
- Montage von IM-Beispiel nach einer der beiden Optionen
- Zur Langzeitüberwachung: Montieren Sie die Probe in einer Petrischale, die Arabidopsis apex culture medium (ACM)7,8 und 0.1% Pflanzenschutzgemisch (PPM) enthält, um eine Kontamination zu verhindern. Halten Sie die IM-Spitze über der ACM-Oberfläche auf und stützen Sie die Basis von IM mit einem Tropfen von 2% Agarose.
- Zur Messung mit schnellen Lösungswechseln: Montieren Sie die Probe in einer Petrischale, die ein kleines Stück Klebemastix hält, und versiegeln Sie schnell den Spalt zwischen Mastix und Probenbasis mit biokompatiblem Kleber. Warten Sie, bis sich der Kleber erstarrt (weniger als 2 min), und tauchen Sie die Probe dann in flüssigen ACM mit 0,1 % PPM ein.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probenoberfläche bei der Befestigung der Probenbasis nicht mit Agarose oder Kleber beschichtet ist. Die AFM-Messung des Turgordrucks erfordert, dass die Probe stabil montiert wird, und die vorherigen Montagemethoden sorgen für eine akzeptable Stabilität. Je nach Probe können andere Montagemethoden verwendet werden, wie doppelseitiges Band, Polylysin usw.
- AFM-Kalibrierung
- Schalten Sie die AFM-Erfassungssoftware ein und wählen Sie den PeakForce QNM(große Amplituden)-Messmodus.
- Führen Sie die Kalibrierung nach demselben Prinzip durch, das in den Schritten 2.1 bis 2.6 beschrieben ist.
- Legen Sie im Fenster Parameter überprüfen die Scangröße auf 0 fest. Legen Sie im Ramp-Fenster die Rampengröße zwischen 200 nm und 500 nm, die Trig-Schwelle zwischen 2 V und 5 V und die Anzahl der Proben auf 2048 oder höher fest.
- Richten Sie die Auslegerspitze an der Kalibrierungsprobe aus, und klicken Sie auf Approach.
- Nach dem Kontakt, gehen Sie zum Ramp-Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche Kontinuierliche Rampe. Bestimmen Sie im linearen Regime der Kurve die Neigung, indem Sie auf die Schaltfläche Empfindlichkeit aktualisieren klicken. Wiederholen Sie die Umlenkempfindlichkeitsmessung mehrmals und aktualisieren Sie die Kalibrierung manuell mit dem Messdurchschnitt, indem Sie den Tab-Detektor aus dem Menü Kalibrierungöffnen.
- Ziehen Sie den AFM-Kopf ein und entfernen Sie die Kalibrierprobe.
HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, den AFM-Kopf vollständig zurückzuziehen, indem Sie die Registerkarte Stage - Initialize auswählen, um versehentlichen harten Kontakt bei Probenwechsel zu verhindern.
- Kraftspektroskopie-ExperimentAufbau und -Erfassung
- Wenn die Probe noch nicht untergetaucht ist, tauchen Sie sie mit flüssigem ACM ein, das PPM enthält.
- Geben Sie in der Erfassungssoftware die Messparameter wie folgt an:
- Legen Sie im Parameterfenster Prüfen die Federkonstante auf die gefertigte Federkonstante des Auslegers oder die ermittelte Federkonstante wie in Schritt 2.8 fest. In diesem Beispiel wird er auf 42 N/m festgelegt.
- Legen Sie in diesem Beispiel den Spitzenradius auf 400 nm fest.
- Stellen Sie das Verhältnis von Sample Poisson auf 0,5 fest, da Wasser hauptsächlich zum Turgordruck beiträgt.
- Legen Sie Sample/Line auf 128 fest, um eine schnelle Erfassung zu gewährleisten.
- Stellen Sie die Scanrate auf 0,2 Hz ein.
- Stellen Sie die Scangröße auf 1 m fest.
HINWEIS: Das Festlegen der Scanrate und der kleinen Scangröße kann effektiv verhindert, dass AFM-Scan-ausgelöste Probenschäden verursacht werden. Es wird empfohlen, diese beiden Parameter bei jeder Stichprobenänderung zu reduzieren. - Stellen Sie im Ramp-Fenster die Rampengröße auf 5 m fest.
