Summary
여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.
Abstract
우리는 여기에 식물 조직을 들여 쓰기 위해 원자력 현미경 검사법의 사용을 제시하고 기계적 특성을 회복합니다. 들여쓰기 모드에서 두 개의 서로 다른 현미경을 사용하여 탄성 계수체를 측정하고 이를 사용하여 세포벽 기계적 특성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 또한 turgor 압력을 평가하는 방법도 설명합니다. 원자력 현미경 검사법의 주요 장점은 비 침습적이고 상대적으로 빠르며 (5 ~ 20 분), 피상적으로 평평한 거의 모든 유형의 살아있는 식물 조직이 치료없이 분석 될 수 있다는 것입니다. 팁 크기와 단위 면적당 측정 횟수에 따라 해상도가 매우 좋을 수 있습니다. 이 방법의 한 가지 제한은 표면 세포 층에 직접 액세스 할 수 있다는 것입니다.
Introduction
원자력 현미경 검사법 (AFM)은 일반적으로 몇 나노미터의 반경을 가진 끝이 견본의 표면을 검사하는 스캐닝 프로브 현미경 검사법 (SPM) 가족에 속합니다. 표면의 검출은 광학 또는 전자 기반 방법을 통해 달성되지 않고 팁과 샘플 표면 사이의 상호 작용 힘을 통해 달성됩니다. 따라서, 이 기술은 샘플 표면의 지형 특성화(몇 나노미터까지 내려갈 수 있는 3D 분해능)에 국한되지 않고 정전기, 반데르발스 또는 접촉력과 같은 모든 유형의 상호 작용 력을 측정할 수 있다. 또한, 팁은 생물학적 샘플의 표면에 힘을 가하고 기계적 특성 (예를 들어, 영의 계수, 점탄성 특성)을 결정하기 위해 생성 된 변형, 소위 "들여 쓰기"를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
식물 세포벽의 기계적 성질은 발달 과정 1,2,3의기본 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 할 필수적입니다. 실제로, 이러한 특성은 세포가 성장할 수 있도록 세포벽 연화가 필요하기 때문에 특히 발달 중에 엄격하게 조절된다. AFM은 이러한 특성을 측정하고 장기, 조직 또는 발달 단계 간에 변화하는 방식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 백서에서는 AFM을 사용하여 세포벽 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 2개의 응용은 2개의 다른 AFM 현미경에 설명되고 후에 여기에서 상세합니다.
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Protocol
1. 세포벽 기계적 특성측정
참고: 애기장대의 개발 부인도의 예가 제시된다.
- 생물학적 샘플의 준비
- 애기장대 4에 대한 출판 단계 결정에 따라 9 ~ 10 (약 0.5 mm 길이)에서 닫힌 꽃 봉오리를 수집합니다. 쌍안경 아래, 미세 핀셋을 사용하여 조심스럽게 개발 단계를 확인하고 꽃의 중심에있는 gynoecium을 수집하기 위해 싹을 엽니 다.
- 작은 페트리 접시 (5cm의 직경)의 커버의 중심에 배치 양면 테이프에 gynoecium을 넣어.
참고: 대안으로, 생체 적합성 접착제는 들여쓰기 시 시료의 보다 효율적인 고정화를 위해 사용될 수 있습니다. - 시료가 완전히 덮일 때까지 물을 빠르게 추가합니다. 이것은 탈수를 방지하고 샘플에 팁의 접착을 감소시킨다. 대안적으로, 애기집 배양 배지 5와 같은 액체 배지에샘플을 침수한다.
- AFM 교정
- 원하는 들여쓰기까지 샘플 표면의 변형을 허용하기에 충분히 높은 캔틸레버 스프링 상수 k를 설정하지만, 감도의 손실을 피하기 위해 너무 높지 않다.
참고: 대략적인 경험법칙으로, 영의 샘플 계수가 알려진 경우, 스프링 상수의 크기 순서는 kE * δ로 선택할 수 있으며, 여기서 δ는 원하는 들여쓰기입니다. - R = 400 nm 구형 끝 팁을 15 μm 팁 캔틸레버 거리로 사용하십시오.
참고: 팁 반지름은 측면 해상도와 직접 관련이 있습니다. 일반적으로 생물학적 물질에 대한 들여쓰기의 경우 둥근 팁(R 10-20 nm 이상) 또는 콜로이드 프로브를 선택합니다. 작은 콜로이드 프로브는 팁 끝과 샘플 표면에 닿을 수 있는 캔틸레버 사이의 작은 거리로 인해 사용하기가 까다로울 수 있습니다. - 소프트웨어에 스위치와 실험 전에 적어도 수평으로 머리를 배치 2-3 시간 : 이것은 머리가 열화 할 수 있도록하고 열 유도 캔틸레버 레이저 상대 적인 움직임을 피할 수 있습니다. 현미경에 CellHesion 모듈이 장착된 경우(사용 가능한 Z 압전 범위를 15μm 대신 100 μm으로 확장) 먼저 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 시작할 때 CellHesion 모드를 선택합니다.
- 캔틸레버를 유리 블록에 장착하고 머리에 블록을 장착합니다. 팁이 물에 담근 때 기포의 형성을 피하기 위해 팁에 초순수 의 몇 마이크로 리터의 방울을 놓습니다.
- 단단한 샘플(세척된 유리 슬라이드 또는 사파이어)을 놓고 30-50 μL의 초순수를 넣습니다.
참고: 여기에 설명된 교정 절차는 때때로 접지 교정이라고 도합니다. 첫째, 힘 곡선은 단단하고 평평한 표면에서 만들어지고 열적으로 흥분된 캔틸레버의 진동 스펙트럼이 스프링 상수를 계산하기 위해 기록됩니다. 다른 교정 프로토콜이 존재하며 토론 단락에 간략하게 설명될 것입니다. - 머리에 머리를 놓습니다(Z 모터를 충분히 높이 들어 올리도록 주의하십시오). 광학 이미지를 사용하여 대략 캔틸레버에 레이저를 놓습니다.
