Summary
Vi beskriver en menneskelig perifere blod mononukleære celle (PBMC)-basert humanisert xenograft mus modell for translational Immuno-onkologi forskning. Denne protokollen kan tjene som en generell retningslinje for etablering og karakteriserer av lignende modeller for I-O terapi vurdering.
Abstract
Oppdagelsen og utviklingen av Immuno-onkologi (i-O) terapi de siste årene representerer en milepæl i behandling av kreft. Imidlertid vedvarer behandling utfordringer. Robuste og sykdoms relevante dyremodeller er viktige ressurser for fortsatt prekliniske forskning og utvikling for å møte en rekke andre immun kontrollpunkter. Her beskriver vi et humant perifert blod mononukleære celle (PBMC)-basert humanisert xenograft modell. BGB-A317 (Tislelizumab), en Investigational humanisert anti-PD-1 antistoff i sen-stadium klinisk utvikling, er brukt som et eksempel for å diskutere plattform oppsett, modell karakterisering og narkotika effekt evalueringer. Disse humanisert mus støtter veksten av de fleste menneskelige svulster testet, og dermed tillater vurdering av i-O terapier i sammenheng med både menneskelig immunitet og menneskelig kreft. Når etablert, er vår modell forholdsvis tid-og kostnadseffektiv, og vanligvis gir svært reproduserbar resultater. Vi foreslår at protokollen skissert i denne artikkelen kan tjene som en generell retningslinje for å etablere musemodeller tilberedt med menneskelige PBMC og svulster for I-O forskning.
Introduction
Immuno-onkologi (I-O) er et raskt voksende felt av kreft behandling. Forskere har nylig begynt å sette pris på det terapeutiske potensialet av modulerende funksjoner i immunsystemet til å angripe svulster. Immune Checkpoint blokader har vist oppmuntrende aktiviteter i en rekke krefttyper, inkludert melanom, renal celle kreft, hode og nakke, lunge, blære og prostata kreft1,2. I motsetning til målrettede terapier som direkte drepe kreftceller, I-O terapier forsterke kroppens immunsystem til å angripe svulster3.
Hittil har mange relevante I-O dyremodeller er etablert. Disse inkluderer: 1) mus tumor cellelinjer eller tumor homograft i syngeneic mus; 2) spontane svulster avledet fra genetisk konstruert mus (GEM) eller kreftfremkallende-induksjon; 3) chimeric edelstener med knock-in av menneskelige narkotika mål (r) i et funksjonelt murine immunsystem; og 4) mus med rekonstituert humant immunitet transplantert med humane kreftceller eller pasient-avledet xenotransplantater (PDXs). Hver av disse modellene har åpenbare fordeler så vel som begrensninger, som har blitt beskrevet og gjennomgått mye annetsteds4.
Rekonstituering av menneskelig immunitet hos immunodeficient mus har blitt growingly verdsatt som en klinisk relevant tilnærming for translational I-O forskning. Dette oppnås vanligvis gjennom enten 1) engraftment av voksne immunceller (f. eks perifere blod mononukleære celler (PMBC))5,6, eller 2) engraftment av blodkreft stamceller (HSC) fra, for eksempel navlestreng blod eller fosterets leveren7,8. Disse humanisert mus kunne støtte veksten av menneskelige svulster, og dermed tillater vurdering av i-O terapier i sammenheng med både menneskelig immunitet og menneskelig kreft. Til tross for fordelene, var anvendelser av humanisert mus i i-O-forskning vanligvis hindret av flere bekymringer, slik som lang modell utvikling tid og betydelig høye kostnader.