HINWEIS: Es ist besser, Rampengröße größer als vorgesehen Einzugstiefe für eine bessere Baseline-Erfassung. - Setzen Sie den Trig-Schwellenwert auf das Maximum.
- Legen Sie die Anzahl der Proben auf 4608 fest.
- Optional, in Mikroskop - Engagement-Parameter-Registerkarte, reduzieren Sie die folgenden Parameter, um starke kontaktinduzierte Probenschäden zu verhindern. Legen Sie Peak Force Engage Setpoint auf 0,3 V fest (Standard 0,5 V). Setzen Sie Engage int. Gain auf 0,5 (Standard 0,75). Stellen Sie den SPM-Einlimenschritt auf 4 m (Standard 15 m) ein.
- Platzieren und richten Sie die Probe unter dem AFM-Kopf aus, und nähern Sie sich, bis der Ausleger untergetaucht ist, aber nicht in Kontakt mit der Probenoberfläche.
HINWEIS: Während der Annäherung, leicht blasen auf der Oberfläche der flüssigen ACM, bis eine flüssige Brücke zwischen dem Ausleger und der flüssigen Oberfläche gebildet wird. Dies verhindert in der Regel harten Kontakt. - Mit Sorgfalt, manuell nähern sich auf die Probe. Wenn sich die Sonde relativ nahe an der Probenoberfläche befindet, klicken Sie auf Ansatz.
- Bei Kontakt erhöhen Sie schrittweise die Scangröße und/oder scan-Rate bis zu einem gewünschten Gleichgewicht, ohne die Probe und/oder den Ausleger zu beschädigen.
HINWEIS: Die Scangröße wird durch die Oberflächenkrümmung und Rauheit der Probe begrenzt. Bei oryzalinbehandeltem IM kann mit einer Scanrate von 0,3 Hz eine Scanfläche von 50 x 50 m2 erreicht werden. - Stellen Sie beim Scannen fest, ob der Messbereich wie gewünscht ist. Verschieben Sie bei Bedarf. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Point and Shoot, um den Punkt zu initiieren und das Fenster zu schießen.
- Wählen Sie vor der Aufzeichnung des Scans einen geeigneten Bildkanal aus, der eine eindeutige Identifizierung von Zellkonturen erleichtern kann. Oft ist Peak Force Error, DMT Modulus, LogDMT Modulus oder Dissipation geeignet. Geben Sie das Speichern des Verzeichnisses und des Dateinamens an. Klicken Sie dann auf Ramp beim nächsten Scan, um die Aufnahme zu starten.
HINWEIS: Eine Zeichenfolge aus einem Punkt und drei Zahlen wird automatisch nach dem angegebenen Dateinamen hinzugefügt (z. B. .000). Diese Zahl erhöht sich automatisch um 1 bei jeder gespeicherten Scanwiederholung. - Wenn der Scan abgeschlossen ist, wird die Software-Schnittstelle automatisch zum Ramp-Fenster umgeleitet. Klicken Sie auf das gescannte Bild, um die zu einrückenden Positionen anzugeben.
HINWEIS: Vor der Aufzeichnung von Einzügen ist es besser, mehrere Markierungen auszuwählen, um Testeinzüge durchzuführen, indem Sie nur auf Rampklicken, falls eine Parameteränderung erforderlich ist (für Rampengröße, Piezopositionusw.). Die Einzugstiefe muss größer sein als die Zellwanddicke (idealerweise separat durch Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt). - Wählen Sie mindestens drei Einzugsstellen pro Zelle in der Nähe des Barycenters aus, und wiederholen Sie den Einzug dreimal pro Standort. Dies würde für weitere Analysen mindestens neun Kraftkurven pro Zelle ergeben. Wenn Sie mit der Platzierung der Einzugswebsite zufrieden sind, klicken Sie auf Ramp und erfassen. Die Krafteindrungenwerdenwerdenwerdenwerden werden automatisch im angegebenen Verzeichnis gespeichert.
- Wenn die Rampen abgeschlossen sind, verschieben Sie sich für die Kachelmessung an eine andere Position, oder ziehen Sie den Scankopf zurück und wechseln Sie die Probe.
- Reinigen Sie den Ausleger nach Fertigstellung wie in den Schritten 1.3.8 und 1.3.9.
