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Developmental Biology

Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59674
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

Summary

Ici, nous présentons la microscopie de force atomique (AFM), actionnée comme outil de nano- et de micro-indentation sur des cellules et des tissus. L'instrument permet l'acquisition simultanée de la topographie de surface 3D de l'échantillon et de ses propriétés mécaniques, y compris le modulus de la paroi cellulaire de Young ainsi que la pression de la turgor.

Abstract

Nous présentons ici l'utilisation de la microscopie de force atomique pour indenter les tissus végétaux et récupérer ses propriétés mécaniques. À l'aide de deux microscopes différents en mode d'indentation, nous montrons comment mesurer un modulus élastique et l'utilisons pour évaluer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. En outre, nous expliquons également comment évaluer la pression de turgor. Les principaux avantages de la microscopie par force atomique sont qu'elle est non invasive, relativement rapide (5 à 20 min), et que pratiquement n'importe quel type de tissu végétal vivant qui est superficiellement plat peut être analysé sans avoir besoin de traitement. La résolution peut être très bonne, en fonction de la taille de la pointe et du nombre de mesures par zone unitaire. Une limitation de cette méthode est qu'elle ne donne qu'un accès direct à la couche cellulaire superficielle.

Introduction

La microscopie par force atomique (AFM) appartient à la famille de la microscopie de la sonde de balayage (SPM), où une pointe avec un rayon de quelques nanomètres scanne habituellement la surface d'un échantillon. La détection d'une surface n'est pas réalisée par des méthodes optiques ou à base d'électrons, mais par les forces d'interaction entre la pointe et la surface de l'échantillon. Ainsi, cette technique ne se limite pas à la caractérisation topographique d'une surface d'échantillon (résolution 3D qui peut descendre à quelques nanomètres), mais permet également la mesure de tout type de forces d'interaction telles que l'électrostatique, van der Waals ou les forces de contact. En outre, la pointe peut être utilisée pour appliquer des forces à la surface d'un échantillon biologique et mesurer la déformation résultante, la soi-disant «indentation», afin de déterminer ses propriétés mécaniques (par exemple, le modulus de Young, les propriétés viscoélastiques).

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires végétales sont essentielles pour être prises en compte lors de l'essai de comprendre les mécanismes sous-jacents aux processus de développement1,2,3. En effet, ces propriétés sont étroitement contrôlées au cours du développement, en particulier depuis l'adoucissement de la paroi cellulaire est nécessaire pour permettre aux cellules de se développer. L'AFM peut être utilisé pour mesurer ces propriétés et étudier la façon dont elles changent entre les organes, les tissus ou les stades de développement.

Dans cet article, nous décrivons comment nous utilisons l'AFM pour mesurer à la fois les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire et la pression de la turgor. Ces deux applications sont démontrées sur deux microscopes Différents De l'AFM et sont détaillées ici après.

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Protocol

1.Mesure des propriétés mécaniques de mur de cellules

REMARQUE: L'exemple du gynoecium en développement d'Arabidopsis est présenté.