Her beskriver vi en menneskelig PBMC-basert modell som kan bli mye brukt for translational I-O studier. Denne modellen er forholdsvis tids-og kostnadseffektiv med høy reproduserbarhet i effekt studier. Det har vært brukt i huset for evalueringer av flere I-O legemiddel selskap for tiden under prekliniske og klinisk utvikling. BGB-A317 (Tislelizumab), en Investigational humanisert anti-PD-1 antistoff9 , er brukt som eksempel for å diskutere modell utvikling, karakterisering, og mulige anvendelser for anti-tumor effekt analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført i studier som involverte menneskelige deltakere var i samsvar med de etiske standardene til BeiGene og/eller nasjonal forskningskomité og med 1964 Helsingfors-erklæring og senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Informert samtykke ble innhentet fra alle individuelle deltakere inkludert i studien. Alle prosedyrer utført i studier som involverer dyr ble godkjent av den interne gjennomgangen styret på BeiGene. Denne protokollen er spesielt justert for evalueringen av BGB-A317 (Tislelizumab) i humanisert NOD/SCID-mus.
1. etablering av menneskelig PBMC-basert modell
-
Myeloablation av NOD/SCID mus bruker cyklofosfamid: bestemmelse av optimale doser
- Kjøp kvinnelige NOD/SCID mus (6-8 uker).
Merk: Alle mus involvert i denne studien var kvinner. - Forbered cyklofosfamid (CP) ved forskjellige doser (50, 100 og 150 mg/kg) i saltvann. Klargjør Disulfiram (DS) i 0,8% mellom-80 i saltvann ved 125 mg/kg.
Merk: ulike konsentrasjoner av CP var forberedt på å muliggjøre administrasjon av like volumer av narkotika løsning til mus får forskjellige doser av CP. - Unn dyrene med CP (IP) og DS (PO) en gang om dagen for 2 dager. Gi DS (PO) 2 h etter hver dose CP.
Merk: DS reduserer urotoxicity av CP i mus, og CP kombinert med DS har blitt foreslått å ha mer langvarig nøytropeni enn dyr behandlet med CP alene10 dose REGIME av CP kanskje må pre-bestemmes før faktiske studier og ble funnet å variere litt mellom forskjellige immunodeficient mus stammer. - Samle blodprøver fra orbital venøs sinus og overføre til EDTA-K belagt rør på is på dag 0 (1 time før 1St dose), dag 2 (24 timer etter 2nd dose) og dag 4 (72 h etter 2nd dose).
- Undersøk myeloablation effekt etter CP og DS behandling av FACS. Bruk rotten anti-musen CD11b (M1/70), rotten anti-musen Ly6C (hk 1.4,) og rotten anti-musen Ly6G (1A8) for gating CD11b+ Ly6Ghøy idet nøytrofile, CD11b+Ly6Chøy idet monocytter11,12.
- Registrere kroppsvekt og helsemessige forhold av mus daglig i en uke. Den optimale dosen av CP og DS bestemmes som diett som resulterer i maksimal tømming av nøytrofile og monocytter uten å forårsake alvorlig toksisitet for mus.
- Kjøp kvinnelige NOD/SCID mus (6-8 uker).
-
Human PBMC transplantasjon og tumor engraftment: modell oppsett
- Isolere menneskelige Pbmc fra friske donorer ved tetthet gradient sentrifugering henhold til produsentens instruksjoner.
- Pre-behandle mus med CP og DS som indikert av trinn 1.1.2 og 1.1.3 å øke transplantasjon effektivitet.
- 20 til 24 h etter den andre dosen av CP og DS, injisere menneskelige tumor cellelinje som A431 celler (ATCC, 2,5 x 106) og 5 x 106 isolert pbmc (blandet i totalt 200 μL fosfat-bufret Saline (PBS) inneholder 50% Matrigel) , eller tumor fragmenter (3 x 3 x 3 mm3, i et samlet volum på 200, μL PBS som inneholder 50% Matrigel) og 200 μL av 5 x 106 pbmc (100 μL hver til venstre og høyre side av engrafted tumor fragment) (SC) subkutant i høyre flanke av dyrene.
- Mål primære tumor volum og posten to ganger i uken for 4-6 uker.