- Datenanalyse
- Öffnen Sie in der Analysesoftware die Datei *.mca. Dies zeigt die Position jeder Kraftkurve auf dem gescannten Bild. Falls gewünscht, wählen Sie Kraftkurven für die Analyse vor.
- Öffnen Sie eine zu analysierende Kraftkurve, in der Regel im Format x0000y.00z, wobei x der angegebene Dateiname im Speicherverzeichnis ist, während y und z automatisch registrierte Zahlen sind, die die Einzugssequenz und Scannummer bezeichnen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Baseline-Korrektur, und ziehen Sie die blauen Strichlinien auf der Kraftkurve, bis der Quellbasisstart und der Quellbasisausgangsstopp erweitern bei 0 % bzw. 80 % liegen. Klicken Sie auf Ausführen.
HINWEIS: Alternativ kann der Quell-Baseline-Stopp für Quellquellen auf unterschiedliche Werte festgelegt werden, sofern er sich noch innerhalb der Baseline und nicht außerhalb des Kontaktpunkts befindet. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Boxcar-Filter und klicken Sie auf Ausführen, um die Kraftkurve zu glätten.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Einzug.
- Legen Sie im Eingabefenster die aktive Kurve auf Erweiternfest.
- Legen Sie die Anpassungsmethode auf linearisiertes Modell fest, und fügen Sie die Haftkraft auf Jaein.
- Setzen Sie Max Force Fit Boundary auf 99% und Min Force Fit Boundary auf 75%.
- Legen Sie Modell auf Steifigkeit anpassen (Linear) fest.
HINWEIS: Dieses Setup berechnet die scheinbare Steifigkeit k für Turgor-Druckabzug. In diesem Beispiel spiegeln die Anpassungsgrenzen eine Steifigkeitsanpassung von etwa 1,5 m Einzugstiefe wider.
- Kraftkurven können im Batch analysiert werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verlauf ausführen, geben Sie das Berichtsverzeichnis an, und fügen Sie alle anderen Kraftkurven hinzu, die die gleiche Behandlung erfordern. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf Ausführen. Standardmäßig wird die Anpassung als *.txt-Datei gespeichert.
- Wenn k stapelweise montiert ist, klicken Sie auf Verlauf 5 Einzug, um zum Einzugsfenster zurückzukehren.
- Ändern Sie Max Force Fit Boundary auf 10% und Min Force Fit Boundary auf 0%.
- Legen Sie Modell auf Hertzian (Sphärisch) an.
HINWEIS: Dadurch wird der Zellwand-Young-Modul E für den Turgordruckabzug berechnet. In diesem Beispiel spiegeln die Anpassungsgrenzen eine Hertzsche Passung (mit kugelförmiger Sonde) von etwa 0,4 m Einzugstiefe wider.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.6 für Chargenfit für E.
- Öffnen Sie die *.00z-Datei (z ist die automatisch registrierte Scannummer), um die verschiedenen Scankanäle anzuzeigen. Klicken Sie im Fenster Höhenkanal auf Abschnitt. Auf diese Weise wird die Messung der Oberflächenkrümmung der Probe ermöglicht, die für den Turgordruckabzug erforderlich ist.
- Zeichnen Sie eine Linie über die lange Achse einer Zelle, verschieben Sie die Strichliniengrenzen an die Zellkanten, und zeichnen Sie den Radiuswert r1auf. Wiederholen Sie dies für die kurze Achse, um radius r2abzurufen. Berechnen Sie die mittlere Krümmung der Zelloberfläche M und die Gaußsche Krümmung G mit den beiden Radienmessungen wie folgt:
und
- Zeichnen Sie eine Linie über die lange Achse einer Zelle, verschieben Sie die Strichliniengrenzen an die Zellkanten, und zeichnen Sie den Radiuswert r1auf. Wiederholen Sie dies für die kurze Achse, um radius r2abzurufen. Berechnen Sie die mittlere Krümmung der Zelloberfläche M und die Gaußsche Krümmung G mit den beiden Radienmessungen wie folgt:
- Leiten Sie Turgordruck P mit dem Dünnschalenmodell 9 wie folgt ab:
mit
wobei t die Zellwanddicke ist, die z.B. durch Elektronenmikroskopie bestimmt wird.