- 광다이오드의 합계 신호를 모니터링하는 캔틸레버의 주 축을 따라 레이저를 이동합니다.
참고: 표준 캔틸레버를 사용할 때 0.5V보다 큰 합계를 얻어야 합니다. - 다른 방향을 따라 레이저를 이동하고 캔틸레버의 중간에 레이저를 배치하기 위해 합계 신호를 최대화합니다. 이렇게 하면 측면 및 수직 편향 간의 교차 토크가 최소화됩니다.
- 광다이오드의 합계 신호를 모니터링하는 캔틸레버의 주 축을 따라 레이저를 이동합니다.
- 편향 감도 측정
참고: 포토다이오드는 레이저 변위를 판독하고 볼트신호를 제공합니다. 미터법 단위에서 편향을 측정하려면 편향 감도를 측정해야 합니다.- 접촉에서 계측기를 설정 → 힘 분광법. 상대 설정점을 2V, Z 길이를 0.5 μm으로 설정하고 속도를 2 μm/s(샘플 속도에서 10000Hz)로 확장하고 Z 닫힌루프를 선택합니다.
- 보정 관리자를 열고 선형 맞춤을 만들기 위해 힘 곡선의 접촉 부분(선형이어야 있음)을 선택합니다: 경사의 역방향은 편향 감도를 제공합니다. 이제 포토다이오드 판독값이 미터법 단위로 보정됩니다.
-
스프링 상수의 결정. 교정관리자에서 열 스펙트럼 수집을 실행하려면 스프링 상수를 선택합니다. 신호를 더 긴 시간 동안 평균하려면 ∞ 기호를 선택합니다. 열적으로 흥분된 캔틸레버의 전력 스펙트럼은 여러 피크를 나타낼 수 있습니다. 가장 낮은 주파수에 배치된 선택 항목을 그립니다.
참고: 열 조정이 액체에서 수행되는 경우 공진 피크가 더 넓어지고 공진 빈도가 공칭 에 비해 낮아집니다.
- 원하는 들여쓰기까지 샘플 표면의 변형을 허용하기에 충분히 높은 캔틸레버 스프링 상수 k를 설정하지만, 감도의 손실을 피하기 위해 너무 높지 않다.
- 힘 분광법 실험 설정 및 수집
- 샘플을 AFM 단계에 놓고 샘플을 위에 놓습니다.
참고: 팁과 샘플 표면 사이의 단단한 접촉을 피하기 위해 머리가 충분히 후퇴되었는지 확인하십시오. - 캔틸레버를 몇 분 동안 열화시키십시오.
- QI 모드에서는 50 nN의 설정점 힘으로 접근합니다.
- Z 길이를 4 μm이고 스캔 영역을 80 x 80 μm 2로 40 x 40픽셀로 설정합니다. 고급 이미징 설정 패널에서 모드를 일정한 속도로 설정합니다. 연장 및 리트랙트 속도를 200 μm/s로 설정하고 샘플 속도를 25kHz로 설정합니다.
- 스캔을 시작하고 이 빠른 저력 스캐닝을 사용하여 샘플이 움직이는지 확인합니다. 스캔한 영역에 이물질이나 편향된 셀이 없는지 확인하고 측정을 수행하기 위해 가능한 한 평평한 관심 영역을 찾습니다.
참고: 실제 샘플 기울기를 높이려면 선 레벨링을 OFF 또는 상수로설정해야 합니다. 들여쓰기 축과 표면 사이의 과도한 기울기 각도는 측정된 Young의 계수5에 영향을 미칩니다. - 관심 영역이 위치하면 주변40 x 40 ~ 60 x 60 μm 2의 영역을 선택하고 픽셀 수를 늘려 2픽셀/μm에 도달합니다. 설정점을 500nm로 증가하여 들여쓰기를 100-200nm 로 가져옵니다. 필요한 경우 실험 시작 시 이 값을 조정합니다. Z 길이를 2 μm로 줄입니다. 연장 및 후퇴 속도를 100 μm/s로 줄이고 샘플 속도를 50kHz로 늘립니다.
- 검색을 시작하고 출력을 저장합니다(일반적으로 이미지와 데이터 파일로 구성됨).
- 측정일이 끝나면 팁 홀더를 제거하고 초순수와 70% EtOH로 부드럽게 헹구십시오.
- 캔틸레버를 말리고 제거합니다. 동일한 팁으로 추가 실험을 하려면 습식 세척 프로토콜로 세척하고 가능하면 후속 플라즈마O2 처리를 고려하십시오. 소금 결정화를 피하기 위해 캔틸레버 및/또는 팁 홀더에서 물을 건조시키지 마십시오.
- 샘플을 AFM 단계에 놓고 샘플을 위에 놓습니다.
- 데이터 분석(6.x 데이터 처리 소프트웨어 버전용)
- 데이터 처리 소프트웨어를 열고 데이터 파일을 로드합니다.
- 맵의 모든 곡선에서 동일한 분석 매개변수를 사용하려면 일괄 처리 단추에 이 맵 사용을 클릭합니다.
- 미리 정의된 로드프로세스에서 Hertz맞춤을 선택합니다.
- 첫 번째 탭을 사용하여 교정 매개 변수를 확인하거나 변경합니다.
- 두 번째 탭에서 기준선에서 오프셋(또는 오프셋과 기울기)을 제거하여 평균 값을 0으로 설정합니다.