Merk: Musene vil bli euthanized når deres kroppsvekt taper over 20% eller deres tumor volum når 2 000 mm3 eller svulsten er ulcerated. - Euthanize musene i gass kamre med karbondioksid. Samle hele tumor vev i ofret mus med øyen saks og behandle dem for histologi og immunhistokjemi (IHC) analyse. Undersøk Human CD8, PD-1 og PD-L1 uttrykk i disse vev. Se protokoll trinn 4.
2. PBMC donor-skjerm
- Screen et panel av PBMC givere på grunn av den forventede variasjoner resulterte fra Pbmc samlet inn fra enkeltpersoner. Bruk A431-celler til å injisere med Pbmc fra forskjellige donorer i henhold til prosedyrene som angitt i trinn 1,2.
Merk: Over 50 friske PBMC-donorer ble vist i studien for å få nok antall egnede donorer. Forskere som ønsker å vedta denne protokollen kan bestemme på egen hånd hvor mange sunne PBMC givere til å bli vist, basert på utformingen av den planlagte studier. - Monitor tumor volum to ganger i uken ved å måle med en tykkelse.
Merk: Tumor vekst kan variere med PBMC fra ulike donorer. - Samle tumorvevet på et gjennomsnittlig volum på 200-500 mm3 og behandle dem for histologi og IMMUNHISTOKJEMI (IHC) analyse. Undersøk menneskelige CD8, PD-1 og PD-L1 uttrykk. Se trinn 4 for detaljert protokoll.
- Velg PBMC donorer som resulterer i moderat tumor vekst (tumor volum > 200 mm3 14 dager post inoculation) og relativt høy PD-1, PD-L1 og CD8 uttrykk (gjennomsnittlig IHC score > 2). Se trinn 4 for detaljert protokoll for IHC scoring.
3. menneskelig kreftcelle linje og PDX skjerm
- Screen cellelinjer og PDXs i henhold til prosedyrene angitt i trinn 1,2, for å evaluere tumor vekst, menneskelige PD-L1 uttrykk for svulster og immun celle infiltrasjon.
Merk: Over 30 menneskelige kreftcelle linjer og over 20 PDXs av ulike krefttyper ble vist av forfatterne. Data fra utvalgte tumor modeller ble vist i resultat seksjonen.
4. immunhistokjemi (IHC)
- Harvest som indikert av trinn 1.2.5 og fikse tumor vev ved å fordype i formalin. Tørke og legge fast vev i parafin. § Den faste vev på 3 μm og plassere dem på polylysine-belagte lysbilder.
- Deparaffinize i xylenes tre ganger 7 min hver. Hydrat seksjonene gjennom gradert alkoholer: 100% etanol to ganger i 3 min hver, etterfulgt av 90%, 80% og 70% etanol igjen i 3 minutter hver. Skyll med deionisert H2O tre ganger og fjern overflødig væske fra lysbildene.
- Utfør antigen gjenfinning ved å plassere lysbildene i en beholder og dekk med 10 mM natrium citrate buffer (pH 6,0), eller Tris-EDTA (pH 9,0). Varm opp lysbildene beholderen med mikrobølgeovn i 3 min. kok i et vannbad ved 95 ° c i 30 min og Avkjøl deretter til romtemperatur. Skyll med deionisert H2O tre ganger og aspirer overflødig væske fra lysbildene.
- Block seksjonene med 3% storfe serum albumin i PBS for 1 t og 0,3% H2O2 løsning i PBS for 10 min. stain av antistoffer mot humant CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) og PD-L1 (E1L3N) ved 4 ° c over natten, og HRP bøyd 2nd antistoffer ved RT for 1 h. slipp underlaget DAB (3, 3 '-diaminobenzidine) på lysbildene og kontroller reaksjonstiden (sekunder til minutter) ved å overvåke den brune fargen fra mikroskopet.
- Dekk lysbildene med nøytral balsam etter å fordype lysbildene i 0,5% saltsyre alkohol og 0,5% ammoniakk vann i sving for 5 s hver, deretter i 80%, 90% og 100% etanol i rekkefølge for 3 min hver, og til slutt i xylenes ved hjelp av tre endringer i 5 min hver. Oppdag antistoffer ved å observere den brune fargen på DAB ved hjelp av mikroskop.
