Anvendelse af atomkraften mikroskopi til måling af mekaniske egenskaber og turgor tryk af planteceller og plantevæv

Summary

Her præsenterer vi atomkraften mikroskopi (AFM), der drives som et nano-og mikro-indryknings værktøj på celler og væv. Instrumentet giver mulighed for samtidig erhvervelse af 3D-overfladetopografi af prøven og dens mekaniske egenskaber, herunder Cell Wall Youngs modulus samt turgor tryk.

Abstract

Vi præsenterer her brugen af atomkraften mikroskopi til at indrykke plantevæv og genvinde sine mekaniske egenskaber. Ved hjælp af to forskellige mikroskoper i indrykningstilstand viser vi hvordan man måler en elastisk modulus og bruger den til at evaluere cellevæggens mekaniske egenskaber. Derudover forklarer vi også, hvordan man evaluerer turgor-trykket. De vigtigste fordele ved atomkraften mikroskopi er, at det er ikke-invasiv, relativt hurtig (5 ~ 20 min), og at stort set enhver form for levende plante væv, der er overfladisk flad kan analyseres uden behov for behandling. Opløsningen kan være meget god, afhængigt af spids størrelsen og antallet af målinger pr. arealenhed. En begrænsning af denne metode er, at det kun giver direkte adgang til det overfladiske cellelag.

Introduction

Atomkraften mikroskopi (AFM) tilhører scannings sonden mikroskopi (SPM) familie, hvor et tip med en radius af normalt et par nanometer scanner overfladen af en prøve. Påvisning af en overflade opnås ikke ved hjælp af optiske eller elektron baserede metoder, men via interaktions kræfterne mellem spidsen og prøveoverfladen. Således er denne teknik ikke begrænset til topografiske karakterisering af en prøve flade (3D-opløsning, der kan gå ned til et par nanometer), men giver også mulighed for måling af enhver form for interaktion kræfter såsom elektrostatiske, Van der Waals eller kontakt kræfter. Desuden kan spidsen bruges til at anvende kræfter på overfladen af en biologisk prøve og måle den resulterende deformation, den såkaldte "indrykning", for at bestemme dens mekaniske egenskaber (f. eks. Youngs modulus, viskoelastiske egenskaber).

Mekaniske egenskaber af plante cellevægge er afgørende for at blive taget i betragtning, når de forsøger at forstå mekanismer underliggende udviklingsmæssige processer^1,2,3. Faktisk, disse egenskaber er stramt kontrolleret under udvikling, især da cellevæg blødgøring er nødvendig for at tillade celler til at vokse. AFM kan bruges til at måle disse egenskaber og studere den måde, de skifter mellem organer, væv eller udviklingsmæssige stadier.

I dette papir beskriver vi, hvordan vi bruger AFM til at måle både cellmur mekaniske egenskaber og turgor tryk. Disse to applikationer er demonstreret på to forskellige AFM mikroskoper og er detaljeret her efter.

Protocol

1. måling af cellevæg mekaniske egenskaber

Bemærk: Eksempel på udviklingen af gynoecium Arabidopsis er præsenteret.