- 세 번째 탭에서는 연장 곡선을 따라 설정점 값에서 내려올 때 0개의 힘을 교차하는 첫 번째 점으로 고려하여 접촉점(POC) 위치를 추정합니다.
- 탭 수직 팁 위치는 높이 측정에서 캔틸레버 편향을 빼서 팁 이동을 계산합니다. 이 단계에서는 해당 확인란을 선택하여 다음 맞춤에 대해 스무딩되지 않은 높이(원시 데이터)를 사용합니다.
- 탄력성 맞춤 탭에서 적절한 맞춤 모델을 선택합니다. 리트랙트 커브(설정점 힘의 10% 미만 또는 선택한 들여쓰기 깊이에서 최대 평균 힘에 해당)에서 접착력이 없거나 약한 경우 모델 유형을 Hertz/Sneddon으로 설정하고 곡선을 확장해야 합니다. 더 강한 접착력의 경우, Derjaguin-Muller-Toporov 모델을 나타내는 DMT 모델이 선호되어야 하며, 후퇴 곡선에서 적합해야 합니다(사용 가능한 접촉 모델 및 관련 공식에 대한 자세한 내용은 설명서 참조).
- 단칭 팁 쉐이프를 기준으로 팁 기하학적 매개변수를 설정합니다. 여기서 팁 모양은 구이고 팁 반지름은 400nm입니다.
- 푸아송 비율을 생물학적 물질(비압축성 물질에 해당)에 대해 종래에 수행되는 것처럼 0.5로 설정합니다.
-
특정 들여쓰기에 맞춥습니다. 기본적으로 맞춤은 전체 곡선에서 수행됩니다. 맞춤을 특정 들여쓰기까지 수행해야 하는 경우 먼저 시프트 커브 확인란을 선택합니다. 이렇게 하면 새로 결정된 기준선 및 POC 값을 기준으로 곡선의 원점이 이동합니다.
- 기본 창의 아이콘을 클릭하여 두 번째 탄력성 맞춤 루틴을 추가합니다.
- 모든 맞춤 매개변수를 다시 설정하고 X min에서 원하는 들여쓰기를 지정합니다. POC 위치의 결정과 계산된 들여쓰기 깊이를 구체화하기 위해 필요한 만큼 단계(2~3단계로 충분해야 함)를 추가합니다. 이 시점에서 프로세스를 저장할 수 있습니다.
- 유지를 클릭하고 맵의 모든 곡선에서 이전 단계를 반복하려면 모두에 적용합니다.
- 결과를 저장합니다. 이미지와 .tsv 파일을 얻을 수 있습니다.
2. 투르고르 압력 측정
참고: 애기장대의 오리잘린 처리 된 꽃가루 메리 스템의 예가 제시된다.
- 생물학적 샘플의 준비
- 극성 보조 수송 억제제 1-N-Naphthylphthamic acid 1-N-Naphthylphthamic acid 1-N-Naphthylphthamic acid 1-N-Naphthylphthamic acid 1-N-Naphthylphthamic acid 1-N-Naphthylphthamic acid (NPA)를 포함하는 배지상에서 자란 시험관 내 식물에서 미세투관 탈중합 약물 인 oryzalin로 처리된 애기장대 꽃가루마리(IM)를 수집한 다음 공보방법 6.
- 두 가지 옵션 중 하나에 따라 IM 샘플 장착
- 장기 모니터링을 위해: 애기장대 정점 배양 배지(ACM)7,8 및 0.1% 식물 보존 혼합물(PPM)을 함유한 페트리 접시에 시료를 장착하여 오염을 방지합니다. ACM 표면 위의 IM 팁을 일시 중단하고 2 % 아가로즈 의 방울로 IM의 베이스를 지원합니다.
- 신속한 용액 변화로 측정하기 위해: 작은 접착제 매스틱 조각을 들고 있는 페트리 접시에 샘플을 장착하고, 매스틱과 시료 베이스 사이의 간격을 바이오 호환 접착제로 신속하게 밀봉합니다. 접착제가 고화될 때까지 기다린 다음 0.1% PPM을 함유한 액체 ACM에 샘플을 담급전시.
참고: 시료 베이스를 고정할 때 시료 표면이 아가로즈 또는 접착제로 코팅되지 않았는지 확인합니다. 터거 압력의 AFM 측정은 시료를 안정적으로 장착해야 하며, 이전의 장착 방법은 허용 가능한 안정성을 제공합니다. 샘플에 따라 양면 테이프, 폴리 리신 등과 같은 다른 장착 방법이 사용될 수 있습니다.
- AFM 교정
- AFM 수집 소프트웨어를 켜고 PeakForce QNM(대진폭) 측정 모드를 선택합니다.
- 2.1단계에서 2.6단계와 동일한 원리에 따라 교정을 수행합니다.
- [매개변수 확인] 창에서 스캔 크기를 0으로 설정합니다. 램프 창에서 경사로 크기를 200nm에서 500nm 사이로 설정하고, 2V에서 5V 사이의 트리그 임계값과 샘플 수를 2048 이상으로 설정합니다.
- 캔틸레버 팁을 교정 샘플에 정렬하고 접근 방식을클릭합니다.
- 접촉시 램프 창으로 이동하여 버튼을 클릭합니다. 곡선의 선형 스키마에서 민감도 업데이트 버튼을 클릭하여 경사를 결정합니다. 편향 감도 측정을 여러 번 반복하고 메뉴 교정에서 탭 검출기를 열어 측정 평균으로 교정을 수동으로 업데이트합니다.
- AFM 헤드를 후퇴하고 교정 샘플을 제거합니다.
참고: 탭 Stage → 초기화를 선택하여 AFM 헤드를 완전히 철회하여 샘플 변경 시 우발적인 단단한 접촉을 방지하는 것이 좋습니다.