  1. Préparation des échantillons biologiques
    1. Recueillir un bourgeon de fleur fermé au stade 9 à 10 (environ 0,5 mm de long) selon les étapes publiées détermination pour Arabidopsis4. Sous une jumelle, à l'aide d'une pince fine, ouvrez soigneusement le bourgeon pour vérifier le stade de développement et de recueillir le gynoecium situé au centre de la fleur.
    2. Mettre le gynoecium sur du ruban adhésif double placé au centre de la couverture d'un petit plat Petri (diamètre de 5 cm).
      REMARQUE: Comme alternative, la colle biocompatible peut également être employée pour une immobilisation plus efficace de l'échantillon lors de l'indentation.
    3. Ajouter rapidement de l'eau jusqu'à ce que l'échantillon soit complètement couvert. Cela évite la déshydratation et réduit l'adhérence de la pointe à l'échantillon. Alternativement, submergez l'échantillon dans le milieu liquide, telque la culture d'apex d'Arabidopsis 5.
  2. Calibrage De l'AFM
    1. Définir le ressort en porte-à-faux k constant assez élevé pour permettre la déformation de la surface de l'échantillon jusqu'à l'indentation désirée, mais pas trop élevé pour éviter une perte de sensibilité.
      REMARQUE: En règle générale, si le modulus de l'échantillon de Young est connu, l'ordre de grandeur de la constante printanière peut être choisi comme k'E ' , où ' est l'indentation désirée.
    2. Utilisez une pointe sphérique de 400 nm avec une distance de 15 m en porte-à-faux.
      REMARQUE: Le rayon de pointe est directement lié à la résolution latérale. En général, pour l'indentation sur les matériaux biologiques, choisissez des pointes arrondies (R supérieures à 10-20 nm) ou des sondes colloïdales. Les petites sondes colloïdales peuvent être difficiles à utiliser en raison de la petite distance entre l'extrémité de la pointe et le porte-à-faux qui peut toucher la surface de l'échantillon.
    3. Allumez le logiciel et placez la tête horizontalement au moins 2-3 h avant l'expérience : cela permettra à la tête de se thermiquer et évitera les mouvements relatifs en porte-à-faux induits thermiquement. Si le microscope est équipé d'un module CellHesion (extension de la plage de piézo Z disponible à 100 m au lieu de 15 m), allumez d'abord son contrôleur, puis sélectionnez le mode CellHesion lors du démarrage du logiciel.
    4. Montez le porte-à-faux sur le bloc de verre et montez le bloc sur la tête. Placez une gouttelette de quelques microlitres d'eau ultrapure sur la pointe pour éviter la formation de bulles d'air lorsque la pointe est trempée dans l'eau.
    5. Placer un échantillon dur (lame de verre nettoyé ou saphir) et ajouter 30-50 l d'eau ultrapure.
      REMARQUE: La procédure d'étalonnage décrite ici est l'étalonnage de contact parfois appelé. Tout d'abord, une courbe de force est faite sur une surface raide et plate, puis le spectre d'oscillation du porte-à-faux thermiquement excité est enregistré afin de calculer la constante du ressort. D'autres protocoles d'étalonnage existent et seront brièvement décrits dans le paragraphe de discussion.
    6. Placez la tête sur la scène (attention à soulever les moteurs Z assez haut). Utilisez l'image optique pour placer grossièrement le laser sur le porte-à-faux.
      1. Déplacez le laser le long de l'axe principal du porte-à-faux surveillant le signal de somme sur la photodiode.
        REMARQUE: Lorsque des cantilevers standard sont utilisés, une somme supérieure à 0,5 V doit être obtenue.
      2. Déplacez le laser dans l'autre direction et maximisez le signal de somme afin de positionner le laser au milieu du porte-à-faux. Cela permettra de minimiser le croisement entre la déviation latérale et verticale.
    7. Mesure de la sensibilité de déviation
      REMARQUE: La photodiode lit le déplacement laser et fournit un signal en volts. Afin de pouvoir mesurer la déviation dans l'unité métrique, la sensibilité de déviation doit être mesurée.
      1. Définir l'instrument dans la spectroscopie Contact et Force. Définir un point de position relatif à 2 V, z longueur à 0,5 m, et Étendre la vitesse à 2 m/s (taux d'échantillonnage à 10000 Hz) et sélectionnez Z boucle fermée.
      2. Ouvrez le gestionnaire de calibration et sélectionnez la partie de contact de la courbe de force (qui devrait être linéaire) pour faire un ajustement linéaire : l'inverse de la pente donne la sensibilité de déviation. La lecture de photodiode est maintenant calibrée en unité métrique.
    8. Détermination de la constante de printemps. Dans Calibration manager, sélectionnez Spring constant pour exécuter une acquisition de spectre thermique. Pour faire la moyenne du signal pendant une plus longue période, sélectionnez le symbole de l'a.m. Le spectre de puissance du porte-à-faux thermiquement excité peut montrer plusieurs crêtes ; dessiner une sélection autour de celle placée à la fréquence la plus basse pour l'adapter.
      REMARQUE: Si l'air thermique est effectué en liquide, le pic de résonance sera plus large et sa fréquence abaissée par rapport à nominale.
  3. Mise en place et acquisition d'expériences de spectroscopie de force
    1. Placez l'échantillon sur la scène AFM et placez la tête au-dessus de l'échantillon.
      REMARQUE: Assurez-vous que la tête a été suffisamment rétractée pour éviter un contact difficile entre la pointe et la surface de l'échantillon.
    2. Laisser le porte-à-faux thermiquer quelques minutes.
    3. En mode QI, approchez avec une force Setpoint de 50 nN.
    4. Définir une longueur Z de 4 m et une zone d'analyse à 80 x 80 m2 avec un nombre de pixels de 40 x 40. Dans le panneau de réglages d'imagerie avancée, configurez le mode à vitesse constante. Définir la vitesse d'extension et de rétractation à 200 m/s et les taux d'échantillonnage à 25 kHz.
    5. Commencez à numériser et utilisez cette analyse rapide à faible force pour vérifier si l'échantillon se déplace. Vérifier que la zone numérisée est exempte de débris ou de cellules déviées et localiser une région d'intérêt aussi plate que possible pour effectuer les mesures.
      REMARQUE: Afin d'apprécier l'inclinaison réelle de l'échantillon, le nivellement de la ligne doit être réglé sur OFF ou à Constant. Un angle d'inclinaison excessif entre l'axe d'indentation et la surface aura un effet sur le modulus mesuré de Young5.
    6. Une fois qu'une zone d'intérêt a été localisée, sélectionnez une région de 40 x 40 à 60 x 60 m2 autour d'elle et augmentez le nombre de pixels pour atteindre 2 pixels/m. Augmentez le point d'ensemble à 500 nm pour obtenir 100-200 nm d'indentation. Ajustez cette valeur, si nécessaire, au début de l'expérience. Diminuer la longueur de Z à 2 m. Diminuer la vitesse d'extension et de rétractation à 100 m/s et augmenter le taux d'échantillonnage à 50 kHz.
    7. Commencez à numériser et enregistrer la sortie (généralement composée par une image et un fichier de données).
    8. À la fin de la journée de mesure, retirez le support de la pointe et rincez-le délicatement avec de l'eau ultrapure et 70 % EtOH.
    9. Séchez et retirez le porte-à-faux. Pour d'autres expériences avec la même astuce, envisagez de le nettoyer avec un protocole de nettoyage humide et, si possible, un traitement plasmatique de suivi O 2. Ne laissez pas sécher l'eau sur le porte-en-faux et/ou le porte-bout pour éviter la cristallisation du sel.
  4. Analyse de données (pour la version logicielle de traitement de données 6.x)
    1. Logiciel de traitement de données ouvert et chargez le fichier de données.
    2. Cliquez sur Utilisez cette carte pour le bouton de traitement par lots afin d'utiliser les mêmes paramètres d'analyse sur toutes les courbes de la carte.
    3. Dans Le processus prédéfinide charge, sélectionnez Hertz fit.
    4. Utilisez le premier onglet pour vérifier ou modifier les paramètres d'étalonnage.
    5. Dans le deuxième onglet, retirez un décalage (ou un décalage plus une inclinaison) de la ligne de base pour définir sa valeur moyenne à 0.
    6. Dans le troisième onglet, estimez la position du point de contact (POC) en la considérant comme le premier point franchissant la force 0 en descendant de la valeur du point d'ensemble le long de la courbe d'extension.
    7. La position de pointe verticale de l'onglet calcule le mouvement de la pointe en soustrayant la déviation en porte-à-faux de la hauteur mesurée. À cette étape, utilisez la hauteur non lissée (données brutes) pour l'ajustement suivant, en cochant la case à cocher correspondante.
    8. Dans l'onglet Elasticity fit, sélectionnez le modèle d'ajustement approprié. Si aucune adhérence ou faible n'est visible sur les courbes rétractables (correspondant à moins de 10 % de la force de point d'ensemble ou à la force moyenne maximale à la profondeur d'indentation sélectionnée), le type de modèle doit être réglé sur Hertz/Sneddon et étendre la courbe doit être utilisé. En cas d'adhérence plus forte, le modèle DMT, qui signifie le modèle Derjaguin-Muller-Toporov, doit être préféré et adapté sur les courbes rétractables (se référer au manuel pour plus de détails sur les modèles de contact disponibles et les formules connexes).
      1. Définiz les paramètres géométriques de pointe basés sur la forme nominale de pointe. Ici, Tip Shape est sphère et Tip Radius est de 400 nm.
      2. Définir le Ratio du Poisson à 0,5 comme il est fait de façon conventionnelle pour le matériel biologique (correspondant à la matière incompressible).
    9. S'adapter à l'indentation spécifique. Par défaut, l'ajustement est effectué sur toute la courbe. Si l'ajustement doit être fait jusqu'à une indentation spécifique, vérifiez d'abord la case à cocher Shift Curve; cela modifiera l'origine de la courbe en fonction des valeurs de base et de POC nouvellement déterminées.
      1. Ajoutez une deuxième routine d'ajustement Elasticity en cliquant sur l'icône sur la fenêtre principale.
      2. Redéfinir tous les paramètres d'ajustement et spécifier en X min l'indentation souhaitée. Ajouter autant d'étapes que nécessaire (2 à 3 étapes devraient suffire) afin d'affiner la détermination de la position POC et, par la suite, la profondeur d'indentation calculée. Le processus peut être enregistré à ce stade.
    10. Cliquez sur Garder et appliquer à tous pour itérer les étapes précédentes sur toutes les courbes de la carte.
    11. Enregistrer les résultats. Une image et un fichier .tsv seront obtenus.

