Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.

Abstract

Vele biologische cellen/weefsels voelen de mechanische eigenschappen van hun lokale milieu's via mechanoreceptoren, proteïnen die aan krachten zoals druk of mechanische verstoringen kunnen antwoorden. Mechanoreceptoren detecteren hun stimuli en zenden signalen uit via een grote diversiteit aan mechanismen. Enkele van de meest voorkomende rollen voor mechanoreceptoren zijn in neuronale reacties, zoals aanraking en pijn, of haarcellen die functioneren in balans en gehoor. Mechanosensation is ook belangrijk voor cel types die regelmatig worden blootgesteld aan shear stress, zoals endothelial cellen, die lijn bloedvaten, of bloedcellen die shear ervaring in de normale circulatie. Viscometers zijn apparaten die de viscositeit van vloeistoffen te detecteren. Rotatie viscometers kan ook worden gebruikt om een bekende shear kracht toe te passen op vloeistoffen. Het vermogen van deze instrumenten om uniforme shear te voeren om vloeistoffen is geëxploiteerd om vele biologische vloeistoffen, waaronder bloed en plasma studie. Viscosimeter kan ook worden gebruikt om shear toe te passen op de cellen in een oplossing, en om de effecten van shear op specifieke ligand-receptor paren te testen. Hier gebruiken we Cone-plate viscosimeter om de effecten van endogene niveaus van shear stress testen op bloedplaatjes behandeld met antilichamen tegen de bloedplaatjes mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mechanoreceptoren zijn eiwitten die reageren op mechanische prikkels, zoals druk of mechanische verstoring/vervorming. Voor sommige mechanoreceptoren, het ontdekken van deze mechanische verstoringen is expliciet aan de functie van de cel types waarin zij worden uitgedrukt. Neem, bijvoorbeeld, de rek receptoren in baroreceptor neuronen; Deze mechanosensitive ionenkanalen reguleren de bloeddruk door het ontdekken van vasculaire "stretch"1,2. In het binnenoor, ion kanalen op haarcellen detecteren mechanische vervormingen veroorzaakt door geluidsgolven3, en cutane lage drempel Mechanoreceptoren (LTMRs) vergemakkelijken de overdracht van tactiele informatie4. In andere gevallen, mechanoreceptoren verstrekken belangrijke informatie aan de cel voor de totstandbrenging van adhesie of de groei. De cellen kunnen de starheid van hun lokaal milieu voelen, en kunnen op samentrekbaar krachten via actine cytoskelet en integrines baseren om de groei of het uitspreiden te dicteren5,6.

Wanneer het bestuderen van receptor-ligand interactie in cel of weefsel-gebaseerde modellen, bestaan de gemeenschappelijke analyses die snel en nauwkeurig de gevolgen kunnen rapporteren van het veranderen van temperatuur, pH, ligand concentratie, tonicity, membraan potentieel, en veel andere parameters die kan variëren in vivo. Nochtans, kunnen deze zelfde analyses plotseling vallen wanneer het over het ontdekken van de bijdrage van mechanische kracht aan receptor activering komt. Of cellen zijn sensing hun micromilieu, het opsporen van geluidsgolven, of reageren op Stretch, een ding de bovengenoemde mechanoreceptoren gemeen hebben is dat ze deelnemen aan interacties waar de ligand, receptor, of beide, zijn verankerd aan een Oppervlak. De analyses die worden ontwikkeld om de gevolgen van mechanische krachten op receptor interactie te testen wijzen vaak op dit paradigma. Microfluidics en stromings kamers worden gebruikt om de effecten van shear flow op cellen en receptoren7,8te bestuderen. Dit soort experimenten hebben het voordeel van het toestaan van Fine-tuning van de shear rates via gevestigde stroomsnelheden. Andere technieken gebruiken fluorescente moleculaire sondes om krachten te ontdekken die door cellen op ligand-rijke oppervlakten worden toegepast, opbrengend een nauwkeurige uitlezing van de omvang en de richtlijnen van krachten betrokken bij interactie9,10.