Merk: Humant CD8 og PD-1-uttrykk på tumor-infiltrere leukocytter (TIL) ble vurdert ved å tildele en uttrykks poengsum på en 5-punkts skala (IHC score, Range 0-4) ved høy objektiv forstørrelse (20x, 40x). 0, fraværende; 1, svak intensitet/mindre enn 20% celler; 2, svak-til-moderat intensitet/20%-50% celler; 3, moderat til sterk intensitet/50%-80% celler; 4, sterk intensitet/mer enn 80% celler. Human PD-L1 farging i tumorceller ble scoret ved hjelp av et justert scoring system på en 5-punkts skala (IHC score, Range 0-4) på grunn av sin relativt diffust signal. 0, fraværende; 1, svak intensitet/mindre enn 10% celler; 2, svak-til-moderat intensitet/10%-30% celler; 3, moderat/30%-50% celler; 4, sterk intensitet/mer enn 50% celler.
5. in vivo effekt og Farmakodynamikk studier i Humanisert PBMC-NOD/SCID Xenograft modeller
- Pre-Treat NOD/SCID mus som indikert av trinn 1.1.3. I korte trekk, behandle mus med 100 mg/kg CP (IP) og 125 mg/kg DS (PO) en gang om dagen for 2 dager.
- 20 til 24 h etter den andre dosen, injisere subkutant (SC) med indikert antall humane kreftceller og 2,5-5 x 106 pbmc (totalt 200 μL celle blanding i 50% Matrigel) i høyre fremre flanke av dyr.
Merk: Antallet av PBMC anvendt for alle individ musen inne ettall enkelt studere burde være det likt. Men på grunn av variasjoner i tilgjengeligheten av totalt isolert PBMC på tidspunktet for hver studie, har forfatterne valgt å bruke 2,5 x 106, 4 x 106, eller 5 x 106 PBMC på ulike studier. Selv om dette 2-fold forskjell i administrert mengde Pbmc kan påvirke graden av menneskeliggjøring, forfatterne ikke observere betydelige forskjeller i evalueringen anti-tumor efficacies av testet immunterapi. - For PDXs engraftment, Injiser subkutant tumor fragmenter (3 x 3 x 3 mm3) i høyre fremre flanke av dyr. Injiser subkutant 200 μL av 5 x 106 pbmc (100 μL hver side) til venstre og høyre for engrafted tumor fragment.
Merk: PDX tumor vev ble administrert i en Matrigel løsning, samme som beskrevet for cellelinje modeller. - På dagen for celle inoculation, tilfeldig gruppe dyrene og behandle som den planlagte studien protokollen. Vurdere anti-tumor aktivitet av kandidat narkotika, BGB-A317 (QW, IP) i dette tilfellet, ved angitte doser i ulike tumor modeller.
Merk: De tre humane kreftcelle linjer (dvs. A431 (epidemoid kreft), SKOV3 (eggstokkene kreft) og SK-MES-1 (lungekreft)), samt to PDX modeller (dvs. BCLU-054 (lungekreft) og BCCO-028 (tykktarmskreft)), anses som gode tumor modeller for I-O terapi evaluering i denne humanisert muse modellen. - Mål primære tumor volum to ganger hver uke, ved hjelp av en tykkelse.
Merk: Gand kroppsvekt tap ble observert rundt 4-6 uker etter PBMC engraftment i våre studier, slik at en 1-2 måneders vindu for terapeutisk effekt evalueringer. - For farmakodynamikk analyse av tumor infiltrere immunceller, kutt tumor vev i små biter og fordøye dem med kollagenase type I (1 mg/mL) og DNase i (100 μg/mL) i RPMI1640 pluss 5% fosterets storfe serum (FBS) i 30 min ved 37 ° c. Pass fordøyd vev gjennom 40 μm celle siler å få enkelt celle suspensjoner.
- Vask cellene og Juster celle nummer til en konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml i iskald FACS buffer (PBS, 1% FBS) i 96-brønn runde bunnplater. Vask cellene ved sentrifugering og blokker dem ved å tilsette 20 μg/mL humant IgG i 30 minutter, etterfulgt av farging med anti-humant CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) og PD-1 (MIH4) antistoffer ved 4 ° c i 30 min. Deretter underlagt farget prøvene å flyte flowcytometri og analysere ved hjelp av guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter prosedyrene som presenteres her, ble en PBMC-basert humanisert xenograft modell etablert. Kort sagt, CP myeloablation effekter i NOD/SCID mus ble bestemt av Flow flowcytometri analyse av nøytrofile og monocytt populasjoner post CP og DS behandling (figur 1). 100 mg/kg CP pluss 125 mg/kg DS ble bestemt som den optimale dosen og brukt i senere studier som diett resulterer i maksimal tømming av nøytrofile og monocytter uten å forårsake alvorlig toksisitet for mus. Deretter ble menneskelig PBMC og tumor transplantasjon utført. Tilstedeværelsen av humant immun celle infiltrerer i tumor mikromiljøet ble verifisert av IHC (figur 2).
Et panel av PBMC givere ble vist in vivo for å sikre relativt høy immun celle infiltrasjon i tumor mikromiljøet og akseptabel tumor vekstrate (del 2, Figur 3A). I mellomtiden, over 30 menneskelige kreftcelle linjer samt over 20 PDXs av ulike krefttyper ble vist for å evaluere tumor vekst, tumor PD-L1 uttrykk og immun celle infiltrasjon (§ 3). Representative resultater ble vist i Figur 3B.
Disse PBMC-engrafted humanisert mus ble deretter brukt til å undersøke anti-tumor aktivitet av BGB-A317. Human Pbmc fra utvalgte sunne donorer ble co-injisert med humane tumorceller (A431, SKOV3 og SK-MES-1) eller primære tumor vev fragmenter avledet fra kreftpasienter (BCCO-028 og BCLU-054) subkutant. Musene ble behandlet, som indikert i Figur 4, med BGB-A317 eller PBS intraperitonealt en gang i uken fra dagen for tumor implantation. I alle ovennevnte modeller viste BGB-A317 betydelige anti-tumor aktiviteter (Figur 4).
Figur 1 : Myeloablation av Nod/SCID-mus som bruker cyklofosfamid (CP) og Disulfiram (DS). (A) gating strategi som brukes til å identifisere myelogen celle delsett inkludert nøytrofile og monocytter. (B) representative resultater av myelogen celle (CD11b+), nøytrofile (CD11b+Ly6G+) og monocytt (CD11b+Ly6C+) tall ved ulike doser av CP behandling. Boksene representerer 75th, 50th og 25th persentil av verdiene. Topp-og bunn linjene representerer maksimale og minimale datapunkter i området på henholdsvis 1.5 x IQ (Inter Quarter). n = 3 for kjøretøy gruppen og n = 6 for CP-og/eller DS-behandlede grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Human PBMC transplantasjon og tumor engraftment. (A) skjematisk diagram som viser den generelle arbeidsflyten av PBMC-baserte humanisert xenograft modell. (B) tumor vekst av A431 celler ved subkutan co-injeksjon med donor PBMC med de angitte forholdene (data representerer bety tumor volum ± SEM, n = 6). (C) IHC analyse av svulster utviklet hos mus behandlet med eller uten CP + DS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : PBMC donor og menneskelig kreftcelle linje skjermen. (A) representative oppsummeringsdata fra PBMC giver skjerm. PBMC ble blandet med A431-celler og inokulert subkutant i humanisert NOD/SCID-mus (se trinn 2). Hver prikk representerer gjennomsnittlig dataverdi på 3 mus engrafted med Pbmc fra 1 donor. (B) representative resultater fra menneskelig kreftcelle linje skjermen. PBMC fra