2. Mesure de la pression de Turgor

REMARQUE: Un exemple du meristem d'inflorescence oryzalin-traité d'Arabidopsis est présenté.

  1. Préparation de l'échantillon biologique
    1. Recueillir Arabidopsis inflorescence meristem (IM) traité avec le microtubule dépolymérisant oryzalin de plantlet in vitro cultivé sur le milieu contenant l'inhibiteur du transport d'auxine polaire 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) suivant la méthode publiée 6.
    2. Montage de l'échantillon de GI suivant l'une des deux options
      1. Pour la surveillance à long terme : monter l'échantillon dans un plat Petri contenant le milieu de culture d'apex d'Arabidopsis (ACM)7,8 et 0,1% mélange de conservation de plante (PPM), pour empêcher la contamination. Suspendre la pointe de messagerie instantanée au-dessus de la surface ACM et soutenir la base de la GI avec une baisse de 2% agarose.
      2. Pour la mesure avec des changements rapides de solution : montez l'échantillon dans un Petri-plat tenant un petit morceau de mastic adhésif, et scellez rapidement l'écart entre le mastic et la base d'échantillon avec la colle bio-compatible. Attendez que la colle se solidifie (moins de 2 min), puis immerger l'échantillon dans un ACM liquide contenant 0,1 % de PPM.
        REMARQUE: Assurez-vous que la surface de l'échantillon n'est pas recouverte d'agarose ou de colle lors de la fixation de la base de l'échantillon. La mesure AFM de la pression de turgor exige que l'échantillon soit monté de façon stable, et les méthodes de montage précédentes fournissent la stabilité acceptable. Selon l'échantillon, d'autres méthodes de montage peuvent être utilisées, comme le ruban à double face, la polylysine, etc.
  2. Calibrage De l'AFM
    1. Activez le logiciel d'acquisition AFM et choisissez le mode de mesure PeakForce QNM (grande amplitude).
    2. Effectuer l'étalonnage selon le même principe décrit dans les étapes 2.1 à 2.6.
    3. Dans la fenêtre Paramètres De contrôle, définiz la taille de l'analyse à 0. Dans la fenêtre Ramp, réglez la taille de la rampe entre 200 nm et 500 nm, seuil Trig entre 2 V et 5 V et Nombre d'échantillons jusqu'en 2048 ou plus.
    4. Alignez la pointe en porte-à-faux avec l'échantillon d'étalonnage et cliquez sur Approche.
    5. Au contact, allez à la fenêtre Ramp et cliquez sur le bouton Rampe continue. Sur le régime linéaire de la courbe, déterminez la pente en cliquant sur le bouton Sensibilité mise à jour. Répétez la mesure de sensibilité de déviation plusieurs fois et mettez à jour manuellement l'étalonnage avec la moyenne de mesure en ouvrant le détecteur d'onglet du menu Calibration.
    6. Retirez la tête de l'AFM et retirez l'échantillon d'étalonnage.
      REMARQUE: Il est suggéré de rétracter complètement la tête de l'AFM en choisissant l'onglet Étape - Initialize pour prévenir les contacts accidentels durs lors du changement d'échantillon.
  3. Mise en place et acquisition d'expériences de spectroscopie de force
    1. Si l'échantillon n'est pas encore submergé, immerger avec de l'ACM liquide contenant du PPM.
    2. Dans le logiciel d'acquisition, spécifiez les paramètres de mesure comme suit :
      1. Dans la fenêtre de paramètre Check, définiz la constante de ressort à la constante de ressort fabriquée du porte-à-faux ou la constante de ressort déterminée comme dans l'étape 2.8. Dans cet exemple, il est fixé à 42 N/m.
      2. Définir le rayon De pointe à 400 nm dans cet exemple.
      3. Définir le ratio de l'échantillon Poisson à 0,5, puisque l'eau contribue principalement à la pression de la turgor.
      4. Définir l'échantillon/ligne à 128 pour assurer une acquisition rapide.
      5. Définir le taux d'analyse à 0,2 Hz.
      6. Définir la taille de l'analyse à 1 m.
        REMARQUE: La fixation du taux d'analyse et de la petite taille de l'analyse peut effectivement prévenir les dommages causés par l'échantillon déclenché par l'analyse AFM. Il est recommandé de réduire ces deux paramètres lors de tout changement d'échantillon.
      7. Dans la fenêtre Ramp, définir la taille de la rampe à 5 m.
        REMARQUE: Il est mieux de réglage de la taille de la rampe plus grande que la profondeur d'indentation prévue pour une meilleure acquisition de base.
      8. Définir le seuil Trig au maximum.
      9. Définir le nombre d'échantillons à 4608.
      10. En option, dans l'onglet Paramètres Microscope et Engagement, réduisez les paramètres suivants pour éviter de forts dommages causés par le contact à l'échantillon. Définir peak Force Engage Setpoint à 0,3 V (par défaut 0,5 V). Définir le gain de L'int. engage à 0,5 (par défaut 0,75). Définir l'étape d'engagement SPM à 4 m (par défaut 15 m).
    3. Placez et alignez l'échantillon sous la tête de l'AFM et approchez-le jusqu'à ce que le porte-à-faux soit submergé, mais pas en contact avec la surface de l'échantillon.
      REMARQUE: En approchant, soufflez légèrement à la surface de l'ACM liquide jusqu'à ce qu'un pont liquide se forme entre le porte-à-faux et la surface liquide. Cela empêche généralement le contact dur.
    4. Avec soin, approchez-vous manuellement vers l'échantillon. Lorsque la sonde est relativement proche de la surface de l'échantillon, cliquez sur Approche.
    5. Au contact, augmentez graduellement la taille du scan et/ou le taux d'analyse jusqu'à l'équilibre souhaité sans endommager l'échantillon et/ou le porte-à-faux.
      REMARQUE: La taille de l'analyse est limitée par la courbure et la rugosité de la surface de l'échantillon. Dans le cas de la GI oryzalin-traitée, 50 x 50 'm2 zone d'analyse peut être atteint avec un taux d'analyse de 0,3 Hz.
    6. Lors de la numérisation, déterminez si la région de mesure est comme souhaité. Déplacez-vous si nécessaire. Une fois satisfait, cliquez sur le bouton Point et Tirez pour lancer le point et tirer fenêtre.
    7. Avant d'enregistrer l'analyse, choisissez un canal d'image approprié qui peut faciliter l'identification claire des contours des cellules. Souvent, l'erreur de force de pointe, DMT Modulus, LogDMT Modulus ou Dissipation est approprié. Spécifiez l'annuaire et le nom du fichier. Cliquez ensuite sur Ramp sur le scan suivant pour lancer l'enregistrement.
      REMARQUE: Une chaîne d'un point et trois numéros seront automatiquement ajoutés après votre nom de fichier désigné (comme .000). Ce nombre augmente automatiquement de 1 sur chaque répétition d'analyse enregistrée.
    8. Lorsque l'analyse est terminée, l'interface logicielle sera automatiquement redirigée vers la fenêtre Ramp. Cliquez sur l'image numérisée pour spécifier les positions à indent.
      REMARQUE: Avant d'enregistrer les indentations, il est préférable de choisir plusieurs repères pour effectuer des indentations de test en cliquant uniquementsur Ramp, au cas où l'alternance des paramètres serait nécessaire (pour la taille de la rampe, la position Piezo,etc.). La profondeur d'indentation doit être plus grande que l'épaisseur de la paroi cellulaire (idéalement déterminée séparément par microscopie électronique de transmission).
    9. Choisissez au moins trois sites d'indentation par cellule près de son barycenter, et répétez l'indentation trois fois par site. Cela donnerait au moins neuf courbes de force par cellule pour une analyse plus approfondie. Lorsque vous êtes satisfait du placement du site d'indentation, cliquez sur Ramp et capturez. Les courbes d'indentation de force sont automatiquement enregistrées dans l'annuaire désigné.
    10. Lorsque les rampes sont terminées, déplacez-vous vers une position différente pour la mesure des tuiles, ou rétractez la tête d'analyse et changez l'échantillon.
    11. Une fois terminé, nettoyez le porte-à-faux comme dans les étapes 1.3.8 et 1.3.9.
  4. Analyse des données
    1. Dans le logiciel d'analyse, ouvrez le fichier '.mca'. Cela montre la position de chaque courbe de force sur l'image numérisée. Si vous le souhaitez, présélectionnez les courbes de force pour l'analyse.
    2. Ouvrez une courbe de force à analyser, généralement dans le format de x0000y.00z, où x est le nom de fichier spécifié dans l'annuaire enregistrer tandis que y et z sont automatiquement enregistrés numéros indiquant séquence d'indentation et numéro d'analyse.
    3. Cliquez sur le bouton de correction de base et faites glisser les lignes bleues du tableau de bord sur la courbe de force jusqu'à ce que extend Source Baseline Start et Extend Source Baseline Stop soient respectivement de 0 % et 80 %. Cliquez sur Exécuter.
      REMARQUE: Alternativement, Extend Source Baseline Stop peut être réglé à différentes valeurs, tant qu'il est encore dans la ligne de base et non pas au-delà du point de contact.
    4. Cliquez sur le bouton Filtre Boxcar et cliquez sur Exécuter pour lisser la courbe de force.
    5. Cliquez sur le bouton Indentation.
      1. Dans la fenêtre entrée, définir la courbe active pour étendre.
      2. Définir la méthode Fit pour linéairer le modèle et inclure la force d'adhérence à Oui.
      3. Définir Max Force Fit Boundary à 99% et Min Force Fit Boundary à 75%.
      4. Définir le modèle Fit to Stiffness (Linéaire).
        REMARQUE: Cette configuration calculera la rigidité apparente k pour la déduction de pression de turgor. Dans cet exemple, les limites d'ajustement reflètent une rigidité d'environ 1,5 m de profondeur d'indentation.
    6. Les courbes de force peuvent être analysées par lots. Cliquez sur le bouton Historique d'exécution, spécifiez l'annuaire du rapport et ajoutez toutes les autres courbes de force qui nécessitent le même traitement. Une fois satisfait, cliquez sur Exécuter. Par défaut, l'ajustement sera stocké sous la forme d'un fichier .txt.
    7. Lorsque k est monté par lots, cliquez sur Historique 5 Indentation pour revenir à la fenêtre d'indentation.
      1. Changer la limite d'ajustement de force maximale à 10 % et la limite d'ajustement de force de Min à 0 %.
      2. Définir le modèle Fit à Hertzian (sphérique).
        REMARQUE: Ceci calculera le modulus E de la paroi cellulaire de Young pour la déduction de pression de turgor. Dans cet exemple, les limites d'ajustement reflètent un ajustement hertzien (à l'aide d'une sonde sphérique) d'environ 0,4 m de profondeur d'indentation.
    8. Répétez l'étape 2.4.6 pour l'ajustement de lot pour E.
    9. Ouvrez le fichier de 0,00z (z est le numéro d'analyse automatiquement enregistré) pour afficher les différents canaux d'analyse. Dans la fenêtre du canal Height, cliquez sur bouton Section. Cela permettra de mesurer la courbure de surface de l'échantillon qui est nécessaire pour la déduction de pression de turgor.
      1. Tracez une ligne à travers le long axe d'une cellule, déplacez les limites de la ligne de tableau de bord vers les bords cellulaires et enregistrez la valeur Radius r1. Répétez cette opération pour l'axe court pour récupérer le rayon r2. Calculer la courbure moyenne de la cellule -CourbureM et Gaussian -G en utilisant les deux mesures radii comme suit:
        Equation 1etEquation 2 
    10. Déduire la pression de turgor P en utilisant le modèle à coquille mince publié9 comme suit:
      Equation 3 
      avec
      Equation 4
      où t est l'épaisseur de la paroi cellulaire déterminée par exemple la microscopie électronique.
      REMARQUE: La déduction de la pression de turgor est un processus approprié, où des itérations sont exigées. Quatre itérations sont généralement capables de reproduire un produit stable, mais plus d'itérations peuvent être faites (par exemple 100 fois).
    11. Calculer moyenne E, k et P par cellule. En outre, enregistrez la variabilité intracellulaire (p. ex., déviation type) pour la documentation.

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Representative Results

La figure 1A et la figure 1B montrent une capture d'écran illustrant le résultat des étapes 1.3.4 à 1.3.6 du protocole, utilisées pour localiser une région d'intérêt où acquérir la carte QI. Il convient de mentionner que la région d'intérêt a été choisie afin de ne pas être sur une surface inclinée (c'est-à-dire aussi plate que possible). En fait, comme l'ont remarqué Routier et al.5, si l'axe d'indentation n'est pas perpendiculaire à la surface, le modulus mesuré des Jeunes peut être sous-estimé. Cet effet est visible sur le coin supérieur droit des panneaux C ou D de la figure 1, où une partie de la bordure des cellules semble plus douce que le reste de la cellule. Les artefacts induits par cet effet seront beaucoup plus forts dans le cas des méritéms, où l'angle d'inclinaison local peut facilement surmonter 40 degrés sur 50 x 50 m2 zones d'analyse. Dans notre laboratoire, nous développons actuellement un algorithme, basésur l'approche décrite par Routier et al.5 , pour corriger ces artefacts (papier en préparation). La figure 1C et la figure 1D montrent les cartes modulus de Young obtenues après l'analyse détaillée dans le quatrième paragraphe du protocole. En particulier, le panneau C représente le modulus du Jeune obtenu en analysant l'ensemble de l'indentation, jusqu'au point de force défini par l'utilisateur, tandis que le panneau D montre le résultat de l'analyse des 100 premiers nm d'indentation (tel que décrit à l'étape 1.4.9). Ici, les 2 cartes se ressemblent beaucoup, car lors de la mise en place de l'expérience, le point d'ensemble a été choisi afin d'obtenir des indentations moyennes d'environ 100 nm. La variation de l'indentation analysée peut parfois conduire à mieux mettre en évidence les hétérogénéités de l'échantillon, qui peuvent être utiles pour identifier l'emplacement ou pour fournir des informations sur le comportement des structures internes (par exemple, Costa et al.10)