In aanvulling op mechanosensation voorkomende waar een of beide partners zijn verankerd aan een oppervlak, shear stress kan van invloed zijn eiwitten en cellen in oplossing. Dit wordt vaak waargenomen in bloedcellen/proteïnen die constant in de omloop zijn, en kunnen zich via activering van mechanoreceptoren manifesteren die normaal oppervlakte-verankerd11, of door blootstelling van doel opeenvolgingen zijn die onder afgesloten zouden zijn statische voorwaarden12. Echter, relatief minder technieken assay de effecten van shear Force op deeltjes in oplossing. Sommige in-oplossing benaderingen introduceren shear via wervelende cellen in vloeibare suspensie met verschillende snelheden en duur, hoewel deze benaderingen niet mogelijk een zeer nauwkeurige bepaling van de shear stress gegenereerd. Rotatie viscometers maatregel viscositeit door toepassing van een specifieke shear kracht op vloeistoffen. Hierin beschrijven we een toegepaste methode voor het bepalen van het effect van specifieke laminaire shear tarieven op cellen of cel fragmenten in oplossing.

Een van de hoogst uitgedrukte eiwitten op het plaatoppervlak is het glycoproteïne (GP) IB-IX complex. GPIb-IX is de primaire receptor voor de plasma proteïne Von Willebrand factor (VWF). Samen is dit receptor-ligand paar al lang erkend als de fundering van de bloedplaatjes reactie op shear stress13. In het geval van vasculaire schade, VWF bindt aan blootgesteld collageen in de sub-endothelial matrix14, waardoor het werven van bloedplaatjes op de site van de schade via de VWF-GPIB-IX interactie. VWF engagement om haar bindende site in de GPIbα subeenheid als GPIb-IX onder fysiologische shear stress induceert ontvouwen van een membraan-proximale mechanosensory domein (MSD), die op zijn beurt activeert GPIb-IX15. In een recente studie hebben we aangetoond dat antilichamen tegen GPIbα, zoals die gegenereerd in veel immuun trombocytopenie (ITP) patiënten, zijn ook in staat het induceren van bloedplaatjes signalering via MSD ontvouwen onder shear stress11. Nochtans, in tegenstelling tot VWF, die shear-veroorzaakte GPIb-IX activering door het complex onder normale omloop te immobiliseren vergemakkelijkt, kunnen de bivalente antilichamen crosslink bloedplaatjes via GPIb-IX en de MSD in omloop openen. Op deze manier, een mechanoreceptor die normaal wordt geactiveerd door de oppervlakte immobilisatie onder shear kan worden geactiveerd in oplossing. In het onderhavige verslag, zullen we aantonen hoe een viscometer-gebaseerde uniform shear assay werd benut om de effecten van specifieke niveaus van shear stress op receptor activering in oplossing te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle methoden met behulp van donor-afgeleide menselijke bloedplaatjes hierin beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Emory University/Children's Healthcare van Atlanta.

1. bloed trekken en plaatjes isolatie

  1. Trek menselijk bloed van toestemmende gezonde volwassen donors via punctie op de dag van het experiment in 3,8% trinatriumfosfaat citraat. Een 4,5 mL buis van bloed is voldoende om de opbrengst voldoende bloedplaatjes rijk plasma (PV) voor 20-25 voorwaarden bij donoren waarvan de bloedplaatjes zijn dicht bij 250 x 103 per l.
    Opmerking: Vermijd het tekenen van bloed via smalle meter naalden (kleiner dan 21 G).
  2. Bereid PV via Centrifugeer bij 22 °C en 140 x g voor 12 min met een lange rem voor. Dit zal resulteren in twee verschillende lagen, met rode bloedcellen aan de onderkant en het licht gekleurde PV aan de top.
  3. Isoleer de bovenste, bewolkte, gele laag van het PV via zorgvuldige pipetten door middel van een pipet uiteinde gesneden op een 45 ° hoek en het verkrijgen van de bloedplaatjes tellen via een complete bloedbeeld (CBC).
  4. Indien nodig, wassen bloedplaatjes in PIJPen-gebufferde zoutoplossing (150 mM NaCl, 20 mM PIJPen) in aanwezigheid van prostaglandine E1 (PGE1) en hersuspend in de buffer van Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mm MgCl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm Hepes, pH 7,35) met 5 mm glucose, anders gaat u verder met stap 1,5. De volgende stappen beschrijven het wassen in het kort.
    1. Pas het PV-volume aan op 10 mL met PIJPen-gebufferde zoutoplossing en Voeg 0,6 μM PGE1 toe.
    2. Centrifugeer gedurende 8 min bij 1.900 x g, gooi bovendrijvende en laat de plaatjes pellet in 400 l van Tyrode en glucoseoplossing voor 5 minuten zitten.
    3. Zachtjes opnieuw op te schorten de bloedplaatjes pellet en houd het ongestoord voor 30 min.
  5. Stel het aantal bloedplaatjes in op ~ 250 x 103 bloedplaatjes per l met gepoolde menselijke bloedplaatjes-slecht plasma (PPP) en houd de schorsing bij 22 °c ongestoord of onder zachte rotatie.