HINWEIS: Der Abzug des Turgordrucks ist ein passender Prozess, bei dem Iterationen erforderlich sind. Vier Iterationen sind in der Regel in der Lage, stabiles Produkt zu reproduzieren, jedoch können mehr Iterationen durchgeführt werden (z. B. 100 Mal). - Berechnen Sie den Mittelwert E, k und P pro Zelle. Registrieren Sie auch die intrazelluläre Variabilität (z. B. Standardabweichung) für die Dokumentation.
und
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Representative Results
Abbildung 1A und Abbildung 1B zeigen einen Screenshot, der das Ergebnis der Schritte 1.3.4 bis 1.3.6 des Protokolls veranschaulicht, der verwendet wird, um eine Interessenregion zu finden, in der die QI-Karte erworben werden soll. Es ist erwähnenswert, dass die Region von Interesse gewählt wurde, um nicht auf einer geneigten Oberfläche (d.h. so flach wie möglich) zu sein. Tatsächlich, wie routier et al.5bemerkte, kann der gemessene Young-Modul unterschätzt werden, wenn die Einzugsachse nicht senkrecht zur Oberfläche ist. Dieser Effekt ist in der oberen rechten Ecke der C- oder D-Panels von Abbildung 1sichtbar, wo ein Teil des Zellrahmens weicher aussieht als der Rest der Zelle. Die durch diesen Effekt induzierten Artefakte werden bei Meristem, bei denen der lokale Neigungswinkel leicht 40° über 50 x 50 'm2 Scanbereiche überwinden kann, viel stärker sein. In unserem Labor entwickeln wir derzeit einen Algorithmus, der auf dem von Routier et al.5beschriebenen Ansatz basiert, um diese Artefakte zu korrigieren (Papier in Vorbereitung). Abbildung 1C und Abbildung 1D zeigen die Modulkarten von Young, die nach der im vierten Absatz des Protokolls beschriebenen Analyse erhalten wurden. Insbesondere stellt Panel C den Modul des Jungen dar, der die Analyse des gesamten Einzugs bis zum benutzerdefinierten Kraftsollwert erhalten hat, während Panel D das Ergebnis der Analyse der ersten 100 nm Einzugsanzeige zeigt (wie in Schritt 1.4.9 beschrieben). Hier sehen die beiden Karten sehr ähnlich aus, da während der Versuchseinrichtung der Sollwert gewählt wurde, um durchschnittliche Einbuchtungen um 100 nm zu erhalten. Die Variation des analysierten Einzugs kann manchmal dazu führen, dass Stichprobenheterogenitäten besser hervorgehoben werden, was bei der Identifizierung des Standorts oder bei der Bereitstellung von Informationen über das Verhalten interner Strukturen (z.B. Costa et al.10) hilfreich sein kann.
Die Kraftkurve in Abbildung 2 zeigt zwei Effekte, die erwähnenswert sind. Zunächst ist festzustellen, dass, wenn der Annäherungsteil der Kraftkurve tatsächlich an der Sollkraft von 500 nN endet, die Abwärtsspitzenbewegung weitergeht, was bedeutet, dass die von der Spitze angewendete Endkraft höher ist als erwartet (hier 1.000 nN). Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Rückkopplungsschleife, die die Auslegerverformung überwacht, nicht sofort wirkt, so dass ihre endliche Reaktionszeit eine Verzögerung zwischen der Verformungsschwellenerkennung und dem Piezobewegungsstopp einleitet. Darüber hinaus kommt insbesondere bei der Verwendung von CellHesion, das den Probenhalter bewegt, die Trägheit der beweglichen Teile ins Spiel, wodurch diese Zeitverzögerung länger wird. Dieses Problem kann durch die Verwendung des Kopfpiezos begrenzt werden, in diesem Fall muss der Benutzer bei Messungen an sehr groben oder geneigten Proben wirklich vorsichtig sein, oder durch die Reduzierung der Rampengeschwindigkeit, die ohnehin die Auflösung und/oder die Anzahl der gescannten Proben begrenzt ( außerdem kann bei zu langsamen Karten das Stichprobenwachstum zum Problem werden). Wenn die Kraftkurven weit genug voneinander entfernt sind (basierend auf dem Einzugsmodell Ihrer Wahl kann der Radius der einzugsgebundenen Fläche unter Der eingerückten Tiefe berechnet und als minimaler Trennabstand verwendet werden), werden die Messungen in verschiedenen Positionen entlang der Stichprobe sollten nicht korreliert sein, und wenn die Analyse auf der Anflugkurve durchgeführt wird, sollte die Überwindung des Kraftschwellenwerts kein Problem sein. Wie auch immer, wenn die Probe empfindlich ist oder wenn wiederholte Scans auf dem gleichen Bereich durchgeführt werden, kann der Wissenschaftler versuchen, diese Überschreitung zu minimieren. Leider gibt es keine Faustregel, um die Höhe dieser Überschreitung zu bestimmen, da sie vom verwendeten Piezo abhängt, von den Rampengeschwindigkeiten, aber auch von den Materialeigenschaften: je steifer das Material, desto schneller die Variation des Umlenksignals in der Zeit und , bei einer endlichen Feedback-Antwortzeit, je höher die Überschreitung.