utvalgte donorer ble co-injisert med A431, SK-MES-1 eller SKOV3 celler. Data representerer bety tumor volum ± SEM samlet inn fra 3 mus, 14 dagers post inoculation av de indikerte cellelinjer. Mean IHC score ± SEM representerer gjennomsnittet uttrykk for menneskelige CD8, PD-1, og PD-L1 av alle 3 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Anti-tumor aktiviteter og farmakodynamikk analyse av BGB-A317 i PBMC-baserte humanisert xenograft modell. Den anti-tumor aktivitet av BGB-A317 ved indikerte doser (IP, QW) ble vurdert ved hjelp av menneskelig kreftcelle linjer (A) A431 (med 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (med 5 x 106 PBMC), (D) SK-Mes-1 (med 5 x 106 PBMC), og pasient-avledet xenotransplantater (PDXs) (E) BCLU-054 (med 5 x 106 PBMC) og (F) BCCO-028 (med 5 x 106 PBMC). PBMC fra utvalgte sunne donorer og tilsvarende tumorceller ble co-injisert subkutant i humanisert NOD/SCID mus (n = 8 til 10). (B) kvantifisering av tumor-infiltrere hCD8 + og HCD8 + hPD-1 + celler i BGB-A317 behandlet A431 svulster. n = 8-10 dyr per gruppe i A, og C til F, n = 4-6 dyr per gruppe i B; data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Betydningen ble evaluert ved hjelp av en tosidig ikke sammenkoblet student t-test under forutsetning av ulik varians. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår kunnskap om kreftutvikling og progresjon har avansert betydelig de siste årene, med fokus på en helhetlig forståelse av både tumorceller og tilhørende stroma. Utnytte verten immun mekanismer kan indusere en større innvirkning mot kreftceller, som representerer en lovende behandling strategi. Murine modeller med intakt mus uimottakelig systemer, for eksempel syngeneic og GEM-modeller, har vært mye brukt til å studere Checkpoint-mediert immunitet. Effekt vurderinger ved hjelp av disse modellene avhenger i stor grad av surrogat anti-mus Target antistoffer13,14. Men iboende forskjeller mellom menneskelige og murine uimottakelig systemer og mangelen på noen menneskelige mål i murine modeller grense prekliniske studier av i-O anti-tumor effekter15,16. Derfor robuste musemodeller som inkluderer både menneskelige immunceller og menneskelige svulster er presserende ønsket, noe som vil betydelig forbedre oversettelsen og utviklingen av romanen I-O legemiddel selskap.
Her beskriver vi en menneskelig PBMC-basert xenograft musemodell som potensielt kan brukes til translational I-O-studier. PBMC giver samt kreftcelle linje/PDX-skjermer er avgjørende for å sikre robusthet og reproduserbarhet ved in vivo effekt studier. PBMC donorer ble vist in vivo for å sikre vellykket menneskelig tumor og immun celle engraftment. I mellomtiden, over 50 cellelinjer og PDXs av ulike menneskelige kreft opprinnelse ble vist for å evaluere tumor vekst, menneskelige PD-L1 uttrykk, og immun celle infiltrasjon. Våre analyser tyder på at om lag 20% av kreftcelle linjer og PDXs undersøkt demonstrere akseptabel tumor vekstrate mens på samme tid har relativt høy TILs og PD-L1 farging, som anses som gode modeller for I-O effekt evalueringer.
HLA Matching brukes rutinemessig i klinikken for å matche pasienter og donorer for organ eller marg transplantasjon17. Forfatterne har imidlertid bare utført begrenset karakterisering på HLA skrive, og dette er fortsatt et interessant tema å bli undersøkt i fremtidige studier. Forfatterne ønsker å være oppmerksom på at en PBMC donor kan være egnet for en kreftcelle linje/PDX men ikke ideelt for andre. Derfor kan PBMC givere må undersøkes for hver kreft modell for å sikre optimale resultater.