- 힘 분광법 실험 설정 및 수집
- 시료가 아직 물에 잠기지 않은 경우 PPM이 포함된 액체 ACM으로 잠급합니다.
- 수집 소프트웨어에서 다음과 같이 측정 매개변수를 지정합니다.
- [확인 매개변수 창]에서 2.8단계에서와 같이 캔틸레버의 제조된 스프링 상수 또는 결정된 스프링 상수로 스프링 상수를 설정합니다. 이 예제에서는 42 N/m로 설정됩니다.
- 이 예제에서는 팁 반지름을 400nm로 설정합니다.
- 물이 주로 터고 압력에 기여하기 때문에 샘플 푸아송의 비율을 0.5로 설정합니다.
- 신속한 수집을 위해 샘플/라인을 128로 설정합니다.
- 스캔 속도를 0.2Hz로 설정합니다.
- 스캔 크기를 1 μm로 설정합니다.
참고: 스캔 속도와 스캔 크기를 작게 설정하면 AFM 스캔 트리거 샘플 손상을 효과적으로 방지할 수 있습니다. 샘플 변경 시 이러한 두 매개 변수를 줄이는 것이 좋습니다. - 램프 창에서 램프 크기를 5 μm로 설정합니다.
참고: 더 나은 기준선 수집을 위해 의도한 들여쓰기 깊이보다 더 큰 램프 크기를 설정하는 것이 좋습니다. - Trig 임계값을 최대값으로 설정합니다.
- 샘플 수를 4608로 설정합니다.
- 선택적으로 현미경 → 참여 매개 변수 탭에서 다음 매개 변수를 줄여 강력한 접촉 유발 시료 손상을 방지합니다. 피크 힘 참여 설정점을 0.3V(기본 0.5V)로 설정합니다. 참여 int. 게인을 0.5(기본값 0.75)로 설정합니다. SPM 참여 단계를 4 μm(기본 값 15 μm)로 설정합니다.
- 샘플을 AFM 헤드 아래에 놓고 정렬하고 캔틸레버가 물에 잠기지만 샘플 표면과 접촉하지 않을 때까지 접근합니다.
참고: 접근하는 동안 캔틸레버와 액체 표면 사이에 액체 브리지가 형성 될 때까지 액체 ACM 의 표면에 가볍게 불어. 이렇게 하면 일반적으로 하드 접촉이 방지됩니다. - 신중하게 샘플쪽으로 수동으로 접근하십시오. 프로브가 샘플 표면에 상대적으로 가까우면 접근 방식을클릭합니다.
- 접촉시, 샘플 및/또는 캔틸레버를 손상시키지 않고 원하는 균형이 될 때까지 스캔 크기 및/또는 스캔 속도를 서서히 늘립니다.
참고: 스캔 크기는 샘플의 표면 곡률 및 거칠기에 의해 제한됩니다. 오리잘린 처리 IM의 경우, 50 x 50 μm2 스캔 영역은 0.3 Hz의 스캔 속도로 달성 될 수있다. - 스캔하는 동안 측정 영역이 원하는지 확인합니다. 필요한 경우 재배치합니다. 만족하면, 버튼을 클릭 포인트와 촬영을 클릭하여 포인트를 시작하고 창을 촬영합니다.
- 스캔을 기록하기 전에 셀 윤곽을 명확하게 식별할 수 있는 적절한 이미지 채널을 선택합니다. 종종 피크 힘 오류, DMT 계수, LogDMT 계수 또는 소산이 적합합니다. 디렉터리 및 파일 이름 저장을 지정합니다. 그런 다음 다음 스캔에서 램프를 클릭하여 녹화를 시작합니다.
참고: dot와 세 개의 숫자의 문자열은 지정된 파일 이름(예: .000) 후에 자동으로 추가됩니다. 이 숫자는 저장된 각 스캔 반복시 자동으로 1씩 증가합니다. - 스캔이 완료되면 소프트웨어 인터페이스가 자동으로 램프 창으로 리디렉션됩니다. 스캔한 이미지를 클릭하여 들여쓰기할 위치를 지정합니다.
참고: 들여쓰기를 기록하기 전에 램프만클릭하여 테스트 들여쓰기를 수행하기 위해 여러 랜드마크를 선택하는 것이 좋습니다. 들여쓰기 깊이는 세포벽 두께보다 커야 합니다(이상적으로 는 투과 전자 현미경검사법에 의해 별도로 결정). - 바리센터 근처의 셀당 적어도 세 개의 들여쓰기 사이트를 선택하고 사이트당 들여쓰기를 세 번 반복합니다. 이것은 추가 분석을 위해 셀당 적어도 9개의 힘 곡선을 산출할 것입니다. 들여쓰기 사이트 배치에 만족하면 램프를클릭하고 캡처합니다. 힘 들여쓰기 곡선은 지정된 디렉터리에 자동으로 저장됩니다.
- 경사로가 완료되면 타일 측정을 위해 다른 위치로 재배치하거나 스캔 헤드를 리트랙트하고 샘플을 변경합니다.
- 완료되면 1.3.8 단계와 1.3.9 단계에서와 같이 캔틸레버를 청소하십시오.
- 데이터 분석
- 분석 소프트웨어에서 *.mca 파일을 엽니다. 스캔한 이미지에서 각 힘 곡선의 위치를 보여 주며, 이 곡선은 원하는 경우 해석을 위해 힘 커브를 미리 선택합니다.
- 일반적으로 x0000y.00z형식으로 분석할 하나의 힘 곡선을 열면 x는 저장 디렉토리에 지정된 파일 이름인 반면 y와 z는 들여쓰기 시퀀스 및 스캔 번호를 나타내는 자동으로 등록된 숫자입니다.