1. Forberedelse af de biologiske prøver
   1. Saml en lukket blomst knop på stadie 9 til 10 (ca. 0,5 mm lang) i henhold til offentliggjorte stadier beslutsomhed for Arabidopsis⁴. Under en binokulær, ved hjælp af fine pincet, skal du forsigtigt åbne opløbet for at kontrollere udviklingsstadiet og indsamle gynoecium placeret i midten af blomsten.
   2. Sæt gynoecium på dobbelt side tape placeret i midten af dækslet af en lille Petri skål (diameter på 5 cm).
      Bemærk: Som et alternativ kan biokompatibel lim også bruges til mere effektiv immobilisering af prøven ved indrykning.
   3. Tilsæt hurtigt vand, indtil prøven er helt dækket. Dette undgår dehydrering og reducerer adhæsion af spidsen til prøven. Alternativt nedsænkes prøven i flydende medium, såsom Arabidopsis Apex Culture medium⁵.
2. AFM kalibrering
   1. Sæt cantilever fjederkonstant k høj nok til at tillade deformation af prøven overflade op til den ønskede indrykning, men ikke for høj til at undgå tab af følsomhed.
      Bemærk: Som en grov tommelfingerregel, hvis Youngs modulus af prøven er kendt, kan størrelsesorden af foråret konstant vælges som k≈E * δ, hvor δ er den ønskede indrykning.
   2. Brug en R = 400 nm kugleformet spids med 15 μm spids-cantilever afstand.
      Bemærk: Spidsen radius er direkte relateret til lateral opløsning. Generelt for indrykning på biologiske materialer, vælge Afrundede spidser (R større end 10-20 nm) eller kolloid sonder. Små kolloid sonder kan være vanskeligt at bruge på grund af den lille afstand mellem spids ende og cantilever, der kan røre prøveoverfladen.
   3. Tænd for softwaren og Placer hovedet vandret mindst 2-3 h før eksperimentet: Dette vil gøre det muligt for hovedet at thermalize og vil undgå termisk-induceret cantilever-laser relative bevægelser. Hvis mikroskopet er udstyret med et Cellhesionmodul (udvidelse af det tilgængelige Z piezo-område til 100 μm i stedet for 15 μm), skal du først tænde for controlleren og derefter vælge CellHesion mode, når du starter softwaren.
   4. Monter Canti grebet på glas blokken, og monter blokken på hovedet. Placer en dråbe af et par mikroliter ultrarent vand på spidsen for at undgå dannelse af luftbobler, når spidsen er dyppet i vand.
   5. Placer en hård prøve (renset glas rutsjebane eller safir) og tilsæt 30-50 μl ultrarent vand.
      Bemærk: Den kalibreringsprocedure, der er beskrevet her, er den undertiden kaldte kontakt kalibrering. For det første er en kraft kurve lavet på en stiv og flad overflade, og derefter registreres svingnings spektret af den termisk spændte cantilever for at beregne fjeder konstanten. Andre kalibrerings protokoller findes og vil kortvarigt blive beskrevet i diskussionsafsnittet.
   6. Placer hovedet på scenen (Vær omhyggelig med at løfte Z-motorerne højt nok). Brug det optiske billede til omtrent at placere laseren på Canti håndtaget.
      1. Flyt laseren langs hovedaksen af cantilever overvågning af summen signal på Photo diode.
         Bemærk: Når der anvendes standard-cantihåndtag, skal der opnås et beløb større end 0,5 V.
      2. Flyt laseren langs den anden retning og maksimere summen signal for at placere laseren i midten af cantilever. Dette vil minimere Cross-Talk mellem lateral og lodret afbøjning.
   7. Måling af afbøjning følsomhed
      Bemærk: Photo diode læser laser forskydning og giver et signal i volt. For at kunne måle afbøjning i metrisk enhed, skal afbøjnings følsomheden måles.
      1. Indstil instrumentet i kontakt → kraft spektroskopi. Indstil et relativ setpunkt til 2 V, Z længde til 0,5 μm, og Udvid hastigheden til 2 μm/s (sample rate til 10000 Hz) og vælg Z closed loop.
      2. Åbn kalibrerings styringen , og vælg den del af kraft kurven (der skal være lineær) for at gøre en lineær pasform: den inverse af hældningen giver afbøjning følsomhed. Fotodiode aflæsning er nu kalibreret i metrisk enhed.
   8. Bestemmelse af fjederkonstant. I kalibrerings styringskal du vælge fjederkonstant for at køre en termisk frekvens anskaffelse. Hvis du vil gennemsnitligt signalet i længere tid, skal du vælge ∞ symbolet. Effekt spektret af den termisk spændte cantilever kan vise flere toppe; tegn en markering omkring den, der er placeret med lavest frekvens, så den passer til den.
      Bemærk: Hvis termisk melodi udføres i væske, resonans peak vil være bredere og dens frekvens sænkes i forhold til nominel en.
3. Force spektroskopi eksperiment opsætning og erhvervelse
   1. Prøven placeres på AFM-stadiet, og hovedet placeres over prøven.
      Bemærk: Sørg for, at hovedet er trukket tilstrækkeligt tilbage til at undgå en hård kontakt mellem spidsen og prøveoverfladen.
   2. Lad Canti grebet thermalize i et par minutter.
   3. I Qi -tilstand, tilgang med en setpoint kraft på 50 NN.
   4. Indstil en Z-længde på 4 μm og et scanningsområde til 80 x 80 μm² med et antal pixels på 40 x 40. I panelet Avancerede indstillinger for billeddannelse skal du indstille tilstanden til konstant hastighed. Indstil Forlæng og træk hastigheden op til 200 μm/ s og samplinghastigheder til 25 kHz.
   5. Start scanningen, og brug denne hurtige Low-Force-scanning til at kontrollere, om prøven bevæger sig. Kontroller, at det scannede område er fri for snavs eller afbøjes celler, og Find et område af interesse så fladt som muligt for at udføre målingerne.
      Bemærk: For at sætte pris på den virkelige prøve hældning, skal linje nivellering indstilles til off eller til konstant. En overdreven hældningsvinkel mellem indryknings aksen og overfladen vil have en effekt på den målte Youngs modulus⁵.
   6. Når et område af interesse er blevet placeret, skal du vælge en region på 40 x 40 til 60 x 60 μm² omkring det og øge pixeltallet for at nå 2 pixels/μm. Forøg setpunktet til 500 nm for at opnå 100-200 Nm af indrykningen. Juster denne værdi, hvis det er nødvendigt, i begyndelsen af eksperimentet. Reducer Z-længden til 2 μm. Formindsk forlæns og træk hastigheden op til 100 μm/s, og øg prøvehastigheden til 50 kHz.
   7. Start scanningen, og Gem outputtet (normalt sammensat af et billede og en datafil).
   8. I slutningen af målings dagen skal du fjerne spidsen og skylle den forsigtigt med ultrarent vand og 70% EtOH.
   9. Tør og fjern Canti grebet. For yderligere eksperimenter med samme spids, overveje at rense det med en våd-rengøring protokol og, hvis det er muligt, en opfølgende plasma O₂ behandling. Lad ikke vandet tørre på Canti håndtaget og/eller spidsen holderen for at undgå salt krystallisering.
4. Dataanalyse (for 6. x data processing softwareversion)
   1. Åbn databehandling software og indlæse datafilen.
   2. Klik på Brug dette kort til batchbehandling knappen for at bruge de samme analyseparametre på alle kurver af kortet.
   3. Vælg Hertz fiti Indlæs foruddefineret proces.
   4. Brug den første fane til at kontrollere eller ændre kalibrerings parametrene.
   5. I den anden fane skal du fjerne en forskydning (eller en forskydning plus en hældning) fra grundlinjen for at angive dens gennemsnitlige værdi til 0.
   6. I den tredje fane skal du estimere kontaktpunktet (POC) ved at betragte det som det første punkt, der krydser 0-styrken, når du kommer ned fra SetPoint-værdien langs Forlæng kurven.
   7. Den lodrette spids position beregner spids bevægelse ved at trække udbøjningen fra den målte højde. På dette trin skal du bruge ujævne højde (rå data) for følgende pasform, ved at markere det tilsvarende afkrydsningsfelt.
   8. Vælg den passende model for pasform under fanen elasticitet Tilpas . Hvis ingen eller svag vedhæftning er synlig på træk kurver (svarende til mindre end 10% af setpunkts kraften eller til den maksimale gennemsnitlige kraft ved den valgte indryknings dybde), skal model typen indstilles til Hertz/sneddon, og Forlæng kurven skal anvendes. I tilfælde af stærkere vedhæftning bør DMT-modellen, som står for Derjaguin-Muller-Toporov-modellen, foretrækkes og pasformen skal udføres på træk kurver (Se manual for detaljer om de tilgængelige kontakt modeller og relaterede formler).
      1. Indstil spids geometriske parametre baseret på nominel spids form. Her, spids form er sfære og spids radius er 400 nm.
      2. Indstil poisson's ratio til 0,5, da det er konventionelt udført for biologisk materiale (svarende til inkompressibel materiale).
   9. Tilpas op til bestemte indrykninger. Som standard udføres pasformen over hele kurven. Hvis pasformen skal udføres op til en bestemt indrykning, bør du først markere afkrydsningsfeltet Skift kurve . Dette vil flytte oprindelsen af kurven baseret på nyligt fastsatte baseline og POC værdier.
      1. Tilføj en anden elasticitet pasform rutine ved at klikke på ikonet i hovedvinduet.
      2. Sæt igen alle fit parametre og angive i X min den ønskede indrykning. Tilføj så mange trin som nødvendigt (2 til 3 trin skal være nok) for at finjustere fastlæggelsen af POC-positionen og efterfølgende den beregnede indryknings dybde. Processen kan gemmes på dette tidspunkt.
   10. Klik på Behold og Anvend på alle for at gentage de foregående trin på alle kurver på kortet.
   11. Gem resultaterne. Et billede og en. tsv filer vil blive opnået.