Engraftment av menneskelig PBMC i Nod/SCID eller NSG mus alltid fører til en xenogeneic pode-vs-host sykdom (xGvHD), en post-transplantasjon lidelse som skyldes immun-mediert angrep av mottaker vev av donor T celler18,19. Kliniske observasjoner som vanligvis forbindes med xGVHD har blitt observert i vår humanisert-modell, slik som erythema, bøyd holdning, vekttap og dødelighet (data ikke vist). Disse fenotyper ble vanligvis observert mot slutten av våre studier, vanligvis på 1-2 måneder etter engraftment, indikerer forplantning og infiltrasjon av menneskelig T celler i xGVHD målorganer. Dette gjør at en 1-2 måneders vindu for terapeutiske I-O terapi evalueringer. Flere tilnærminger har blitt benyttet for å redusere musen medfødte immunitet og forbedre menneskets immun celleengraftment. For eksempel, NSG mus defekt i murine MHC klasse I og klasse II uttrykk støtte engraftment av funksjonelle menneskelige T-celler i fravær av akutt xGvHD etter injeksjon av PBMC22.
NOD/SCID mus ble brukt i denne protokollen. Mus homozygote for SCID mutasjon har svekket T og B celle lymfocytter utvikling og NOD bakgrunnen i tillegg resulterer i mangelfull naturlig Killer (NK) celle funksjon20. Andre mer høyt immunodeficient mus, slik som NSG (The Jackson Laboratory), NCG (Charles elv) og NOG (CIEA) stammer, har blitt etablert. Når engrafted med pbmc, disse musene har vist utvikle menneskelige immunceller og danner et miljø som ligner menneskets immunsystem23,24. Alternativt kan disse musene være engrafted med CD34+ Human blodkreft stamceller (HPCs) og vise mer vedvarende T celle differensiering og modning25. I tillegg har neste generasjons immunodeficient musemodeller med ytterligere genetiske modifikasjoner blitt etablert for å støtte bedre menneskelig myelogen avstamning utvikling og økt engraftment effektivitet (se variantene porteføljen websiden til The Jackson Laboratory og Taconic biovitenskap).
Flere detaljer om bruk av disse nye stammene for menneskelig immunitet rekonstituering venter videre undersøkelser. Likevel, protokollen skissert i denne artikkelen kan tjene som en generell retningslinje for å etablere og karakteriserer immunodeficient mus modeller tilberedt med menneskelige PBMC. Tre menneskelig kreftcelle linjer og to menneskelige pasient-avledet xenotransplantater, som dekker en rekke krefttyper, er demonstrert i denne artikkelen, noe som tyder på potensialet brede anvendelser av vår protokoll i translational i-O studier. De fleste humanisert PBMC modeller, til vår kunnskap, har valgt IV eller IP som ruten for injeksjon26,27. Våre modeller i stedet gi delvis rekonstituert menneskelig immunitet i menneskets svulst bærende mus gjennom subkutant admixing av menneskelig PBMC med kreft xenotransplantater. Denne tilnærmingen gir en rask og kostnadseffektiv, men likevel svært reproduserbar alternativ til full stilk cellen rekonstituering (f. eks CD34+ blodkreft stilk cellen-engrafted humanisert mus). Vår modell har vist seg å være nyttig for å evaluere T celle-engasjerende kreft immunterapi, spesielt når du arbeider på korte tidslinjer eller for å velge agenter før du flytter til en mer kompleks multi-avstamning immunitet modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har eierandel i BeiGene. Tong Zhang og Kang Li er oppfinnere på et patent som dekker BGB-A317 beskrevet i denne studien.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av våre laboratorier for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble delvis støttet av biomedisinsk og Life Science innovasjon og dyrking Research program i Beijing Municipal Science and Technology Commission under Grant Agreement no. Z151100003915070 (prosjekt "prekliniske studie på en roman immune onkologi anti-tumor stoffet BGB-A317"), og det ble også delvis støttet av interne selskapet finansiering for prekliniske forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