Das zweite, was zu bemerken ist das Winken auf Rückzugskurve durch die Ellipse hervorgehoben. Ein solches Winken kann ein Indikator für die Probe sein, die sich unter der Wirkung der Spitze bewegt/vibriert. In diesem Fall kann der Benutzer versuchen, den gescannten Bereich zu ändern (manchmal ein anderer Teil des Mikroskops, aber die Spitze kann die Probe berühren, oder die Probe kann nicht ausreichend gut an ihrer Unterstützung befestigt werden) oder die Probe, wenn mehrere von ihnen auf der gleichen Unterstützung vorbereitet wurden. Wenn die Funktion immer vorhanden ist, ist es besser, die Fixierungsmethode zu ändern, in diesem Fall von der doppelseitigen Bandfixierung zu biokompatiblen Klebstoffen zu wechseln.
Abbildung 3 zeigt die Bestimmung der Wichtigsten Parameter für den Turgordruckabzug. Jeder Parameter, mit Ausnahme der Zellwanddicke11, die durch die Elektronenmikroskopie separat auf 740 nm festgelegt wurde, kann aus AFM-Scans und Einbuchtungen abgerufen werden. Nach dem Montageprozess in Schritt 2.4.10 wird für diese Kraftkurve ein Turgordruck von 1,50 MPa abgeleitet. Das Zusammenführen aller achtzehn Kraftkurven in dieser Zelle ergibt Durchschnittswerte von E = 6,77 x 1,02 MPa, k = 14,18 x 2,45 N/m und P = 1,45 x 0,29 MPa (mittlere Standardabweichung).
Abbildung 1 : Topographiekarten (Height Measured), die typischerweise während eines Experiments erworben werden. (A) Eine erste Karte mit niedriger Auflösung/niedriger Kraft wird aufgezeichnet, um eine geeignete zu scannende Region zu finden. (B) Für die Berechnung des Young-Moduls wird eine kleinere Karte mit hoher Auflösung/höherer Kraft erworben (auf der Fläche, die durch das schwarze gepunktete Quadrat hervorgehoben wird). (C) Youngs Modulkarten, berechnet aus Der B-Karte, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Hier wurde die Modulkarte des Jungen erhalten, die den gesamten Einzug auf jeder Kraftkurve analysiert. (D) Youngs Modulkarte erhielt die Analyse nur der ersten 100 nm Einzug. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Beispiel für die Kraftkurve. In blau der Ansatz, in rot das Rückzugssegment. Das Kraftmaximum (auf der Rückzugskurve) unterscheidet sich vom Kraftsollwert aufgrund der endlichen Rückkopplungsschleifenreaktionszeit und der Trägheit. Das Winken in der Einziehkurve kann für einen Mangel an Probenfixierung an seiner Unterstützung repräsentativ sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : AFM-Messungen für Turgordruckabzug. (A) DMT-Modulkarte zeigt eine klare Zellkontur, um die Positionierung von Tiefeinzugsstellen in der Nähe des Zellbarycenters zu überwachen. Einzugsstellen sind durch Kreuze gekennzeichnet. (B) Kraftkurve des tiefen Einzugs an der Rotkreuzposition in A. Zellwand Youngs Modul E (grün) und Probe scheinbare Steifigkeit k (rot) sind an verschiedenen Regimen der Kurve, wie in Schritt 2.4 beschrieben angebracht. R 2 bezeichnet den Bestimmungskoeffizienten der Passungen. (C) Höhenkarte mit manuell ermittelten langen und kurzen Achsen eines, dargestellt durch weiße Linien, derselben Zelle, die in den Paneelen A und B analysiert wird. (D) Höhenprofil der langen und kurzen Achsen der Zelle in Panel C (blau, langachsenrot, kurze Achse) und dem Fitte d Aradien der Krümmung (r1 und r2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Entstehung von Formen in Pflanzen wird hauptsächlich durch die koordinierte Geschwindigkeit und Wachstumsrichtung in Zeit und Raum bestimmt. Pflanzenzellen sind in einer starren Zellwand aus einer polysaccharidischen Matrix eingeschlossen, die sie zusammenklebt. Dadurch wird die Zellausdehnung durch das Gleichgewicht zwischen dem Turgordruck, der an der Zellwand zieht, und der Steifigkeit der Zellwand gesteuert, die diesem Druck standhält. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, ist es wichtig, sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck in verschiedenen Geweben oder Zellen eines bestimmten Organs messen zu können. Wie in diesem Papier gezeigt wird, ist AFM in diesem Zusammenhang die Methode der Wahl.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die erste ist die Gewebezubereitung, die schnell genug sein sollte, um Austrocknung zu vermeiden. Dies kann insbesondere dann von entscheidender Bedeutung sein, wenn wir den Turgordruck messen wollen. Sehr wichtig ist auch eine korrekte Fixierung der Probe auf ihr Substrat: Eine instabile Probe kann zu sehr offensichtlichen Effekten wie einer makroskopischen Bewegung führen, die leicht optisch erkannt werden kann, oder zu einer starken Verformung von Kraftkurven. Wie auch immer, Probenschwingungen oder Biegungen können subtil zu erkennen sein, indem Artefakte in die Ergebnisse eingeführt werden. Ein weiterer kritischer Schritt betrifft schließlich die Wahl der Einzugsparameter. Dies ist entscheidend für die Qualität der Ergebnisse.
Bei der Messung mechanischer Eigenschaften auf großen Flächen (über 40-50 m Scangrößen) können Höhenunterschiede hoch sein, was es schwierig macht, die Oberfläche richtig zu verfolgen und Kraftkurven zu realisieren, ohne die Grenzen des Z-Piezo-Bereichs zu erreichen. Um dieses Problem zu beheben, wurde ein CellHesion-Modul verwendet. Dieses Modul fügt einen zusätzlichen Z-Piezo hinzu, der sich in der Probenstufe befindet, mit einem Bereich von 100 m, der die Erfassung großer Flächen ermöglicht, ohne sich gefährlich z piezo-Grenzwerten zu nähern.
Die erste Einschränkung der Methode ist, dass wir nur oberflächliche Zellschichten messen können. Jedoch, vor kurzem Autoren haben AFM auf Gewebe Abschnitte12,13,14verwendet. Obwohl dies auf festem Material erfolgen muss, kann es den Zugriff auf mechanische Eigenschaften von tiefen Zellschichten gewähren. Alternativ wurden auch tiefere Einbuchtungen durchgeführt, um mechanische Eigenschaften von inneren Geweben auf lebenden Proben abzuleiten, wenn auch mit größeren Opfern bei räumlicher Auflösung15. Eine zweite Begrenzung kann mit der Probengeometrie verknüpft werden, da eine Fläche mit einer steilen Neigung problematisch sein kann, da die Spitze nicht mehr senkrecht zur Probe ist. Wir müssen den Bereich der Winkel einschränken, innerhalb derer Maßnahmen zuverlässig sind, und wir entwickeln derzeit einen Algorithmus, um potenzielle Artefakte im Zusammenhang mit diesem Phänomen zu korrigieren. Außerdem sind einige Gewebe mit Trichomen bedeckt, die die Messungen blockieren können. Schließlich misst der Einzug mechanische Eigenschaften in senkrechter Richtung in Bezug auf die Zelloberfläche, und wir können uns fragen, ob dies leicht mit der Zellwanderweiterbarkeit verbunden ist, die mit der Wachstumskapazität verbunden ist. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass es der Fallist 15,16.