2. måling af turgor tryk

Bemærk: Et eksempel på den oryzalin-behandlede Blomsterstanden Meristem af Arabidopsis er præsenteret.

1. Fremstilling af biologisk prøve
   1. Saml Arabidopsis Blomsterstanden Meristem (im) behandlet med mikrotubulus depolymeriserende lægemiddel oryzalin fra in vitro-plantlet dyrket på medium, der indeholder Polar auxin transport hæmmer 1-N-naphthylphthalamic Acid (NPA) efter offentliggjort metode ⁶.
   2. Montering af IM-prøve efter en af de to muligheder
      1. Til langtidsovervågning: Monter prøven i en Petri skål, der indeholder Arabidopsis Apex Culture medium (ACM)^7,8 og 0,1% plantebeskyttelses blanding (ppm) for at forhindre kontaminering. Afbryd IM spids over ACM overflade og støtte basen af IM med et fald på 2% agopstået.
      2. Til måling med hurtige løsnings ændringer: Monter prøven i en Petri skål med et lille stykke klæbende mastiks, og forsegl hurtigt hullet mellem mastiks og prøve basen med bio-kompatibel lim. Vent på, at limen størkner (mindre end 2 min), og Nedsænk derefter prøven i flydende ACM, der indeholder 0,1% PPM.
         Bemærk: Sørg for, at prøveoverfladen ikke er belagt med agopstået eller lim ved fastgørelse af prøve basen. AFM måling af turgor tryk kræver, at prøven er stabilt monteret, og de tidligere monteringsmetoder giver acceptabel stabilitet. Afhængigt af prøven, andre monteringsmetoder kan anvendes, ligesom dobbeltsidet tape, poly-lysin, etc.
2. AFM kalibrering
   1. Slå AFM-anskaffelsesoftwaren til, og vælg måletilstanden Peakforce QNM (Large amplitude) .
   2. Udfør kalibrering efter samme princip som beskrevet i trin 2,1 til 2,6.
   3. I vinduet Kontroller parametre skal du indstille scanningsstørrelsen til 0. I rampe vinduet indstilles rampe størrelse mellem 200 nm og 500 nm, trig tærskel mellem 2 v og 5 v og antallet af prøver til 2048 eller højere.
   4. Justér cantilever spidsen med kalibreringsprøven og klik på approach.
   5. Ved kontakt skal du gå til rampe vindue og klikke på knappen kontinuerlig rampe. På kurvens lineære regime bestemmes hældningen ved at klikke på knappen Opdater følsomhed . Gentag afbøjnings følsomheds målingen flere gange, og Opdater kalibreringen manuelt med måle gennemsnittet ved at åbne tabulator sensoren fra menukalibreringen.
   6. Træk AFM-hovedet tilbage, og fjern kalibreringsprøven.
      Bemærk: Det foreslås helt at trække AFM hovedet tilbage ved at vælge tabulator trin → Initialiser for at forhindre utilsigtet hård kontakt ved prøve Skift.
3. Force spektroskopi eksperiment opsætning og erhvervelse
   1. Hvis eksemplet ikke er nedsænket endnu, skal du nedflette det med flydende ACM, der indeholder PPM.
   2. I anskaffelses softwaren skal du angive måleparametre som følger:
      1. I vinduet check parameter skal du indstille fjederkonstant til den fremstillede fjederkonstant eller den fastsatte fjederkonstant som i trin 2,8. I dette eksempel er den indstillet til 42 N/m.
      2. Indstil spids radius til 400 nm i dette eksempel.
      3. Sæt prøve Poissons forhold til 0,5, da vand bidrager primært til turgor tryk.
      4. Sæt prøve/linje til 128 for at sikre hurtig erhvervelse.
      5. Indstil scanningshastigheden til 0,2 Hz.
      6. Indstil scanningsstørrelsen til 1 μm.
         Bemærk: Indstilling af scanningshastigheden og scanningsstørrelsen Small kan effektivt forhindre AFM Scan-udløst prøve beskadigelse. Det anbefales at reducere disse to parametre ved enhver prøve ændring.
      7. I rampe vinduet indstilles rampe størrelsen til 5 μm.
         Bemærk: Det er bedre at indstille rampe størrelse større end tilsigtet indryknings dybde for bedre baseline erhvervelse.
      8. Indstil trig-tærsklen til maksimum.
      9. Angiv antal prøver til 4608.
      10. Alternativt kan du i mikroskop → engagements parametre -fanen reducere følgende parametre for at forhindre stærk kontakt-induceret prøve skade. Indstil Peak Force Engage SetPoint til 0,3 v (standard 0,5 v). Indstil Engage int. Gain til 0,5 (standard 0,75). Indstil Spm engagere trin til 4 μm (standard 15 μm).
   3. Placer og justér prøven under AFM-hovedet, og indflyvning, indtil cantilever er nedsænket, men ikke i kontakt med prøveoverfladen.
      Bemærk: Mens nærmer sig, let blæse på overfladen af flydende ACM indtil en flydende bro er dannet mellem cantilever og flydende overflade. Dette forhindrer normalt hård kontakt.
   4. Med omhu, manuelt tilgang til prøven. Når proben er relativt tæt på prøveoverfladen, skal du klikke på tilgang.
   5. Ved kontakt gradvist øge scanningsstørrelse og/eller scanningshastighed indtil den ønskede balance uden at beskadige prøven og/eller cantilever.