- 기준선 보정 버튼을 클릭하고 소스 기준선 시작 확장 및 소스 기준선 확장 중지가 각각 0% 및 80%가 될 때까지 힘 곡선의 파란색 대시 선을 드래그합니다. 실행을클릭합니다.
참고: 또는 소스 기준선 확장 중지가 기준선 내에 있고 접촉점을 벗어나지 않는 한 다른 값으로 설정할 수 있습니다. - 박스카 필터 버튼을 클릭하고 실행을 클릭하여 힘 곡선을 매끄럽게 합니다.
- 들여쓰기 단추를 클릭합니다.
- 입력 창에서 활성 곡선을 확장하도록설정합니다.
- 맞춤 방법을 선형화 모델로 설정하고 접착력을 예로포함합니다.
- 최대 힘 맞춤 경계를 99%로 설정하고 최소 힘 맞춤 경계를 75%로 설정합니다.
- 맞춤 모델을 강성(선형)으로 설정합니다.
참고: 이 설정은 터거 압력 차감에 대한 명백한 강성 k를 계산합니다. 이 예에서 맞춤 경계는 약 1.5 μm 들여쓰기 깊이의 강성 맞춤을 반영합니다.
- 힘 곡선은 일괄 분석할 수 있습니다. 실행 기록 단추를 클릭하고 보고서 디렉토리를 지정하고 동일한 처리가 필요한 다른 모든 힘 곡선을 추가합니다. 만족하면 실행을클릭합니다. 기본적으로 맞춤은 *.txt 파일로 저장됩니다.
- k가 일괄 처리되어 있으면 기록 → 5 들여쓰기를 클릭하여 들여쓰기 창으로 돌아갑니다.
- 최대 힘 맞춤 경계를 10%로 변경하고 최소 힘 맞춤 경계를 0%로 변경합니다.
- 맞춤 모델을 헤르치안(구형)으로 설정합니다.
참고: 이것은 터거 압력 공제에 대한 세포벽 Young의 계수 E를 계산합니다. 이 예에서 맞춤 경계는 약 0.4 μm 들여쓰기 깊이의 Hertzian 맞춤(구형 프로브 사용)을 반영합니다.
- E에 대한 배치 맞춤에 대한 2.4.6 단계를 반복합니다.
- *.00z 파일(z는 자동으로 등록된 스캔 번호)을 열어 다른 스캔 채널을 표시합니다. 높이 채널 창에서 단면 단추를 클릭합니다. 이를 통해 터거 압력 공제에 필요한 시료의 표면 곡률을 측정할 수 있습니다.
- 한 셀의 긴 축에 걸쳐 선을 그리고 대시 선 경계를 셀 가장자리로 이동하고 반지름 값 r1을 기록합니다. 짧은 축에 대해 이 작업을 반복하여 반지름 r2를검색합니다. 셀의 표면을 계산하면 다음과 같이 두 개의 반경 측정을 사용하여 곡률 θM 및 가우시안 곡률 θG를 계산합니다.
및
- 한 셀의 긴 축에 걸쳐 선을 그리고 대시 선 경계를 셀 가장자리로 이동하고 반지름 값 r1을 기록합니다. 짧은 축에 대해 이 작업을 반복하여 반지름 r2를검색합니다. 셀의 표면을 계산하면 다음과 같이 두 개의 반경 측정을 사용하여 곡률 θM 및 가우시안 곡률 θG를 계산합니다.
- 다음과 같이 9에 게시된 얇은 쉘 모델을 사용하여 터고 압력 P를 추론합니다.
와 함께
여기서 t는 세포벽 두께가 예를 들면 전자 현미경 검사법에 의해 결정됩니다.
참고: 터거 압력의 공제는 반복이 필요한 피팅 프로세스입니다. 일반적으로 4개의 반복을 통해 안정적인 제품을 재현할 수 있지만 더 많은 반복(예: 100회)을 수행할 수 있습니다. - 셀당 평균 E, k 및 P를 계산합니다. 또한 문서화를 위해 세포내 변동성(예: 표준 편차)을 등록합니다.
및
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Representative Results
그림 1A 및 그림 1B는 QI 맵을 획득할 위치를 찾는 데 사용되는 프로토콜의 1.3.4 ~ 1.3.6 단계의 결과를 보여주는 스크린샷을 보여 준다. 관심 영역이 기울어진 표면 (즉, 가능한 한 평평하지 않도록)에 선택되었음을 언급 할 가치가 있습니다. 사실, Routier 등 5에의해 발견 된 바와 같이, 들여 쓰기 축이 표면에 수직이 아닌 경우, 측정 영의 계수는 과소 평가 될 수있다. 이 효과는 그림1의 C 또는 D 패널의 오른쪽 위 모서리에 표시되며, 여기서 셀 테두리의 일부가 셀의 나머지 부분보다 부드러워 보입니다. 이 효과에 의해 유도된 아티팩트는 국소 기울기 각도가 50 x 50 μm2 스캔 영역을 통해 40°를 쉽게 극복할 수 있는 메리스템의 경우 훨씬 더 강할 것입니다. 