Es lohnt sich, hier eine allgemeinere Beobachtung über die Messung/Anwendung von Kräften durch AFM zu machen. Wie im Protokollabschnitt beschrieben, muss eine Kalibrierung durchgeführt werden, um Laserverschiebungen auf der Photodiode in Kräfte umwandeln zu können. In dieser Kalibrierung ermöglicht ein Parameter, die Umlenkempfindlichkeit, laserverschiebungen in tatsächliche Auslegerverformung (in der Regel in nm gemessen), so dass dieser Faktor Photodiodenausgangsspannungen (entlang der vertikalen Achsen) in Verschiebungen in Nm. Der zweite Faktor ist die in N/m gemessene Federkonstante K, die vertikale Auslegerverformungen in Krafteinheiten (in der Regel nN) umwandelt, da sich die flexiblen Ausleger wie Federn verhalten. Auch wenn das Verfahren einfach erscheint, ist eine robuste und reproduzierbare Kalibrierung von K für AFM-Kraftspektroskopiemessungen aufgrund unterschiedlicher Fehlerquellen, die die verschiedenen Schritte des Verfahrens beeinflussen können, immer noch ein Problem. Beispielsweise kann die Messung der Umlenkempfindlichkeit, die eine Kraftkurve auf einer steifen Oberfläche realisiert, zu falschen Werten führen, wenn die Spitze auf der Oberfläche verrutscht, oder wenn die Oberfläche nicht perfekt gereinigt wird oder auch wenn die Oberflächenladung eine elektrostatische Abstoßung induziert. In allen vorherigen Fällen wird der Kontaktteil der Kraftkurve verformt (weiter geneigt oder gekrümmt statt linear).
Das im Protokollabschnitt beschriebene Kontaktverfahren ist nur eines von mehreren vorhandenen Kalibrierungsverfahren. Es gibt mindestens 2 weitere Methoden, die relativ einfach und kostengünstig eingesetzt werden können: die Sader-Methode (auch als kontaktlos bezeichnet, wenn sie in einer AFM-Software implementiert wird) oder die Referenzauslegermethode. Das Sader-Verfahren17 wurde ursprünglich von John Sader für V-förmige Ausleger und dann für rechteckige18 entwickelt und benötigt nicht die Erfassung einer Kraftkurve auf einem steifen Substrat. Stattdessen muss der Benutzer (a- und temperaturausstoßend wie in der Kontaktmethode) die Länge und Breite des Auslegers sowie die Dichte und Viskosität der Flüssigkeit angeben, in der sich der Ausleger befindet (in der Regel Luft, Wasser oder eine wasserähnliche Flüssigkeit). Dann wird ein thermisches Spektrum erfasst und sowohl Dielenkempfindlichkeit als auch Federkonstante gemessen. Diese Methode ist vorteilhaft, wenn sehr scharfe oder funktionalisierte Spitzen verwendet werden, die bei einer Kraftkurve auf einem steifen Substrat beschädigt werden können.
Beide bisherigen Methoden beziehen sich auf die Erfassung des Schwingungsspektrums eines thermisch angeregten Auslegers. Wenn steife Ausleger bei Raumtemperatur verwendet werden, kann die mittlere Schwingungsamplitude unter 0,1 nm liegen, wodurch die Resonanzspitze kleiner und schwieriger zu erkennen ist. Jedenfalls kann zumindest für beide in diesem Papier verwendeten Instrumente die Resonanzspitze tatsächlich in Luft und Wasser erfasst und zur Messung der Federkonstante ausgestattet werden (wenn die Messung in Flüssigkeit durchgeführt wird, verschiebt sich die Resonanzfrequenz in Richtung und die Spitze wird erweitert).