2. ligand en uniform shear behandeling

Opmerking: alle stappen in sectie 2 die nodig zijn om te pipetteren moeten langzaam worden uitgevoerd, om geen shear te introduceren.

  1. Voeg het gewenste antilichaam of ligand toe aan de PV-of gewassen bloedplaatjes en meng zachtjes door op en neer te pipetteren of te roeren met een pipet tip. Laat het ongestoord bij kamertemperatuur voor 5-10 min. Voeg een gelijkwaardig volume van PPP of Tyrode buffer toe aan een negatieve controle.
  2. Zet de kegel-plaat viscometer, zet de plaat temperatuur tot 22 ° c en laat de tijd om de plaat te laten deze temperatuur te bereiken.
  3. Pipetteer de behandelde PV-of gewassen bloedplaatjes op de door de temperatuur gecontroleerde kegel plaat viscometer direct in het midden van de plaat. Zorg ervoor dat alle van het monster wordt gedeponeerd tussen de kegel en de plaat op het punt van contact, en niet op de buitenkant van de rand van de kegel.
  4. Afschuinen op een passende snelheid en duur.
    1. Bereken shear zoals aangegeven door de viscometer handleiding, of zoals eerder getoond15,16.
    2. Bepaal shear rate van viscositeit en gewenste shear stress via de wet van Newton van de viscositeit; Equation 1; de viscositeit van het plasma is 1.5-1.6 centipoise (cP)17. Bijvoorbeeld, een normaal scheren bereik voor menselijke circulatie is 5-30 dyn/cm2 en shear moet worden toegepast op de enkele cijfers minuten tijdschaal.
  5. Til de kegel van de plaat slighlty (~ 2 mm), zodat het monster blijft in contact met zowel de plaat en kegel, en gebruik een gel-loading of een andere lange pipet tip om 5-10 l te verzamelen uit het midden van het monstervolume.
  6. Incubeer de geschoren monsters met de gewenste markeringen voor 20 min bij kamertemperatuur. Voor markeringen van fosfatidylserine, β-galactose, en P-selectine blootstelling gebruik Lactadherin C2 domein (LactC2) bij 0,08 μM18, Erythrina cristagalli LECTINE (ecl) bij 6,25 μg/ml, en anti-P-selectine antilichaam (20 µ g/ml), respectievelijk.
  7. Bevestig monsters in 2% Paraformaldehyde voor 20 min bij RT vóór verdunning of koude opslag, en ga verder met stap 3,1 of op te slaan monsters bij 4 ° c voor niet langer dan 12 uur.

3. detectie van oppervlakte-markers en crosslinking via flow Cytometry

  1. Analyseer het monster via flow Cytometry, het verzamelen van ten minste 20.000 evenementen voor elke voorwaarde.
  2. Quantitate signaalsterkte van de fluorescente markeringen gebruikend de hoogtewaarde voor de intensiteit van elke fluorophore, of de geometrische gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI).
  3. Als gericht op het detecteren van bloedplaatjes crosslinking na shear behandeling, analyseren het monster op een Imaging-staat flow cytometer en quantitate crosslinking per gebied en aspect ratio parameters.
    1. Plot een histogram van gebied en/of aspect ratio.
    2. Gebruik een negatieve controle met boviene serum albumine (BSA) of voertuig om een poort te trekken met uitzondering van de meeste volledig circulaire gebeurtenissen (deze poort wordt meestal getekend op een aspect ratio ~ 0,819,20) en quantitate het percentage van de gebeurtenissen binnen van deze poort. Gebeurtenissen met een lagere beeldverhouding zijn waarschijnlijk kruisverwijzende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 schetst hoe de trigger model van GPIB-IX activering, in eerste instantie geïntroduceerd om shear-afhankelijke receptor activering verklaren wanneer verankerd aan de vaatwand, kan ook ondersteuning activering van bloedplaatjes kruisverwijzende door een multivalente ligand. Figuur 2 toont uitlezingen van menselijke bloedplaatjes activatie behandeld door twee antilichamen gericht op de N-Terminal domein van GPIB-IX (6B4 en 11A8), en een controle antilichaam (normale IgG) onder geschoren en statische voorwaarden. In Figuur 3werden bloedplaatjes behandeld met 6B4 en een antilichaam met een niet-bindende kracht te laag om GPIB-IX activatie trigger, AK2. Figuur 4 toont een tijd cursus. Markers van de activering van bloedplaatjes werden probed en gedetecteerd op progressieve tijdpunten tijdens shear behandeling met 11A8 of AK2. In Figuur 5a, antilichaam crosslinking plaatjes-sized kralen versierd met de GPIb-IX N-Terminal domein werd getest via conventionele flow Cytometry. Figuur 5 b toont de 6B4-gemedieerde crosslinking van bloedplaatjes zoals afgebeeld via Imaging flow Cytometry. In Figuur 6werden klinische monsters van serum van patiënten met immuun trombocytopenie gebruikt in plaats van de divalent monoclonale antilichamen tegen GPIB-IX gebruikt in voorgaande figuren. De patiënt plasma-bevattend antilichamen tegen GPIb-IX veroorzaakten shear-afhankelijke reacties, in tegenstelling tot plasma van ITP patiënten zonder antilichamen die GPIb-IX richten.