우리의 실험실에서는, 우리는 현재 Routier 외 5에 의해 기술된접근에 근거를 둔 알고리즘을 개발하고 있습니다, 그 유물을 정정하기 위하여 (준비에 있는 종이). 그림 1C 및 그림 1D는 프로토콜의 네 번째 단락에서 상세히 분석한 후에 얻은 영의 계수 지도를 보여줍니다. 특히, 패널 C는 전체 들여쓰기를 분석하여 얻은 영의 계수를 나타내며, 패널 D는 제100 nm의 들여쓰기(단계 1.4.9에 설명된 대로)의 분석 결과를 나타낸다. 여기서 2개의 맵은 실험 설정 중에 약 100nm의 평균 들여쓰기를 얻기 위해 설정점을 선택했기 때문에 매우 유사하게 보입니다. 분석된 들여쓰기의 변화는 때때로 더 나은 하이라이트 샘플 이질성으로 이어질 수 있으며, 이는 위치를 식별하거나 내부 구조의 동작에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다 (예를 들어, Costa et al.10)
그림 2의 힘 곡선은 언급할 가치가 있는 두 가지 효과를 보여 주십습니다. 우선, 힘 곡선의 접근 부분이 실제로 500 nN의 설정점에서 끝나는 경우 하향 팁 이동이 계속 진행되며 팁에 의해 가해지는 최종 힘이 예상보다 높다는 것을 알 수 있습니다(여기 1,000n). 이는 캔틸레버 편향을 모니터링하는 피드백 루프가 즉각적으로 작용하지 않기 때문에 유한한 반응 시간이 편향 임계값 검출과 압전 운동 정지 사이의 지연을 야기하기 때문입니다. 또한, 특히 샘플 홀더를 이동하는 CellHesion을 사용할 때 움직이는 부품의 관성현상이 발생하여 이 시간이 더 길어집니다. 이 문제는 헤드 압전을 사용하여 제한 될 수 있습니다.이 경우 사용자는 매우 거칠거나 기울어진 샘플에서 측정의 경우 정말 조심해야하거나 램프 속도를 줄임으로써 해상도 및 / 또는 스캔 된 샘플 수를 제한합니다 . 또한 너무 느린 맵의 경우 샘플 증가가 문제가 될 수 있습니다) 일반적으로 힘 곡선이 서로 충분히 멀리 있는 경우(선택한 들여쓰기 모델에 따라 들여쓰기 깊이를 고려하여 들여쓰기 영역의 반지름을 계산하고 최소 분리 거리로 사용됨) 다른 측정에서 수행되는 측정 샘플을 따라 위치 상관 해서는 안 하 고 분석 접근 곡선에 수행 되는 경우, 힘 임계값을 극복 하는 문제가 되지 않아야 합니다. 어쨌든, 견본이 섬세하거나 반복된 검사가 같은 지역에 행해진 경우에, 과학자는 이 오버슈트를 최소화하기 위하여 시도할 수 있습니다. 불행하게도, 이 오버 슈트의 양을 결정하는 엄지 손가락의 규칙이 없습니다, 그것은 램프 속도에 사용되는 압파에 따라 달라집니다, 뿐만 아니라 재료 특성에 : 재료가 딱딱, 시간에 편향 신호의 빠른 변화, 그리고 , 유한한 피드백 응답 시간을 감안할 때 오버슈트가 높을수록 높아지어집니다.
두 번째로 주목해야 할 점은 타원으로 강조 표시된 리트랙트 커브의 흔들림입니다. 이러한 흔들림은 팁의 작용하에 샘플이동/진동의 지표가 될 수 있습니다. 이 경우 사용자는 스캔 된 영역 (때로는 현미경의 다른 부분이지만 팁이 샘플을 만질 수 있거나 샘플이 지지체에 충분히 고정 될 수 있음) 또는 샘플 중 몇 가지가 동일한 지지체에 제조 된 경우 샘플을 변경하려고 할 수 있습니다. 기능이 항상있는 경우,이 경우 생체 적합성 접착제에 양면 테이프 고정에서 전환, 고정 방법을 변경하는 것이 좋습니다.
그림 3은 터거 압력 차감에 대한 주요 매개변수의 결정을 도시합니다. 전자 현미경검사법에 의해 별도로 결정된 세포벽 두께(11)를 제외한 모든 파라미터는 ~740 nm로, AFM 스캔 및 들여쓰기로부터 검색할 수 있다. 2.4.10단계의 피팅 공정에 따라, 터거 압력은 이 힘 곡선에 대해 1.50 MPa로 추론됩니다. 이 셀의 모든 18개의 힘 곡선을 풀링하면 E = 6.77 ±1.02 MPa, k = 14.18 ±2.45 N/m 및 P = 1.45±0.29 MPa(평균± 표준 편차)의 평균 값을 산출합니다.