      Bemærk: Scanningsstørrelsen er begrænset af prøvens overflade krumning og ruhed. I tilfælde af oryzalin-behandlede IM, kan 50 x 50 μm² scanningsområde opnås med scanningshastigheden på 0,3 Hz.
   6. Under scanningen kan du finde ud af, om måleområdet er som ønsket. Flyt om nødvendigt. Når tilfreds, klik på knappen punkt og skyde for at indlede punkt og skydevindue.
   7. Før du optager scanningen, Vælg en passende billed kanal, der kan lette klar identifikation af celle konturer. Ofte er Peak Force Error, DMT modulus, LogDMT modulus eller dissipation egnet. Angiv Gem mappe og filnavn. Klik derefter på rampe ved næste scanning for at starte optagelsen.
      Bemærk: En streng af en prik og tre tal vil automatisk blive tilføjet efter dit angivne filnavn (som. 000). Dette tal forøges automatisk med 1 ved hver gemt scannings gentagelse.
   8. Når scanningen er fuldført, bliver softwaregrænsefladen automatisk omdirigeret til rampe vinduet. Klik på det scannede billede for at angive de positioner, du vil indrykke.
      Bemærk: Før du optager indrykninger, er det bedre at vælge flere vartegn for at udføre test indrykninger ved at klikke på rampe kun, i tilfælde parameter vekslen er påkrævet (for rampe størrelse, piezo positionosv.). Indryknings dybden skal være større end cellens vægtykkelse (helst bestemt separat ved transmissionselektronmikroskopi).
   9. Vælg mindst tre indryknings steder pr. celle i nærheden af dens barycenter, og Gentag indrykningen tre gange pr. websted. Dette ville give mindst ni kraft kurver pr celle til yderligere analyse. Klik på rampe og Optag, når du er tilfreds med placeringen af indryknings stedet. Kraft-indryknings kurverne gemmes automatisk i den udpegede mappe.
   10. Når ramperne er fuldført, skal du flytte til en anden position for flise måling eller trække scannings hovedet og ændrings prøven tilbage.
   11. Når du er færdig, skal du rengøre Canti håndtaget som i trin 1.3.8 og 1.3.9.
4. Data analyse
   1. Åbn *. MCA-filen i analysesoftwaren. Dette viser positionen for hver kraft kurve på det scannede billede. Vælg om ønsket Force-kurver til analyse.
   2. Åbn en kraft kurve, der skal analyseres, normalt i formatet x0000y. 00Z, hvor x er det angivne filnavn i Gem mappe, mens y og z automatisk registreres numre, der angiver indryknings sekvens og scannings nummer.
   3. Klik på knappen Oprindelig korrektion , og træk de blå streg linjer på kraft kurven, indtil Forlæng kilde startpunktet for kilden og Forlæng kilde grundlinje stoppet er henholdsvis 0% og 80%. Klik på Udfør.
      Bemærk: Alternativt kan Forlæng kildelinje stop indstilles til forskellige værdier, så længe det stadig er inden for grundlinjen og ikke ud over kontaktpunktet.
   4. Klik på knappen Boxcar filter , og klik på Udfør for at udjævne kraft kurven.
   5. Klik på knappen indrykning .
      1. I indtastnings vinduet skal du indstille den aktive kurve til at udvide.
      2. Indstil fit-metoden til lineariseret model og Medtag vedhæftnings kraft til Ja.
      3. Indstil Max Force fit-grænsen til 99% og min Force fit-grænse til 75%.
      4. Sæt fit model til stivhed (lineær).
         Bemærk: Dette setup vil beregne den tilsyneladende stivhed k for turgor tryk fradrag. I dette eksempel afspejler pasgrænserne en stivhed på omkring 1,5 μm indryknings dybde.
   6. Kraft kurver kan analyseres i batch. Klik på knappen Kør historik , Angiv rapportmappe, og Tilføj alle andre kraft kurver, der kræver samme behandling. Klik på Kør, når du er tilfreds. Som standard gemmes pasformen som en *. txt-fil.
   7. Når k er batch monteret, skal du klikke på historik → 5 indrykninger for at vende tilbage til indryknings vinduet.
      1. Skift grænse for Max Force fit til 10% og min Force fit-grænse til 0%.
      2. Sæt fit model til Hertzian (sfærisk).
         Bemærk: Dette vil beregne Cell Wall Youngs modulus E for turgor tryk fradrag. I dette eksempel afspejler pasgrænserne en Hertzian pasform (med sfærisk sonde) på omkring 0,4 μm indryknings dybde.
   8. Gentag trin 2.4.6 for batch fit for E.
   9. Åbn *. 00Z-filen (z er det automatisk registrerede scannings nummer) for at få vist de forskellige scannings kanaler. Klik på sektions knap i vinduet højde kanal. Dette vil gøre det muligt at måleprøvens overflade krumning, der er nødvendig for turgor tryk fradrag.
      1. Tegn en linje på tværs af den lange akse i en celle, Flyt streg linje grænserne til cellekanterne, og Optag radius værdien r₁. Gentag dette for den korte akse for at hente radius r₂. Beregn cellens overflade gennemsnitlige krumning κ_M og Gaussian krumning κ_G ved hjælp af de to radier målinger som følger:
         Og 
   10. Af turgor Tryk P ved hjælp af den tynde Shell model offentliggjort⁹ som følger:
        