Figure 1
Figuur 1 : Bloedplaatjes oppervlak Mechanoreceptor GPIb-IX kan binden een oplosbare divalent ligand (zoals een antilichaam). Wanneer twee GPIb-IX complexen op verzettende bloedplaatjes binden aan dezelfde divalent ligand, crosslinking optreedt. Onder fysiologische Shear, kan de kruisverwijzende bloedplaatjes genereren van een trekkracht om op te treden op GPIb-IX en ontvouwen de MSD daarin. Als gevolg van MSD ontvouwen, GPIb-IX wordt geactiveerd, en induceert bloedplaatjes signalering en downstream bloedplaatjes klaring, zoals geïllustreerd. Figuur is aangepast van Quach et al.21Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Expressie van markers van de activering van bloedplaatjes in de menselijke PV behandeld met controle IgG of anti-GPIb-IX antilichamen 11A8 en 6B4 onder statische of geschoren (30 dyn/cm2) voorwaarden. In deze representatieve resultaten, de blootstelling van bloedplaatjes van fosfatidylserine (PS), β-galactose, en P-selectine werden geprobeerd door groene fluorescerende eiwitten (GFP)-geconjugeerde Lact-C2, FITC-geconjugeerde Erythrina cristagalli lectine (ECL) en APC-geconjugeerde anti-P-selectine antilichaam, respectievelijk. Fluorescentie werd gedetecteerd via flow Cytometry. De gegevens worden uitgedrukt als percentage van gebeurtenissen met fluorescentie boven negatieve controle. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; significantie bepaald via de t-toets van de student. Foutbalken staan voor standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Humane PV behandeld met twee anti-GPIb-IX antilichamen. Humane PV behandeld met twee anti-GPIb-IX antilichamen, één met hoge Unbinding kracht (6B4) en met lage Unbinding kracht (AK2) onder statisch (0 dyn/cm2), lage schaar (5 dyn/cm2), en hoge shear (30 dyn/cm2) voorwaarden. De grafieken tonen percentage van gebeurtenissen positief voor oppervlakte uitdrukking van β-galactose, PS, en P-selectine. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. Significantie werd bepaald via een one-way ANOVA met Tukey test. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Figure is aangepast van Quach et al.11Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Tijdsverloop van shear Exposure (20 dyn/cm2) voor menselijk PV behandeld met controle IgG, 11A8, of AK2. Plaatjes oppervlak blootstelling van PS en P-selectine werd gedetecteerd via flow Cytometry voor monsters geschoren voor 0, 0,5, 1, 3 en 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001. Significantie werd bepaald via een one-way ANOVA met Tukey test. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : Quantitating crosslinking per gebied en aspect ratio parameters. (a) plaatjes-sized (4 µm) kralen werden vervoegd met de N-Terminal domein van GPIbα en bebroed met IgG (grijs), AK2 (rood), of 6B4 (blauw) onder geschoren (20 dyn/cm2) voorwaarden. Hier getoond zijn contour percelen van voorwaartse verspreiding (FSC-A) versus anti-muis antilichamen fluorescentie. (b) histogram voor de aspect ratio van de bloedplaatjes in PV-incubatie met 6B4 en fluorescerend gelabelde anti-CD41 (een plaatjes marker) antistoffen onder shear. Representatieve beelden op verschillende beeldverhoudingen worden getoond. Figuur is aangepast van Quach et al.11Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6 : De klinische steekproeven van serum van patiënten met immune trombocytopenie werden gebruikt in plaats van divalent monoclonal antilichamen tegen GPIb-IX. (a) GPIB-IX bindende capaciteit van plasma van patiënten met ITP, getest via enzym-gebonden immunosorbent ASSAY (Elisa). (b) gewassen menselijke bloedplaatjes die in ITP patiënt plasma worden hervormd onder statische en geschoren (30 dyn/cm2) voorwaarden. De grafieken tonen percentage van gebeurtenissen positief voor oppervlakte uitdrukking van P-selectine of PS. * * * * p ≤ 0,0001. Significantie werd bepaald via one-way ANOVA met Tukey test. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Figure is aangepast van Quach et al.11Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het protocol beschreven in dit manuscript maakt een snelle en veelzijdige beoordeling van het effect van laminaire shear op bloedplaatjes en cel oppervlak receptoren. De specifieke representatieve resultaten hier te onderstrepen hoe de effecten van multimeric of bivalente liganden kunnen worden beïnvloed door shear flow. In aanvulling op deze toepassing, een uniforme shear assay heeft brede toepassingen in het observeren van shear-afhankelijke effecten. Bij afwezigheid van een bekend ligand-receptor paar, kan een uniform shear assay ook de effecten van shear op factoren zoals vorm van de cel en signalering, vooral wanneer gecombineerd met Flow flowcytometrische analyses. Een eenvormige shear Assay, die gedeeltelijk door Figuur 5bis gezinspeeld, leent zich voor een breed scala van detectiemethoden, andere dan of in aanvulling op standaard stromings flowcytometrische analyses die in dit protocol worden beschreven, met inbegrip van Imaging, biochemische en op cellen gebaseerde Tests.