그림 1 : 일반적으로 실험 중에 획득한 지형 도면(높이 측정). (A) 스캔할 적절한 영역을 찾기 위해 첫 번째 저해상도/저력 맵이 기록됩니다. (B) 영의 계수를 계산하기 위해 더 작은 고해상도/높은 힘 맵을 획득합니다(검은색 점선 사각형으로 강조 표시된 영역). (C) 1.4단계에서 자세히 설명한 대로 B 맵에서 계산된 영의 모듈러스 맵입니다. 여기서 영의 계수 맵은 각 힘 곡선의 전체 들여쓰기를 분석하여 얻었습니다. (D) 영의 계수지도는 들여쓰기의 처음 100 nm만 분석한 것을 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 힘 곡선의 예. 파란색으로 접근 방식은 빨간색으로 리트랙트랙 세그먼트입니다. 유한 피드백 루프 반응 시간과 관성으로 인해 힘 최대값(리트랙트 곡선에 있음)은 힘 설정점과 다릅니다. 후퇴 곡선의 흔들림은 지지에 대한 샘플 고정의 결핍을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 터고 압력 차감에 대한 AFM 측정. (A) DMT 계수 맵은 셀 바리센터 근처의 심층 들여쓰기 부위의 위치를 감독하기 위해 명확한 셀 윤곽을 보여줍니다. 들여쓰기 사이트는 십자가로 표시됩니다. (B) A의적십자 자세에서 깊은 들여쓰기의 힘 곡선. 세포벽 영의 계수 E(녹색) 및 샘플 명백한 강성 k(빨간색)는 2.4단계에서 자세히 설명된 바와 같이 곡선의 상이한 정권에 장착된다. R (것)에 2는 맞춤의 결정 계수를 나타냅니다. (C) 패널 C(파란색, 긴 축 빨간색, 짧은 축)에서 셀의 길고 짧은 축의 높이 프로파일을 패널 A와 B(D)로 분석한 동일한 셀의 흰색 선으로 묘사된 a의 길고 짧은 축이 수동으로 결정된 높이 맵과 fitte 곡률의 d 반경(r1 및 r2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
식물의 모양의 출현은 주로 시간과 공간 동안 성장의 조정 속도와 방향에 의해 결정된다. 식물 세포는 다사카리딕 매트릭스로 만들어진 단단한 세포벽에 싸여 있으며, 이 세포는 이를 함께 붙입니다. 그 결과, 세포 확장은 세포벽에 당기는 터거 압력과 이 압력에 저항하는 세포벽의 강성 사이의 평형에 의해 제어된다. 근본적인 발달메커니즘을 이해하기 위해서는 주어진 장기의 다른 조직 또는 세포에서 세포벽 기계적 특성뿐만 아니라 터고 압력을 모두 측정할 수 있어야 합니다. 이 백서에서 설명한 것처럼 AFM은 이 컨텍스트에서 선택하는 방법입니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 탈수증을 피하기에 충분히 빨리해야 조직 준비입니다. 이는 특히 터거 압력을 측정하려는 경우 매우 중요할 수 있습니다. 매우 중요한 것은 시료를 기판에 정확하게 고정시키는 것입니다: 불안정한 샘플은 광학적으로 쉽게 감지할 수 있는 거시적 움직임, 또는 힘 곡선의 강한 변형과 같은 매우 명백한 효과를 초래할 수 있습니다. 어쨌든 샘플 진동이나 굽힘은 감지하기 위해 미묘할 수 있으며 결과에 아티팩트가 도입될 수 있습니다. 마지막으로, 또 다른 중요한 단계는 들여쓰기 매개 변수의 선택과 관련이 있습니다. 이는 결과의 품질에 대한 결정요인입니다.
넓은 영역(40-50μm 이상의 스캔 크기)에서 기계적 특성을 측정할 때 높이 차이가 높을 수 있으므로 Z 압전 범위의 한계에 도달하지 않고 표면을 제대로 추적하고 힘 곡선을 실현하기가 어렵습니다. 이 문제를 극복하기 위해 CellHesion 모듈이 사용되었습니다. 이 모듈은 100 μm 범위를 갖는 샘플 단계에 위치한 추가 Z 압전을 추가하여 위험한 Z 피에조 한계에 접근하지 않고 넓은 영역을 수집 할 수 있습니다.
이 방법의 첫 번째 제한사항은 표면 세포 층만 측정할 수 있다는 것입니다. 그러나, 최근 저자는 조직 섹션에 AFM을 사용했습니다 12,13,14. 이것은 고정 된 재료에서 수행되어야하지만, 그것은 깊은 세포 층의 기계적 특성에 대한 액세스를 제공 할 수 있습니다. 양자 택일로, 더 깊은 들여쓰기는 또한 공간 해상도15에더 큰 희생을 가진 이기는 하지만 살아있는 견본에 내부 조직의 기계적인 속성을 추론하기 위하여 수행되었습니다. 팁이 시료에 더 이상 수직이 아니므로 가파른 경사가 있는 서피스가 문제가 될 수 있기 때문에 두 번째 제한은 샘플 형상에 연결할 수 있습니다. 우리는 측정이 신뢰할 수있는 각도의 범위를 제한할 필요가 있고 우리는 현재이 현상에 연결된 잠재적 인 유물을 해결하기 위해 알고리즘을 개발하고 있다. 또한, 일부 조직은 측정을 차단할 수있는 상체 가정으로 덮여있다. 마지막으로, 들여쓰기는 세포 표면에 관하여 수직 방향으로 기계적인 속성을 측정하고 이것이 성장 수용량과 관련되었던 세포벽 확장성에 쉽게 연결될 수 있는지 궁금할 수 있습니다. 여러 연구는 경우15,16제안 .
AFM에 의한 힘의 측정/적용에 대한 보다 일반적인 관찰을 여기서 할 가치가 있습니다. 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 포토다이오드상에서 의 레이저 변위를 강제로 변환할 수 있도록 하기 위해서는 캘리브레이션이 수행되어야 한다. 이 캘리브레이션 하나의 매개변수인 편향 감도는 레이저 변위를 실제 캔틸레버 편향(일반적으로 nm에서 측정)으로 변환할 수 있으므로 이 계수는 광다이오드 출력 전압(수직 축을 따라)을 변위하도록 보정합니다. Nm. 두 번째 요소는 유연한 캔틸레버가 스프링처럼 동작하기 때문에 힘 단위(일반적으로 nN)에서 수직 캔틸레버 편향을 변환하는 N/m로 측정된 스프링 상수 K입니다. 절차가 단순하게 나타나더라도, 절차의 다른 단계에 영향을 미칠 수 있는 다른 오류 근원 때문에 AFM 힘 분광측정을 위한 K의 견고하고 재현 가능한 보정은 여전히 문제입니다. 예를 들어, 경직된 표면에서 힘 곡선을 실현하는 편향 감도의 측정은 팁이 표면에 미끄러지거나 표면이 완벽하게 세척되지 않거나 표면 전하가 정전기 반발을 유발하는 경우 잘못된 값으로 이어질 수 있습니다. 이전의 모든 경우에서 힘 곡선의 접촉 부분이 변형됩니다(선형 대신 더 기울어지거나 곡선).