La courbe de force de la figure 2 montre deux effets qui méritent d'être mentionnés. Tout d'abord, on peut remarquer que si la partie d'approche de la courbe de force se termine effectivement à la force de point d'ensemble de 500 nN, le mouvement de pointe vers le bas continue, ce qui signifie que la force finale appliquée par la pointe est plus élevée que prévu (ici 1 000 nN). Cela est dû au fait que la boucle de rétroaction de surveillance de la déviation en porte-à-faux n'agit pas instantanément, de sorte que son temps de réaction fini introduit un décalage entre la détection du seuil de déviation et l'arrêt de mouvement piezo. En outre, en particulier lors de l'utilisation de CellHesion qui déplace le support de l'échantillon, l'inertie des pièces mobiles entre en jeu, ce qui rend ce délai plus long. Ce problème peut être limité en utilisant le piezo tête, auquel cas l'utilisateur doit être très prudent dans le cas de mesures sur des échantillons très rugueux ou inclinés, ou en réduisant la vitesse de rampe, ce qui limite de toute façon la résolution et / ou le nombre d'échantillons numérisés ( en outre, pour les cartes trop lentes, la croissance de l'échantillon peut devenir un problème). En général, si les courbes de force sont assez éloignées les unes des autres (selon le modèle d'indentation de choix, le rayon de la zone en indented peut être calculé compte tenu de la profondeur d'indentation et utilisé comme distance de séparation minimale), les mesures effectuées dans différents les positions le long de l'échantillon ne devraient pas être corrélées et si l'analyse est effectuée sur la courbe d'approche, le dépassement du seuil de force ne devrait pas être un problème. Quoi qu'il en soit, si l'échantillon est délicat ou si des scans répétés sont effectués sur la même zone, le scientifique peut vouloir essayer de minimiser ce dépassement. Malheureusement, il n'y a pas de règle empirique pour déterminer la quantité de ce dépassement, car il dépend du piezo utilisé, sur les vitesses de rampe, mais aussi sur les propriétés matérielles: plus le matériau est rigide, plus la variation du signal de déviation dans le temps et , compte tenu d'un temps de réponse de rétroaction fini, plus le dépassement est élevé.

La deuxième chose à remarquer est l'ondulation sur la courbe rétractée mis en évidence par l'ellipse. Un tel ondulation peut être un indicateur de déplacement/vibratage de l'échantillon sous l'action de la pointe. Dans ce cas, l'utilisateur peut essayer de changer la zone numérisée (parfois une autre partie du microscope, mais la pointe peut toucher l'échantillon, ou l'échantillon peut être insuffisamment bien fixé à son support) ou l'échantillon si plusieurs d'entre eux ont été préparés sur le même support. Si la fonctionnalité est toujours là, il est préférable de changer la méthode de fixation, dans ce cas en passant de la fixation de bande recto-verso à des colles biocompatibles.

La figure 3 illustre la détermination des paramètres clés de la déduction pour la pression de la turgor. Chaque paramètre, à l'exception de l'épaisseur de la paroi cellulaire11 qui a été déterminée séparément par microscopie électronique pour être de 740 nm, peut être récupéré à partir des scans et des indentations AFM. Après le processus d'ajustement à l'étape 2.4.10, la pression de turgor est déduite pour être 1.50 MPa pour cette courbe de force. La mise en commun des dix-huit courbes de force dans cette cellule donne des valeurs moyennes de E à 6,77 , 1,02 MPa, k 14,18 , 2,45 N/m et P à 1,45 , 0,29 MPa (écart moyen et standard).

Figure 1
Figure 1 : Cartes topographie (Height Measured) généralement acquises au cours d'une expérience. (A) Une première carte à faible résolution/faible force est enregistrée pour trouver une région appropriée à scanner. (B) Une carte plus petite à haute résolution/force supérieure est acquise pour le calcul du modulus de Young (sur la zone mise en évidence par le carré pointillé noir). (C) Cartes modulus de Young calculées à partir de la carte B, comme détaillé à l'étape 1.4. Ici, la carte du modulus du Jeune a été obtenue en analysant l'ensemble de l'indentation sur chaque courbe de force. (D) La carte du modulus de Young a obtenu l'analyse seulement des 100 premiers nm d'indentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Exemple de courbe de force. En bleu l'approche, en rouge le segment rétractation. Le maximum de force (situé sur la courbe de rétractation) est différent du point de force en raison du temps de réaction de la boucle de rétroaction finie et de l'inertie. L'ondulation dans la courbe rétractable peut être représentative d'une insuffisance dans la fixation de l'échantillon à son support. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Mesures AFM pour déduction de pression de turgor. (A) La carte du modulus DMT montre le contour des cellules claires pour superviser le positionnement des sites d'indentation profonde près du barycentre cellulaire. Les sites d'indentation sont marqués par des croix. (B) Courbe de force d'indentation profonde à la position de la croix rouge en A. Mur cellulaire Le modulus E (vert) de Young et l'échantillon de rigidité apparente k (rouge) sont installés à différents régimes de la courbe comme détaillé à l'étape 2.4. R (en) 2 dénote le coefficient de détermination des ajustements. (C) Carte de hauteur avec axes longs et courts déterminés manuellement d'un, représenté par des lignes blanches, de la même cellule analysée dans les panneaux A et B. (D) Profil de hauteur des axes longs et courts de la cellule dans le panneau C (bleu, long axe rouge, axe court) et le fitte d radii de courbure (r1 et r2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L'émergence des formes dans les plantes est principalement déterminée par le taux coordonné et la direction de la croissance pendant le temps et l'espace. Les cellules végétales sont enfermées dans une paroi cellulaire rigide faite d'une matrice polysaccharidique, qui les colle ensemble. En conséquence, l'expansion cellulaire est contrôlée par l'équilibre entre la pression de turgor tirant sur la paroi cellulaire, et la rigidité de la paroi cellulaire résistant à cette pression. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents au développement, il est important d'être en mesure de mesurer à la fois les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire ainsi que la pression turgor dans différents tissus ou cellules d'un organe donné. Comme le démontre le présent document, l'AFM est la méthode de choix dans ce contexte.

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Le premier est la préparation des tissus qui doit être assez rapide pour éviter la déshydratation. Cela peut être critique en particulier si nous voulons mesurer la pression turgor. Très important est également une fixation correcte de l'échantillon à son substrat: un échantillon instable peut conduire à des effets très évidents comme un mouvement macroscopique qui peut être facilement détecté optiquement, ou une forte déformation des courbes de force. Quoi qu'il en soit, l'échantillonnage de vibration ou de flexion peut être subtile à détecter, l'introduction d'artefacts dans les résultats. Enfin, une autre étape critique concerne le choix des paramètres d'indentation. C'est déterminant pour la qualité des résultats.

Lors de la mesure des propriétés mécaniques sur de grandes surfaces (plus de 40-50 tailles d'analyse), les différences de hauteur peuvent être élevées, ce qui rend difficile de suivre correctement la surface et de réaliser les courbes de force sans atteindre les limites de la gamme Z piezo. Afin de surmonter ce problème, un module CellHesion a été utilisé. Ce module ajoute un piézo Z supplémentaire, situé dans l'étape de l'échantillon, ayant une portée de 100 m, ce qui permet l'acquisition de grandes zones sans approcher dangereusement les limites de z piezo.

La première limite de la méthode est que nous ne pouvons mesurer que les couches cellulaires superficielles. Cependant, récemment, les auteurs ont utilisé l'AFM sur les sections de tissus12,13,14. Bien que cela doit être fait sur des matériaux fixes, il peut donner accès à des propriétés mécaniques des couches cellulaires profondes. Alternativement, des indentations plus profondes ont également été effectuées pour déduire les propriétés mécaniques des tissus internes sur des échantillons vivants, mais avec de plus grands sacrifices sur la résolution spatiale15. Une deuxième limitation peut être liée à la géométrie de l'échantillon, car une surface avec une pente raide peut être problématique puisque la pointe n'est plus perpendiculaire à l'échantillon. Nous devons restreindre l'éventail des angles dans lesquels les mesures sont fiables et nous développons actuellement un algorithme pour corriger les artefacts potentiels liés à ce phénomène. En outre, certains tissus sont couverts de trichomes qui peuvent bloquer les mesures. Enfin, l'indentation mesure les propriétés mécaniques dans une direction perpendiculaire en ce qui concerne la surface cellulaire et nous pouvons nous demander si cela peut être facilement lié à l'extensibilité de la paroi cellulaire associée à la capacité de croissance. Plusieurs études suggèrent que c'est le cas15,16.

Il vaut la peine de faire ici une observation plus générale sur la mesure / application des forces par l'AFM. Comme décrit dans la section protocole, afin d'être en mesure de transformer les déplacements laser sur le photodiode en forces, un étalonnage doit être effectué. Dans cet étalonnage, un paramètre, la sensibilité à la déviation, permet de convertir les déplacements laser en déviation réelle en porte-à-faux (généralement mesurée en nm), de sorte que ce facteur calibre les tensions de sortie de photodiode (le long des axes verticaux) en déplacements dans Nm. Le deuxième facteur est la constante printanière K, mesurée en N/m, qui convertit les déviations verticales en porte-à-faux dans les unités de force (généralement nN), puisque les cantilevers flexibles se comportent comme des ressorts. Même si la procédure semble simple, un étalonnage robuste et reproductible de K pour les mesures de spectroscopie de force AFM est toujours un problème, en raison de différentes sources d'erreur qui peuvent affecter les différentes étapes de la procédure. Par exemple, la mesure de la sensibilité de déviation réalisant une courbe de force sur une surface rigide, peut mener à des valeurs incorrectes si la pointe glisse sur la surface, ou si la surface n'est pas parfaitement nettoyée ou aussi si la charge de surface induit la répulsion électrostatique. Dans tous les cas précédents, la partie de contact de la courbe de force sera déformée (plus inclinée ou courbée au lieu de linéaire).

La procédure de contact décrite dans la section du protocole n'est qu'une des nombreuses procédures d'étalonnage existantes. Il existe au moins 2 autres méthodes qui peuvent être utilisées d'une manière relativement facile et peu coûteuse: la méthode Sader (également appelé non-contact lorsqu'il est mis en œuvre dans certains logiciels AFM) ou la méthode de levier de référence. La méthode Sader17 a été développée à l'origine par John Sader pour les cantilevers en forme de V, puis pour les cantilevrées rectangulaires18 et n'a pas besoin de l'acquisition d'une courbe de force sur un substrat rigide. Au lieu de cela, l'utilisateur doit spécifier (hors de la température comme dans la méthode de contact), la longueur et la largeur du porte-à-faux et la densité et la viscosité du fluide où le porte-à-faux est (généralement l'air, l'eau ou un fluide de l'eau comme). Ensuite, un spectre thermique est acquis et la sensibilité de déviation et constante de ressort sont mesurées. Cette méthode est avantageuse lorsque vous utilisez des pointes très pointues ou fonctionnalisées qui peuvent être endommagées en faisant une courbe de force sur un substrat rigide.

Les deux méthodes précédentes se rapportent à l'acquisition du spectre d'oscillation d'un porte-à-faux thermiquement excité. Lorsque des cantilevers rigides sont utilisés à température ambiante, l'amplitude moyenne de l'oscillation peut être inférieure à 0,1 nm, ce qui rend le pic de résonance plus petit et plus difficile à détecter. Quoi qu'il en soit, au moins pour les deux instruments utilisés dans ce document, le pic de résonance peut effectivement être détecté dans l'air et dans l'eau et équipé pour mesurer la constante du printemps (considérant que lorsque la mesure est faite en liquide, la fréquence de résonance se déplace vers des valeurs et le pic s'élargit).