Figuur 2 illustreert de basistoepassing van de Assay, specifiek om te discrimineren tussen een shear-afhankelijke ligand-receptor interactie en een negatieve controle. 6B4, een antilichaam dat in staat is crosslinking bloedplaatjes via binding aan GPIb-IX receptoren en het ondersteunen van voldoende kracht om de receptor te activeren11, activeert bloedplaatjes bij blootstelling aan shear (afgebeeld in het model in Figuur 1), in tegenstelling tot de controle IgG die niet binden bloedplaatjes GPIb-IX. Deze toepassing levert gelijktijdig bewijs dat het effect specifiek is voor het gekozen receptor-ligand paar en afhankelijk is van shear. De uniform shear assay kan ook onderscheid maken tussen de effecten van liganden die kunnen en kunnen niet volhouden hun obligaties aan een receptor onder specifieke shear niveaus. In Figuur 3, zien we een gebrek aan signalering uitlezing van de anti-GPIB-IX antilichaam AK2, die zijn epitope bindt met een bijzonder zwakke onbindende kracht11. Dit cijfer toont ook de effecten van het variëren van het niveau van de shear stress toegepast door de kegel-plaat viscometer van een lage tot hoge shear.

Figuur 4 toont aan dat deze test kan worden gebruikt om de lengte van de shear blootstelling moduleren en suggereert een strategie voor het weergeven van deze gegevens. In Figuur 5, twee alternatieve flow-Cytometry gebaseerde uitlezingen voor de assay worden gebruikt, die beide zich niet beroepen op TL-markeringen van de receptor activering, maar in plaats daarvan kan worden gebruikt om crosslinking en grootte/vorm te veranderen te beschrijven. Figuur 5 b laat zien hoe voorwaartse spreiding, die toeneemt in verhouding tot de grootte van een gebeurtenis, kan onderscheid maken tussen verschillende populaties van Unlinked (singlet), dubbel, triplet, of hoger veelvouden kruisverwijzende evenementen. Zoals in Figuur 5b, kan de assay worden toegepast op kralen geconjugeerd aan een receptor van belang, die elimineert de mogelijkheid van andere receptoren die deelnemen aan de crosslinking gebeurtenissen gezien via andere methoden. In Figuur 6, plasma, een biologische vloeistof met potentiële liganden voor onze receptor van belang wordt gebruikt in plaats van gezuiverde monoclonale antilichamen. Dit illustreert een toepassing waarin een specifieke bekende ligand of bindende partner voor een receptor van belang niet nodig kan zijn.

Hoewel de assay is vrij toegankelijk als geschreven, zijn er een paar belangrijke stappen die moeten worden uitgevoerd met zorg. Foremost onder deze is om voorzichtig te zijn niet in te voeren shear van externe bronnen, andere dan de werkelijke shear behandeling zelf. Bij het tekenen van bloed, zoals vermeld in stap 1,1 van dit protocol, is het belangrijk om het te trekken door middel van een goede gauge naalden. Voor menselijke bloedafname via punctie van toestemmende volwassen donoren, kan dit worden bereikt met een 21 G bloedafname set (opgenomen in de tabel van materialen). Zodra het bloed is getekend en PV is geïsoleerd, kan het worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 6 uur op de Bank of op een langzame Rotisserie.