프로토콜 섹션에 설명된 접촉 절차는 기존의 여러 교정 절차 중 하나일 뿐입니다. Sader 메서드(일부 AFM 소프트웨어에서 구현될 때 비접촉자라고도 함) 또는 참조 캔틸레버 방법 등 비교적 쉽고 저렴한 방법으로 사용할 수 있는 최소 2가지 이상의 방법이 있습니다. Sader 방법(17)은 원래 V 자형 캔틸레버에 대한 존 세이더에 의해 개발된 다음 직사각형 것들(18)에 대한 강성 기판에 힘 곡선의 취득을 필요로하지 않는다. 대신, 사용자는 캔틸레버의 길이와 폭, 캔틸레버가 있는 유체의 밀도 및 점도(일반적으로 공기, 물 또는 물과 같은 유체)를 지정해야 합니다. 그런 다음 열 스펙트럼을 획득하고 편향 감도와 스프링 상수를 모두 측정합니다. 이 방법은 강성 기판상에서 힘 곡선을 수행하여 손상될 수 있는 매우 날카롭거나 기능화된 팁을 사용할 때 유리합니다.
이전의 두 가지 방법은 열적으로 흥분된 캔틸레버의 진동 스펙트럼의 획득과 관련이 있습니다. 실온에서 강성 캔틸레버를 사용할 경우 평균 진동 진폭이 0.1nm 보다 낮을 수 있으므로 공진 피크가 더 작아지고 감지하기가 더 어려워집니다. 어쨌든, 적어도이 종이에 사용되는 두 기기모두에 대해 공진 피크는 실제로 공기와 물에서 감지되고 스프링 상수를 측정하기 위해 장착 될 수 있습니다 (측정이 액체에서 수행 될 때 공진 주파수가 낮은 쪽으로 이동한다는 것을 고려하십시오) 값과 피크가 넓어지다).
세 번째 방법은 열 조정을 사용하지 않지만 캔틸레버 K를 결정하기 위해 알려진 스프링 상수(일반적으로 5% 이하의 불확실성)가 있는 참조 캔틸레버 또는 참조 탄성 구조를 사용합니다. 이 경우 편향 감도를 측정하기 위해 강성 기판에서 첫 번째 힘 커브를 획득해야 합니다(곡선 모양에 영향을 미치는 가능한 모든 아티팩트와 함께 다시 제공됩니다). 그런 다음 경직성 기판은 기준 캔틸레버(일반적으로 보정된 스프링 상수로 팁이 없는 캔틸레버)로 대체되고 다른(또는 기타 몇 가지 다른) 힘 곡선이 수행되어 편향 감도값을 다시 기록합니다. 그런 다음 캔틸레버 스프링 상수가 다음과 같이 계산됩니다.
여기서 Kref는 기준 캔틸레버의 스프링 상수이며, S는 편향 감도를 측정하고, L은 길이이고 S강성은 강성에서 측정된 편향 감도입니다. 기판. ΔL은 팁과 기준 캔틸레버의 끝 사이의 오프셋이며 사용자가 수행한 정렬에 따라 달라지며 마지막으로 α는 AFM 제조업체가 지정한 캔틸레버의 기울기 각도입니다. 캔틸레버 또는 인덴터 교정을 위해 특별히 설계된 탄성 구조에서도 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 이러한 구조의 장점(일반적으로 원형)은 중앙에 있는 K가 일정하며 기하학적 매개변수 또는 AFM 팁의 정확한 위치에 의존하지 않으므로 L 및 ΔL을 제거한다는 것입니다. 이전 수식에서.
AFM 사용자는 이러한 모든 교정 방법이 서로 다른 오류 소스(첫 번째 및 세 번째의 편향 감도 결정, 제1 및 제2 및 기하학적 인 강성 캔틸레버의 경우 열 조정 사용)의 영향을 받습니다. 세 번째 에 대한 매개 변수 및 정렬뿐만 아니라 경우 참조 캔틸레버가 사용되는 경우 Kref의 교정 정확도) 및 접촉 방법은 팁에 잠재적으로 유해하다 (특히 세 번째, 교정이 두 가지의 사용을 부과 다른 샘플)을 참조하십시오. 이는 스프링 상수가 항상 특정 정밀도까지 결정되며 측정/적용된 힘이 된다는 것을 의미합니다(다른 교정 방법 및 정밀도에 대한 포괄적인 검토는 시코라19 참조). 이는 영의 계수 및 터거 압력도 캔틸레버 교정의 영향을 받습니다. 어쨌든, 다른 더 중요한 오류 소스는 이러한 수량을 계산할 때 (영의 계수 결정에 대한 단순화 된 모델사용과 같은) 따라서 항상 이러한 종류의 측정에서 절대 값을 얻는 것이 어려울 것입니다. 중요한 것은 동일한 샘플에서 동일한 사용자가 실험을 반복하는 경우 값이 호환되어야 한다는 의미로, 적당한 크기의 값과 서로 일관된 값을 얻는 것입니다. 이를 얻으려면 교정을 신중하게 수행해야 하며 오류 소스를 최소화해야 합니다(예: 음향 소음/진동만큼 제한). 반복 교정의 일관성을 높이는 데 초점을 맞춘 한 가지 가능한 전략은 최근 Schillers 등20의논문에서 제안되었으며, 11 개의 유럽 연구소의 협력 덕분에 오류를 보상하기위한 프로토콜 (SNAP이라고 함)이 제안되었습니다. 편향 감도 측정이 개발되었습니다. 이 논문에서 저자는 측정을 위해 직접 보정 된 캔틸레버를 사용하며, 어쨌든 동일한 프로토콜을 비 보정 캔틸레버에 적용 하여 처음 선택한 방법으로 교정 한 다음 첫 번째 스프링을 고려할 수 있습니다. 참조("보정") 값으로 상수입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
PLATIM 팀의 기술 지원에 감사드리며, 아레즈키 부다우드와 RDP 연구소의 생물물리학 팀원들에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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