Eine dritte Methode verwendet keine thermische Melodie, sondern einen Referenzausleger oder eine elastische Referenzstruktur mit einer bekannten Federkonstante (in der Regel mit einer Unsicherheit um oder unter 5%), um den Ausleger Kzu bestimmen. In diesem Fall muss eine erste Kraftkurve auf einem steifen Substrat erfasst werden, um die Ablenkempfindlichkeit zu messen (die wieder zusammen mit allen möglichen Artefakten kommt, die die Form der Kurve beeinflussen). Dann wird das steife Substrat durch den Referenzausleger (in der Regel ein spitzenloser Ausleger mit einer kalibrierten Federkonstante) ersetzt und eine weitere (oder wenige andere) Kraftkurve durchgeführt, die den Wert der Ablenkempfindlichkeit wieder aufzeichnet. Die Auslegerfederkonstante wird dann wie folgt berechnet:
wobei Kref die Federkonstante des Referenzauslegers ist, Sref die darauf gemessene Ablenkempfindlichkeit, L seine Länge und Ssteif die Amortisationsempfindlichkeit ist, die an der steifen Substrat. L ist der Versatz zwischen der Spitze und dem Ende des Referenzauslegers und hängt von der Vom Anwender durchgeführten Ausrichtung ab und schließlich ist der Vom AFM-Hersteller angegebene Neigungswinkel des Auslegers. Das gleiche Verfahren kann auf elastischen Strukturen verwendet werden, die speziell für die Freischwinger- oder Eindrenterkalibrierung entwickelt wurden. Der Vorteil dieser Strukturen (die im Allgemeinen kreisförmig sind) ist, dass K in ihrer Mitte konstant ist und nicht von geometrischen Parametern oder von der präzisen Positionierung der AFM-Spitze auf ihnen abhängt, so dass das Entfernen von L und L aus der vorherigen Formel.
Der AFM-Anwender muss bedenken, dass alle diese Kalibriermethoden von unterschiedlichen Fehlerquellen beeinflusst werden (Ablenkungsempfindlichkeitsbestimmung in den ersten und dritten, die Verwendung von thermischer Melodie bei steifen Auslegern für den ersten und zweiten und Parameter und Ausrichtung für die dritte sowie Kalibriergenauigkeit von Kref im Fall Referenzausleger verwendet wird) und dass Kontaktmethoden potenziell schädlich für die Spitze sind (insbesondere die dritte, wo die Kalibrierung die Verwendung von zwei verschiedenen Proben). Dies bedeutet, dass die Federkonstante immer bis zu einer bestimmten Genauigkeit bestimmt wird und daher die gemessenen/angewendeten Kräfte sein werden (siehe Sikora19 für eine umfassende Überprüfung der verschiedenen Kalibriermethoden und ihrer Genauigkeit). Dies bedeutet, dass Youngs Moduli- und Turgordrücke auch von der Auslegerkalibrierung betroffen sind. Wie auch immer, andere noch wichtigere Fehlerquellen sind bei der Berechnung dieser Mengen beteiligt (wie die Verwendung von vereinfachten Modellen für Youngs Modulbestimmung), so dass es immer eine Herausforderung sein wird, absolute Werte aus diesen Arten von Messungen zu erhalten. Wichtig ist, Werte zu erhalten, die die richtige Größenordnung haben und miteinander kohärent sind, was bedeutet, dass, wenn das Experiment vom gleichen Benutzer in derselben Stichprobe wiederholt wird, die Werte kompatibel sein sollten. Um sie zu erhalten, muss die Kalibrierung sorgfältig durchgeführt und Fehlerquellen minimiert werden (z. B. Begrenzung von akustischen Geräuschen/Vibrationen). Eine mögliche Strategie, die darauf ausgerichtet ist, die Kohärenz wiederholter Kalibrierungen zu erhöhen, wurde kürzlich in einem Papier von Schillers et al.20vorgeschlagen, in dem dank der Zusammenarbeit von 11 europäischen Laboratorien ein Protokoll (SNAP) zum Ausgleich von Fehlern in Die Durchbiegungsempfindlichkeitsbestimmung wurde entwickelt. In diesem Papier verwenden die Autoren direkt kalibrierte Ausleger für ihre Messungen, sowieso kann das gleiche Protokoll auf nicht kalibrierte Ausleger angewendet werden, einfach kalibriert sie das erste Mal mit der Methode der Wahl und dann unter Berücksichtigung der ersten Feder konstante als Referenzwert ("kalibriert").
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem PLATIM-Team für die technische Unterstützung sowie Arezki Boudaoud und Mitgliedern des Biophysic-Teams im RDP-Labor für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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