Une troisième méthode n'utilise pas un air thermique, mais plutôt un porte-à-faux de référence ou une structure élastique de référence, avec une constante printanière connue (généralement avec une incertitude autour ou en dessous de 5%), afin de déterminer le porte-à-faux K. Dans ce cas, une première courbe de force doit être acquise sur un substrat rigide afin de mesurer la sensibilité de déviation (qui vient à nouveau avec tous les artefacts possibles affectant la forme de la courbe). Ensuite, le substrat rigide est remplacé par le porte-à-faux de référence (généralement un porte-à-faux sans pointe avec une constante de ressort calibré) et une autre courbe de force (ou peu d'autres) est effectuée, enregistrant à nouveau la valeur de la sensibilité de déviation. La constante de ressort en porte-à-faux est alors calculée comme :
Equation 5

où Kref est la constante printanière du porte-à-faux de référence, Sref la sensibilité de déviation mesurée sur elle, L est sa longueur et Sraide est la sensibilité de déviation mesurée sur le raide Substrat. Le décalage est le décalage entre la pointe et l'extrémité du porte-à-faux de référence et dépend de l'alignement effectué par l'utilisateur et, enfin, l'angle d'inclinaison du porte-à-faux, spécifié par le fabricant de l'AFM. La même méthode peut être utilisée sur des structures élastiques spécialement conçues pour l'étalonnage en porte-à-faux ou en entrée. L'avantage de ces structures (qui sont généralement circulaires) est que K à leur centre est constante et ne dépend d'aucun paramètre géométrique ou sur le positionnement précis de la pointe AFM sur eux, donc en supprimant L et L de la formule précédente.

L'utilisateur de l'AFM doit garder à l'esprit que toutes ces méthodes d'étalonnage sont affectées par différentes sources d'erreur (détermination de la sensibilité à la déviation en premier et troisième, l'utilisation de l'air thermique dans le cas des cantilevers rigides pour la première et la deuxième et géométrique paramètres et l'alignement pour le troisième ainsi que l'exactitude de l'étalonnage de Kref dans le cas de référence porte-à-faux est utilisé) et que les méthodes de contact sont potentiellement nocifs pour la pointe (en particulier le troisième, où l'étalonnage impose l'utilisation de deux différents échantillons). Cela implique que la constante printanière sera toujours déterminée jusqu'à une certaine précision, de même que les forces mesurées/appliquées (voir Sikora19 pour un examen complet des différentes méthodes d'étalonnage et de leur précision. Cela signifie que les pressions de Moduli et de turgor de Young seront également affectées par l'étalonnage en porte-à-faux. Quoi qu'il en soit, d'autres sources d'erreur encore plus importantes sont impliquées dans le calcul de ces quantités (comme l'utilisation de modèles simplifiés pour la détermination du modulus de Young) de sorte qu'il sera toujours un défi d'obtenir des valeurs absolues de ce genre de mesures. Ce qui est important, c'est d'obtenir des valeurs qui sont du bon ordre de grandeur et qui sont cohérentes les unes avec les autres, ce qui signifie que si l'expérience est répétée par le même utilisateur sur le même échantillon, les valeurs doivent être compatibles. Pour l'obtenir, l'étalonnage doit être fait avec soin, et les sources d'erreurs doivent être réduites au minimum (par exemple, en limitant autant que possiblement le bruit acoustique/vibrations). Une stratégie possible visant à accroître la cohérence des étalonnages répétés a été récemment proposée dans un document par Schillers et al.20, où, grâce à la collaboration de 11 laboratoires européens, un protocole (appelé SNAP) pour compenser les erreurs la détermination de sensibilité de déviation a été développée. Dans cet article, les auteurs utilisent des cantilevers directement calibrés pour leurs mesures, de toute façon le même protocole peut être appliqué aux cantilevers non calibrés, il suffit de les étalonner la première fois avec la méthode de choix, puis en considérant le premier printemps constante comme valeur de référence (« calibré »).

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier l'équipe de PLATIM pour son soutien technique, ainsi qu'Arezki Boudaoud et les membres de l'équipe Biophysic du laboratoire RDP pour des discussions utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) Sigma-Aldrich/Merck 132-66-1 add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar Sigma-Aldrich/Merck 9002-18-0 add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose Merck Millipore 9012-36-6 used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium Duchefa Biochimie DU0742.0025 For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich/Merck 13477-34-4 add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM Duchefa Biochimie M0221.0025 Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP) Sigma-Aldrich/Merck 1214-39-7 used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin Sigma-Aldrich/Merck 19044-88-3 for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM) Plant Cell Technology used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide Duchefa Biochimie 1310-58-3 used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose Duchefa Biochimie 57-50-1 used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM Bruker The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion JPK (Bruker) The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix UHU D1620
Reference elasitic structure NanoIdea 2Z00026
Reprorubber-Thin Pour Flexbar 16135 biocompatible glue.
Spherical AFM tips Nanoandmore SD-SPHERE-NCH-S-10 Tips used for measuring mechanical properties.

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References

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Biologie du développement Numéro 149 propriétés mécaniques microscopie de force atomique pression de turgor parois de cellules végétales indentation modulus de Young
Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux
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Bovio, S., Long, Y., Monéger, F. Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues. J. Vis. Exp. (149), e59674, doi:10.3791/59674 (2019).

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