       Med
       
       hvor t er cellens vægtykkelse bestemt ved fx elektronmikroskopi.
       Bemærk: Fradraget af turgor tryk er en tilpasningsproces, hvor gentagelser er påkrævet. Fire iterationer er generelt i stand til at reproducere stabilt produkt, men flere gentagelser kan gøres (for eksempel 100 gange).
   11. Beregn gennemsnitlig E, k og P pr. celle. Registrer også den intracellulære variabilitet (f. eks. standardafvigelse) for dokumentation.

Representative Results

Figur 1a og figur 1b viser et skærmbillede, der illustrerer resultatet af trinene 1.3.4 til 1.3.6 i protokollen, som bruges til at finde en region af interesse, hvor man erhverver Qi-kortet. Det er værd at nævne, at regionen af interesse er blevet valgt for ikke at være på en skrå overflade (dvs., så fladt som muligt). Faktisk, som bemærket af Routier et al.⁵, hvis indryknings aksen ikke er vinkelret på overfladen, den unges modulus målt kan undervurderes. Denne effekt er synlig i øverste højre hjørne af C-eller D-panelerne i figur 1, hvor en del af cellens kant ser blødere ud end resten af cellen. Artefakterne induceret af denne effekt vil være langt stærkere i tilfælde af meristems, hvor den lokale hældningsvinkel let kan overvinde 40 ° over 50 x 50 μm² scanningsområder. I vores laboratorium, er vi i øjeblikket ved at udvikle en algoritme, baseret på den tilgang, der er beskrevet af Routier et al.⁵, at korrigere disse artefakter (papir under forberedelse). Figur 1c og figur 1d viser Youngs modulus-kort, som er indhentet efter den analyse, som er beskrevet i protokollens fjerde afsnit. Panel C repræsenterer især de unges modulus, der er opnået ved at analysere hele indrykningen, op til det brugerdefinerede kraft indstillingspunkt, mens panel D viser resultatet af analysen af den første 100 nm af indrykning (som beskrevet i trin 1.4.9). Her, de 2 kort ser meget ens, fordi der under eksperimentet set-up, er SetPoint blevet valgt for at opnå gennemsnitlige indrykninger omkring 100 nm. Variationen af den analyserede indrykning kan undertiden føre til bedre fremhævning prøve heterogeneities, der kan være nyttige for at identificere placeringen eller for at give oplysninger om opførsel af interne strukturer (f. eks Costa et al.¹⁰)

Kraft kurven i figur 2 viser to effekter, der er værd at nævne. Først og fremmest kan det bemærkes, at hvis tilgangen del af kraft kurven faktisk ender på SetPoint kraft af 500 nN, den nedadgående spids bevægelse fortsætter med at gå, hvilket betyder den endelige kraft påføres af spidsen er højere end forventet (her 1.000 nN). Dette skyldes det faktum, at feedback loop overvågning af cantilever afbøjning ikke virker øjeblikkeligt, så dens begrænsede reaktionstid introducerer en forsinkelse mellem afbøjning tærskel detektion og piezo bevægelse stop. Desuden, især når du bruger CellHesion, som flytter prøven indehaveren, inerti af de bevægelige dele kommer i spil, hvilket gør denne tid halter længere. Dette problem kan begrænses ved at bruge hovedet piezo, i hvilket tilfælde brugeren skal være virkelig forsigtig i tilfælde af målinger på meget ru eller skrå prøver, eller ved at reducere rampe hastigheden, som alligevel begrænser opløsningen og/eller antallet af prøver scannet ( Desuden for langsomme kort, kan prøven vokser blive et problem). Generelt, hvis kraft kurverne er langt nok fra hinanden (baseret på indryknings modellen af valg, kan radius af det indrykkede område beregnes på baggrund af indryknings dybden og anvendes som minimums separationsafstand), målingerne udført i forskellige positioner langs prøven bør ikke korreleres, og hvis analysen udføres på tilgangs kurven, bør det ikke være et problem at overvinde kraft tærsklen. Anyway, hvis prøven er delikat, eller hvis gentagne scanninger er udført på samme område, videnskabsmanden måske ønsker at forsøge at minimere denne overskridelse. Desværre er der ikke en tommelfingerregel til at bestemme mængden af denne overskridelse, da det afhænger af den piezo, der anvendes, på rampe hastigheder, men også på materielle egenskaber: stivere materialet, jo hurtigere variation af afbøjning signalet i tid og , i betragtning af en begrænset feedback responstid, jo højere overskuddet.

Den anden ting at bemærke er vinke på trække kurven fremhævet af ellipsen. En sådan vinke kan være en indikator for prøve flytning/vibrerende under virkningen af spidsen. I dette tilfælde kan brugeren forsøge at ændre det scannede område (sommetider anden del af mikroskopet, men spidsen kan røre ved prøven, eller prøven kan være utilstrækkeligt fastgjort til dens støtte) eller prøven, hvis flere af dem er blevet forberedt på samme støtte. Hvis funktionen altid er der, er det bedre at ændre fikserings metoden, i dette tilfælde skifte fra den dobbeltsidet tape fiksation til biokompatible lim.

Figur 3 skildrer bestemmelsen af nøgleparametre for turgor tryk fradrag. Hver parameter, bortset fra cellevægtykkelse¹¹ , som blev separat bestemt af elektronmikroskopi til at være ~ 740 nm, kan hentes fra AFM scanninger og indrykninger. Efter monteringsprocessen i trin 2.4.10 udledes turgor trykket for at være 1,50 MPa for denne kraft kurve. Ved at samle alle atten kraft kurver i denne celle er gennemsnitsværdien af E = 6,77 ± 1,02 MPA, k = 14,18 ± 2,45 N/m og P = 1,45 ± 0,29 MPa (gennemsnitlig ± standardafvigelse).

Figur 1 : Topografi kort (højde målt), som typisk erhverves under et eksperiment. A) der registreres et første kort med lav opløsning/lav kraft for at finde et egnet område, der skal scannes. (B) en mindre høj opløsning/højere kraft kort er erhvervet til beregning af Youngs modulus (på området fremhævet af den sorte stiplede firkant). (C) Youngs modulus-kort beregnet ud fra B-kortet, som beskrevet i trin 1,4. Her, den Youngs modulus kort er blevet opnået analysere hele indrykningen på hver kraft kurve. (D) Youngs modulus-kort opnåede kun at analysere den første 100 nm af indrykning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Eksempel på Force Curve. I blå tilgang, i rødt trække segmentet. Force Maximum (placeret på træk kurven) er forskellig fra kraft setpunktet på grund af finite feedback loop reaktionstid og på grund af inerti. Vinke i træk kurven kan være repræsentativ for en mangel i prøve fiksering til sin støtte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : AFM målinger for turgor tryk fradrag. (A) DMT modulus-kort viser klar celle kontur til at overvåge placeringen af dybe indryknings steder nær Cell barycenter. Indryknings steder er markeret med kryds. (B) kraft kurve med dyb indrykning ved Røde Kors position i A. Cell Wall Youngs modulus E (grøn) og prøve tilsyneladende stivhed k (rød) er monteret på forskellige regimer af kurven som beskrevet i trin 2,4. R ² angiver koefficient for bestemmelse af pasformen. (C) højde kort med manuelt fastsatte lange og korte akser af a, afbildet med hvide linjer, af den samme celle analyseret i paneler a og B.d) højde profil for de lange og korte akser i cellen i panel C (blå, lang akse rød, kort akse) og uoriginale d krumningsradier (r₁ og r₂). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Fremkomsten af former i planter er primært bestemt af den koordinerede hastighed og retning af vækst i tid og rum. Planteceller er indkapslet i en stiv cellevæg lavet af en polysaccharidic matrix, som lim dem sammen. Som et resultat, celle ekspansion styres af balancen mellem turgor tryk trækker på cellens væg, og stivhed af cellens væg modstå dette pres. For at forstå de mekanismer underliggende udvikling, er det vigtigt at være i stand til at måle både cellevæg mekaniske egenskaber samt turgor tryk i forskellige væv eller celler i et givet organ. Som det fremgår af dette dokument, er AFM den foretrukne metode i denne sammenhæng.

Der er flere kritiske trin i protokollen. Den første er vævs præparatet, som skal være hurtigt nok til at undgå dehydrering. Dette kan især være kritisk, hvis vi ønsker at måle presset fra turgor. Meget vigtigt er også en korrekt fiksering af prøven til dens substrat: en ustabil prøve kan føre til meget indlysende virkninger som en makroskopisk bevægelse, der let kan detekteres optisk, eller en stærk deformation af kraft kurver. Anyway, prøve vibration eller bøjning kan være subtile at opdage, introducerer artefakter i resultaterne. Endelig drejer et andet kritisk skridt sig om valget af indryknings parametrene. Dette er afgørende for kvaliteten af resultaterne.

Ved måling af mekaniske egenskaber på store områder (over 40-50 μm scannings størrelser) kan højdeforskelle være høje, hvilket gør det vanskeligt at spore overfladen korrekt og realisere kraft kurver uden at nå grænserne for Z piezo Range. For at løse dette problem, et CellHesion modul er blevet brugt. Dette modul tilføjer en ekstra Z piezo, placeret i prøvestadiet, der har en 100 μm rækkevidde, som tillader store områder erhvervelse uden at nærme faretruende Z piezo grænser.

Den første begrænsning af metoden er, at vi kun kan måle overfladiske cellelag. Men, for nylig forfattere har brugt AFM på vævs afsnit^12,13,14. Selv om dette skal gøres på fast materiale, det kan give adgang til mekaniske egenskaber af dybe cellelag. Alternativt, dybere fordybninger er også blevet udført for at udlede mekaniske egenskaber af indre væv på levende prøver, omend med større offer på rumlig opløsning¹⁵. En anden begrænsning kan knyttes til prøve geometri, da en overflade med en stejl hældning kan være problematisk, da spidsen ikke er mere vinkelret på prøven. Vi er nødt til at begrænse de forskellige vinkler, inden for hvilke foranstaltningerne er pålidelige, og vi er i færd med at udvikle en algoritme til at korrigere potentielle artefakter i forbindelse med dette fænomen. Også, nogle væv er dækket med trichomes som kan blokere målingerne. Endelig, indrykning måler mekaniske egenskaber i en vinkelret retning med hensyn til cellens overflade, og vi kan undre sig, hvis dette let kan knyttes til cellevæg udvidelsesmuligheder forbundet med vækstkapacitet. Flere undersøgelser tyder på, at det er tilfældet^15,16.

Det er værd at gøre her en mere generel observation om måling/anvendelse af kræfter ved AFM. Som beskrevet i afsnittet protokol, for at være i stand til at omdanne laser forskydninger på fotodiode til kræfter, en kalibrering skal udføres. I denne kalibrering en parameter, den afbøjning følsomhed, gør det muligt at konvertere laser forskydninger til faktiske cantilever afbøjning (generelt målt i nm), så denne faktor kalibrerer fotodiode output spændinger (langs de lodrette akser) til forskydninger i Nm. Den anden faktor er fjeder konstanten K, målt i N/m, som omdanner lodrette udbøjninger i kraftenheder (generelt nN), da de fleksible cantihåndtag opfører sig som fjedre. Selv om proceduren synes enkel, en robust og reproducerbar kalibrering af K for AFM Force spektroskopi målinger er stadig et problem, på grund af forskellige fejlkilder, der kan påvirke de forskellige trin i proceduren. For eksempel kan målingen af afbøjnings følsomheden, der realiserer en kraft kurve på en stiv overflade, føre til ukorrekte værdier, hvis spidsen glider på overfladen, eller hvis overfladen ikke er perfekt rengjort eller også hvis overflade ladning inducerer elektrostatisk afstødning. I alle de foregående tilfælde vil kontaktdelen af kraft kurven blive deformeret (yderligere skrå eller buet i stedet for lineær).

Den kontaktprocedure, der er beskrevet i afsnittet protokol, er kun én af flere eksisterende kalibreringsprocedurer. Der er mindst 2 flere metoder, der kan anvendes på en relativt let og billig måde: sader metode (også kaldet ikke-kontakt, når implementeret i nogle AFM software) eller reference cantilever metode. Sader metode¹⁷ er oprindeligt udviklet af John sader for V-formede cantihåndtag og derefter for rektangulære dem¹⁸ og behøver ikke erhvervelse af en kraft kurve på et stift substrat. I stedet skal brugeren specificere (ud af temperaturen som i kontaktmetoden), længden og bredden af udcingen og tætheden og viskositeten af væsken, hvor Canti håndtaget er (generelt luft, vand eller en vandlignende væsker). Derefter opnås et termisk spektrum, og både afbøjning følsomhed og fjederkonstant måles. Denne metode er fordelagtig, når du bruger meget skarpe eller funktionaliserede tips, der kan blive beskadiget gør en kraft kurve på en stiv substrat.

Begge de tidligere metoder vedrører erhvervelse af svingnings spektret af en termisk spændt cantilever. Når stive cantihåndtag anvendes ved stuetemperatur, kan den gennemsnitlige svingnings amplitude være lavere end 0,1 nm, hvilket gør resonans toppen mindre og vanskeligere at opdage. Anyway, i det mindste for begge instrumenter, der anvendes i dette papir, kan resonans peak faktisk påvises i luft og i vand og monteret til måling af fjederkonstant (i betragtning af, at når målingen sker i væske, resonansfrekvens skifter mod lavere værdier og Peak udvider).

En tredje metode ikke bruger en termisk melodi, men i stedet en reference cantilever eller en reference elastisk struktur, med en kendt fjederkonstant (generelt med en usikkerhed omkring eller under 5%), for at bestemme cantilever K. I dette tilfælde en første kraft kurve skal erhverves på en stiv substrat for at måle afbøjning følsomhed (som kommer igen sammen med alle mulige artefakter påvirker formen af kurven). Derefter erstattes det stive substrat af reference-udkanden (generelt et spids frit Canti håndtag med en kalibreret fjederkonstant) og en anden (eller få andre) kraft kurve udføres, der igen optager værdien af afbøjning følsomhed. Den cantilever fjederkonstant beregnes derefter som:

hvor K_Ref er fjeder konstanten for reference-cantilever, s_Ref den afbøjning følsomhed målt på det, L er dens længde og S_stiv er afbøjning følsomhed målt på den stive Substrat. Δl er forskydningen mellem spidsen og enden af reference udlappen og afhænger af den justering, som brugeren har foretaget, og endelig α er hældningsvinklen på Canti håndtaget, specificeret af AFM-producenten. Den samme metode kan anvendes på elastiske strukturer specielt designet til cantilever eller indrykning kalibrering. Fordelen ved disse strukturer (der er generelt cirkulære) er, at K i deres centrum er konstant og ikke afhænger af nogen geometrisk parameter eller på den præcise positionering af AFM spidsen på dem, så fjerne l og Δl fra den forrige formel.

AFM brugeren skal huske på, at alle disse kalibreringsmetoder er påvirket af forskellige fejlkilder (deformation følsomhed bestemmelse i første og tredje, brug af termisk melodi i tilfælde af stive cantihåndtag for første og anden og geometrisk parametre og justering for den tredje samt kalibrering nøjagtighed af K_Ref i sagen reference cantilever anvendes), og at kontaktmetoder er potentielt skadelige for spidsen (især den tredje, hvor kalibrering pålægger brug af to forskellige prøver). Dette indebærer, at fjeder konstanten altid vil blive fastlagt op til en vis præcision og så vil være de målte/anvendte kræfter (Se Sikora¹⁹ for en omfattende gennemgang af forskellige kalibreringsmetoder og deres præcision. Det betyder, at Youngs moduli-og turgor-Tryk også vil blive påvirket af cantilever kalibrering. Anyway, andre endnu vigtigere fejlkilder er involveret i beregningen af disse mængder (ligesom brugen af forenklede modeller for Youngs modulus bestemmelse), så det vil altid være en udfordring at opnå absolutte værdier ud af disse typer af målinger. Det vigtige er at opnå værdier, der er af den rette størrelsesorden, og som er i overensstemmelse med hinanden, hvilket betyder, at hvis forsøget gentages af den samme bruger på samme prøve, bør værdierne være kompatible. For at opnå det, skal kalibreringen ske omhyggeligt, og fejlkilder skal minimeres (for eksempel begrænse så meget som eventuelt akustisk støj/vibrationer). En mulig strategi med fokus på at øge sammenhængen i gentagne kalibreringer er for nylig blevet foreslået i et papir af Schillers et al.²⁰, hvor der takket være samarbejdet mellem 11 europæiske laboratorier, en protokol (kaldet snap) for at kompensere for fejl i bestemmelse af afbøjnings følsomhed er blevet udviklet. I dette papir forfatterne bruger direkte kalibrerede Canti håndtag til deres målinger, Anyway den samme protokol kan anvendes til ikke-kalibrerede Canti håndtag, blot kalibrere dem første gang med metoden til valg og derefter overvejer det første forår konstant som referenceværdien ("kalibreret").

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.