Als de centrifuge gebruikt om te isoleren PV kan remmen op verschillende snelheden is het het beste om te kiezen voor een langzame rem om verstoring van de PV-laag en de toepassing van onnodige kracht te minimaliseren. Zodra PV is geïsoleerd of de cel soort van belang is in de vloeistof schorsing, voorkomen pipetten van de mengsels te snel. In plaats daarvan, aspireren en verdrijven monsters in een langzame en stabiele manier vooral tijdens stap 2,5, waar het monster wordt getekend door een bijzonder smalle pipet tip. Voor sample volumes die nauwkeurig kunnen worden gepipetteerd via pipet-tips van verschillende grootte, is het raadzaam om de grootste onder hen te gebruiken. Voor bijzonder gevoelige of viskeuze monsters kan het uiteinde van het pipet uiteinde in een hoek worden gesneden om de opening te verbreden waardoor het monster wordt getrokken.

Vele analyses die het effect van shear op cellulaire mechanosensation testen baseren zich op een interactie tussen een verankerd ligand en zijn receptor. Microfluidics en flow kamers zijn een voorbeeld, waar de interactie tussen een verankerd ligand en een receptor, meestal op een cel in oplossing, kan worden waargenomen in real time7,8. Andere technieken gebruiken microscopie om gebeurtenissen op te sporen die zich bij de interface tussen een cel laag en het onderliggende substraat of sonde9voordoen. Deze technieken zijn gebruikt om bijzonder groot effect in het bestuderen van bloedcellen in omloop. Aan de andere kant, technieken die het mogelijk maken de ondervraging van gebeurtenissen die zich volledig in de oplossing onder stroming zijn meer beperkt. Voor algemene toepassing van kracht in oplossing, kan het vortexen van een steekproef als "snelle en vuile" methode dienen. Het is echter moeilijk om de precieze kracht te bepalen, en de shear is niet zeker het gevolg van laminaire stroming. Dit is een van de voordelen van de uniform shear assay. Aan de andere kant, het primaire nadeel van de uniform shear assay is een tijdsverschil tussen de toepassing shear en observeren van de cellen zelf. Shear wordt toegepast, dan cellen zijn gekleurd en vast, maar Imaging technieken kunnen niet waarnemen van de cellen tijdens het shear proces zelf. Een aanpassing van deze methode zou inhouden dat het toevoegen van de cellen rechtstreeks aan de gewenste markeringen en scheren met de aanwezige markers. Dit zou de onmiddellijke opsporing van om het even welke voorbijgaande gevolgen toelaten.

Tot nu toe hebben we deze test toegepast om de shear-afhankelijke in-oplossing effect van antilichamen gericht op de GPIb-IX complex op te sporen. Terwijl de antilichamen een geschikte, eenvoudige, divalent bindende partner verstrekken, is het logisch om te veronderstellen dat crosslinking van mechanoreceptoren op zich het verzetten van cellen in omloop via horde multivalente ligands met voldoende hoge Unbinding kan worden verwezenlijkt Krachten. Deze techniek kan in de toekomst nuttig zijn bij het opsporen van de specifieke effecten van dergelijke liganden. Bovendien kan de uniform shear assay worden gebruikt in combinatie met Imaging technieken die hierin niet beschreven worden, zoals de standaard fluorescentie microscopie. Uiteindelijk, de uniform shear assay biedt een redelijk goedkope, kwantitatieve en specifieke methode voor de toepassing van laminaire shear op cellen en cel fragmenten in oplossing, en kan worden gebruikt stroomopwaarts van de vele detectiemethoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk relevant voor deze studie werd gesteund voor een deel door nationale instituten van gezondheid (NIH) nationaal hart, Long, en het Instituut van het bloed verleent HL082808, HL123984 (R.L.), en F31HL134241 (M.E.Q.). Financiering ook verstrekt door NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); en pilot Grant Funds van kinderen de gezondheidszorg van Atlanta en Emory University Pediatric flow Cytometry core. De auteurs willen bedanken Dr. Hans Deckmyn voor het delen van de 6B4 antilichaam, en de Emory Children's Pediatric Research Center flow Cytometry core voor technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter