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Biology

Un dosage de cisaillement uniforme pour les récepteurs plaquettaires et de surface cellulaires humains via la viscosimètre à plaques coniques

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Nous décrivons une méthode en solution pour appliquer un cisaillement uniforme aux récepteurs de surface plaquettaire à l’aide de la viscosimètre à plaques coniques. Cette méthode peut également être utilisée plus largement pour appliquer le cisaillement à d’autres types de cellules et des fragments de cellules et n’a pas besoin de cibler une paire ligand-récepteur spécifique.

Abstract

De nombreuses cellules/tissus biologiques sentent les propriétés mécaniques de leurs environnements locaux via des mécanorécepteurs, des protéines qui peuvent réagir à des forces telles que la pression ou des perturbations mécaniques. Les mécanorécepteurs détectent leurs stimuli et transmettent des signaux via une grande diversité de mécanismes. Certains des rôles les plus communs pour les mécanorécepteurs sont dans les réponses neuronales, comme le toucher et la douleur, ou les cellules capillaires qui fonctionnent dans l’équilibre et l’audition. La mécanosensation est également importante pour les types de cellules qui sont régulièrement exposés à des contraintes de cisaillement telles que les cellules endothéliales, qui alignent les vaisseaux sanguins, ou les cellules sanguines qui subissent un cisaillement en circulation normale. Les viscosimètres sont des dispositifs qui détectent la viscosité des fluides. Les Viscosimètres rotatifs peuvent également être utilisés pour appliquer une force de cisaillement connue aux fluides. La capacité de ces instruments à introduire un cisaillement uniforme aux fluides a été exploitée pour étudier de nombreux fluides biologiques, y compris le sang et le plasma. La viscométrie peut également être utilisée pour appliquer le cisaillement aux cellules dans une solution, et pour tester les effets du cisaillement sur des paires spécifiques de ligands-récepteurs. Ici, nous utilisons la viscométrie à plaques coniques pour tester les effets des niveaux endogènes de contrainte de cisaillement sur les plaquettes traitées avec des anticorps dirigés contre le complexe de récepteurs mécanosensoriaux plaquettaires GPIb-IX.

Introduction

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Les mécanorécepteurs sont des protéines qui réagissent aux stimuli mécaniques, tels que la pression ou la perturbation mécanique/déformation. Pour certains mécanorécepteurs, la détection de ces perturbations mécaniques est explicite à la fonction des types de cellules dans lesquels elles sont exprimées. Prenez, par exemple, les récepteurs extensibles dans les neurones barorécepteurs; ces canaux ioniques mécanosensibles régulent la tension artérielle en détectant le «Stretch» vasculaire1,2. Dans l’oreille interne, les canaux ioniques des cellules capillaires détectent les déformations mécaniques causées par les ondes sonores3, et les mécanorécepteurs à faible seuil cutané (LTM) facilitent la transmission d’informations tactiles4. Dans d’autres cas, les mécanorécepteurs fournissent des informations importantes à la cellule pour l’établissement de l’adhérence ou de la croissance. Les cellules peuvent sentir la rigidité de leur environnement local, et peuvent compter sur les forces contractiles par l’intermédiaire du cytosquelette d’actine et des intégrines pour dicter la croissance ou la propagation5,6.

Lors de l’étude des interactions récepteur-ligand dans des modèles cellulaires ou tissulaires, il existe des dosages communs qui peuvent rapidement et précisément rapporter les effets de la modification de la température, du pH, de la concentration du ligand, de la tonicité, du potentiel membranaire et de nombreux autres paramètres qui peuvent varier in vivo. Cependant, ces mêmes dosages peuvent être courts lorsqu’il s’agit de détecter la contribution de la force mécanique à l’activation des récepteurs. Si les cellules détectent leur microenvironnement, détectant des ondes sonores, ou répondant à l’étirement, une chose que les mécanorécepteurs susmentionnés ont en commun est qu’ils participent à des interactions où le ligand, récepteur, ou les deux, sont ancrés à un surface. Les essais mis au point pour tester les effets des forces mécaniques sur les interactions des récepteurs reflètent souvent ce paradigme. Microfluidics et les chambres de débit sont utilisés pour étudier les effets du flux de cisaillement sur les cellules et les récepteurs7,8. Ces types d’expériences ont l’avantage de permettre un réglage précis des taux de cisaillement par des vitesses de débit établies. D’autres techniques emploient des sondes moléculaires fluorescentes pour détecter les forces appliquées par les cellules sur des surfaces riches en ligands, donnant une lecture précise de l’amplitude et des orientations des forces impliquées dans l’interaction9,10.

En plus de la mécanosensation survenant lorsque l’un ou les deux partenaires sont ancrés sur une surface, la contrainte de cisaillement peut affecter les protéines et les cellules en solution. Ceci est souvent observé dans les cellules sanguines/protéines qui sont constamment dans la circulation, et peut se manifester par l’activation des mécanorécepteurs qui sont normalement ancrés en surface11, ou par l’exposition des séquences cibles qui seraient occlus sous conditions statiques12. Cependant, relativement moins de techniques d’essai des effets de la force de cisaillement sur les particules en solution. Certaines approches en solution introduisent le cisaillement par des cellules de Vortex dans la suspension de fluide avec des vitesses et des durées variables, bien que ces approches ne permettent pas une détermination très précise de la contrainte de cisaillement générée. Les Viscosimètres rotatifs mesurent la viscosité en appliquant une force de cisaillement spécifique aux fluides. Nous décrivons ici une méthode appliquée pour déterminer l’effet de taux de cisaillement laminaire spécifiques sur des cellules ou des fragments de cellules en solution.

L’une des protéines les plus fortement exprimées sur la surface plaquettaire est le complexe de glycoprotéine (GP) IB-IX. Le GPIb-IX est le principal récepteur de la protéine plasmatique von Willebrand Factor (VWF). Ensemble, cette paire récepteur-ligand a longtemps été reconnue comme le fondement de la réponse plaquettaire à la contrainte de cisaillement13. En cas de lésion vasculaire, la VWF se lie au collagène exposé dans la matrice Sub-endothéliale14, ce qui permet de recruter des plaquettes sur le site de la lésion par l’intermédiaire de l’interaction vWF-GPIB-IX. L’engagement de VWF sur son site de liaison dans la sous-unité GPIbα si GPIb-IX sous contrainte de cisaillement physiologique induit le déploiement d’un domaine mécanosensoriel membranaire proximal (MSD) qui à son tour active le GPIb-IX15. Dans une étude récente, nous avons montré que les anticorps dirigés contre le GPIbα, comme ceux générés chez de nombreux patients atteints de thrombocytopénie immunitaire (ITP), sont également capables d’induire la signalisation plaquettaire par le déploiement de MSD sous contrainte de cisaillement11. Cependant, contrairement à la VWF, qui facilite l’activation du GPIb-IX induite par le cisaillement en immobilisant le complexe sous une circulation normale, les anticorps bivalents sont capables de relier les plaquettes via GPIb-IX et de déplier les TMS en circulation. De cette façon, un mécanorécepteur qui est normalement activé par l’immobilisation de surface sous cisaillement peut être activé en solution. Dans le présent rapport, nous démontrerons comment un essai de cisaillement uniforme basé sur un viscosimètre a été exploité pour détecter les effets de niveaux spécifiques de contrainte de cisaillement sur l’activation des récepteurs en solution.

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Protocol

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Toutes les méthodes utilisant des plaquettes humaines dérivées des donneurs décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité d’examen institutionnel de l’Université Emory/Children’s Healthcare d’Atlanta.

1. prélèvement sanguin et isolement plaquettaire

  1. Prélever du sang humain de donneurs adultes sains consentants par ponction veineuse le jour de l’expérience en 3,8% de citrate trisodique. Un tube de sang de 4,5 mL est suffisant pour produire suffisamment de plasma riche en plaquettes (PRP) pour 20-25 conditions chez les donneurs dont le nombre de plaquettes est proche de 250 x 103 par μl.
    Remarque: Évitez de dessiner du sang par des aiguilles à jauge étroite (inférieures à 21 G).
  2. Préparer la PRP par centrifugation à 22 ° c et 140 x g pendant 12 min avec un long frein. Cela se traduira par deux couches distinctes, avec des globules rouges au fond et le PRP de couleur claire en haut.
  3. Isolez la couche supérieure, trouble et jaune de PRP par pipetage minutieux à l’aide d’une pointe de pipette coupée à un angle de 45 ° c et obtenez le numération plaquettaire par une numération sanguine complète (CBC).
  4. Si nécessaire, lavez les plaquettes dans une solution saline tamponnée par les PIPES (150 mM de NaCl, tubes de 20 mM) en présence de prostaglandine E1 (PGE1) et resuspendez dans le tampon de Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM MgCl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) avec 5 mm de glucose, sinon, passez à l’étape 1,5. Les étapes suivantes décrivent le lavage en bref.
    1. Réglez le volume PRP à 10 mL avec une solution saline tamponnée par PIPES et ajoutez 0,6 μM PGE1.
    2. Centrifugez pendant 8 min à 1 900 x g, puis jetez le surnageant et laissez la pastille plaquettaire reposer dans 400 μl de solution de Tyrode et de glucose pendant 5 min.
    3. Résuspendez doucement le culot plaquettaire et maintenez-le intact pendant 30 min.
  5. Ajuster la numération plaquettaire à ~ 250 x 103 plaquettes par μl avec du plasma humain en commun (PPP) et maintenir la suspension à 22 ° c non perturbée ou en rotation douce.

2. ligand et traitement de cisaillement uniforme

Remarque: toutes les étapes de la section 2 nécessitant un pipetage doivent être faites lentement, afin de ne pas introduire de cisaillement.

  1. Ajouter l’anticorps ou le ligand désiré au PRP ou aux plaquettes lavées et mélanger doucement en pipetant de haut en bas ou en remuant avec une pointe de pipette. Laissez-le intact à température ambiante pendant 5-10 min. Ajoutez un volume équivalent de PPP ou de tampon de Tyrode à un contrôle négatif.
  2. Allumez le viscosimètre à plaque conique, réglez la température de la plaque à 22 ° c et laissez le temps de laisser la plaque atteindre cette température.
  3. Pipetter la PRP traitée ou les plaquettes lavées sur le viscosimètre à plaque conique contrôlé par la température directement au centre de la plaque. S’assurer que tout l’échantillon est déposé entre le cône et la plaque au point de contact, et non à l’extérieur de la jante du cône.
  4. Cisaillement à un rythme et une durée appropriés.
    1. Calculez le cisaillement comme indiqué dans le manuel du viscosimètre, ou comme indiqué précédemment15,16.
    2. Déterminer le taux de cisaillement de la viscosité et la contrainte de cisaillement souhaitée via la Loi de viscosité de Newton; Equation 1; la viscosité plasmatique est de 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Par exemple, une plage de cisaillement normale pour la circulation humaine est 5-30 dyn/cm2 et le cisaillement doit être appliqué sur l’échelle de temps de minute à un seul chiffre.
  5. Soulevez le cône hors de la plaque (~ 2 mm) de sorte que l’échantillon reste en contact avec la plaque et le cône, et utilisez une pointe de gel-chargement ou d’une autre extrémité de pipette longue pour collecter 5-10 μL du centre du volume de l’échantillon.
  6. Incuber les échantillons cisaillés avec les marqueurs désirés pendant 20 min à température ambiante. Pour les marqueurs de la phosphatidylsérine, du β-galactose et de l’exposition à la P-SELECTINE, utiliser le domaine du Lactadherin C2 (LactC2) à 0,08 μM18, la lectine d’Erythrina cristagalli (ECL) à 6,25 μg/ml et l’anticorps anti-p-selectin (20 μg/ml), respectivement.
  7. Fixer les échantillons dans 2% de paraformaldéhyde pendant 20 min à RT avant dilution ou entreposage à froid, et passer à l’étape 3,1 ou entreposer les échantillons à 4 ° c pendant plus de 12 h.

3. détection des marqueurs de surface et réticulation par cytométrie en flux

  1. Analysez l’échantillon par cytométrie en flux, collectant au moins 20 000 événements pour chaque condition.
  2. Quantiez la force du signal des marqueurs fluorescents en utilisant la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore, ou l’intensité moyenne géométrique de la fluorescence (MFI).
  3. Si vous visez à détecter la réticulation plaquettaire après un traitement au cisaillement, analysez l’échantillon sur un cytomètre de flux capable d’imagerie et quantiez la réticulation par zone et paramètres de rapport d’aspect.
    1. Tracer un histogramme de la zone et/ou le ratio d’aspect.
    2. Utiliser un témoin négatif avec de l’albumine sérique bovine (BSA) ou un véhicule pour tracer une barrière excluant les événements les plus circulaires (cette porte est habituellement dessinée àun rapport d’aspect ~ 0,8) et QUANTITE le pourcentage d’événements à l’intérieur de cette barrière. Les événements avec un ratio d’aspect inférieur sont plus susceptibles d’être réticulé.

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Representative Results

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La figure 1 décrit comment le modèle déclencheur de l’activation du GPIB-IX, initialement introduit pour expliquer l’activation du récepteur dépendant du cisaillement lorsqu’il est ancré à la paroi du vaisseau, peut également soutenir l’activation de plaquettes croisées par un ligand multivalents. La figure 2 montre les lectures de l’activation plaquettaire humaine traitée par deux anticorps ciblant le domaine N-terminal du GPIB-IX (6B4 et 11A8), et un anticorps de contrôle (IgG normales) sous des conditions cisaillées et statiques. Dans la figure 3, les plaquettes ont été traitées avec 6B4 et un anticorps avec une force non contraignante trop faible pour déclencher l’activation de GPIB-IX, AK2. La figure 4 montre un parcours temporel. Les marqueurs de l’activation plaquettaire ont été sondé et détectés aux points de temps progressifs pendant le traitement par cisaillement avec 11A8 ou AK2. Dans la figure 5a, l’anticorps réticulation des billes de taille plaquettaire décorées avec le domaine GPIB-IX N-terminal a été analysé par cytométrie en flux conventionnel. Figure 5 b montre la réticulation médiée par 6B4 des plaquettes comme imagées par cytométrie de flux d’imagerie. Dans la figure 6, des échantillons cliniques de sérum provenant de patients atteints de thrombocytopénie immunitaire ont été utilisés à la place des anticorps monoclonaux divalents contre le GPIB-IX utilisés dans les figures précédentes. Les anticorps contenant du plasma du patient contre le GPIb-IX ont déclenché des réponses dépendantes du cisaillement, contrairement au plasma des patients ITP sans anticorps ciblant le GPIb-IX.

Figure 1
Figure 1 : Le mécanorécepteur de surface plaquettaire GPIb-IX peut lier un ligand divalents soluble (tel qu’un anticorps). Lorsque deux complexes GPIb-IX sur des plaquettes opposées se lient au même ligand divalents, la réticulation se produit. Sous cisaillement physiologique, les plaquettes réticulé peuvent générer une force de traction pour agir sur GPIb-IX et déplier le MSD. En conséquence du déploiement de MSD, le GPIb-IX est activé et induit la signalisation plaquettaire et la clairance plaquettaire en aval, comme illustré. La figure a été adaptée de Quach et al.21veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2 : Expression des marqueurs de l’activation plaquettaire dans le PRP humain traité avec des anticorps IgG de contrôle ou anti-GPIb-IX 11A8 et 6B4 sous conditions statiques ou cisaillées (30 dyn/cm2). Dans ces résultats représentatifs, l’exposition de la surface plaquettaire de la phosphatidylsérine (PS), du β-galactose et de la P-selectin a été sonée par la protéine fluorescente verte (GFP) conjuguée lact-C2, la lectine de l’Erythrina cristagalli (ECL) conjuguée au FITC et la anticorps anti-P-selectin, respectivement. La fluorescence a été détectée par cytométrie en flux. Les données sont exprimées en pourcentage des événements avec fluorescence au-dessus du contrôle négatif. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; l’importance déterminée par le test tde l’étudiant. Les barres d’erreur représentent l’écart type (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : PRP humain traité avec deux anticorps anti-GPIb-IX. PRP humain traité avec deux anticorps anti-GPIB-IX, l’un avec une force non contraignante élevée (6b4) et l’autre avec une faible force d’séparation (AK2) sous des conditions statiques (0 dyn/cm2), à faible cisaillement (5 dyn/cm2) et à cisaillement élevé (30 dyn/cm2). Les graphiques montrent le pourcentage d’événements positifs pour l’expression de surface de β-galactose, PS et P-selectin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. L’importance a été déterminée par une ANOVA à sens unique avec test Tukey. Les barres d’erreur représentent SD. la figure a été adaptée de Quach et coll.11veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Temps d’exposition au cisaillement (20 dyn/cm2) pour le PRP humain traité avec IgG de contrôle, 11A8, ou AK2. L’exposition de la surface plaquettaire de PS et de P-selectin a été détectée par cytométrie en flux pour les échantillons cisaillés pour 0, 0,5, 1, 3 et 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001. L’importance a été déterminée par une ANOVA à sens unique avec test Tukey. Les barres d’erreur représentent SD. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Quantifiant la réticulation par zone et les paramètres de rapport d’aspect. (a) les billes de taille plaquettaire (4 μM) ont été conjuguées avec le domaine N-terminal de GPIbα et incubées avec des conditions IgG (grises), AK2 (rouge) ou 6B4 (bleues) sous cisaillées (20 dyn/cm2). Voici les courbes de contour de la dispersion en avant (FSC-A) versus la fluorescence d’anticorps anti-souris. (b) histogramme pour le rapport d’aspect des plaquettes en PRP incubées avec 6B4 et des anticorps anti-CD41 (marqueur plaquettaire) marqués fluorescemment sous cisaillement. Des images représentatives à différents rapports d’aspect sont affichées. La figure a été adaptée de Quach et coll.11veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Des échantillons cliniques de sérum provenant de patients atteints de thrombocytopénie immunitaire ont été utilisés à la place des anticorps monoclonaux divalents contre le GPIb-IX. a) capacité de liaison du GPIB-IX du plasma chez les patients atteints d’ITP, analysés par dosage immunoenzymatique (ELISA). (b) les plaquettes humaines lavées reconstituées dans le plasma du patient ITP sous des conditions statiques et cisaillées (30 dyn/cm2). Les graphiques montrent le pourcentage d’événements positifs pour l’expression de surface de P-selectin ou PS. * * * * p ≤ 0,0001. L’importance a été déterminée par ANOVA à sens unique avec test Tukey. Les barres d’erreur représentent SD. la figure a été adaptée de Quach et coll.11veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Le protocole décrit dans ce manuscrit permet une évaluation rapide et polyvalente de l’effet du cisaillement laminaire sur les récepteurs des plaquettes et des cellules de surface. Les résultats représentatifs spécifiques présentés ici soulignent comment les effets des ligands multimères ou bivalents peuvent être affectés par le flux de cisaillement. En plus de cette application, un essai de cisaillement uniforme a des applications larges dans l’observation des effets dépendant du cisaillement. En l’absence d’une paire ligand-récepteur connue, un essai de cisaillement uniforme peut également détecter les effets du cisaillement sur des facteurs tels que la forme et la signalisation des cellules, en particulier lorsqu’ils sont couplés à des analyses cytométriques de flux. Fait allusion en partie à la figure 5b, un essai de cisaillement uniforme se prête à une grande variété de méthodes de détection autres que ou en complément des analyses cytométriques de flux standard décrites dans ce protocole, y compris l’imagerie, la biochimie et les cellules Essais.

La figure 2 illustre l’application de base du dosage, spécifiquement pour distinguer entre une interaction ligand-récepteur dépendante du cisaillement et un contrôle négatif. 6B4, un anticorps capable de relier les plaquettes par liaison aux récepteurs GPIb-IX et de maintenir une force suffisante pour activer le récepteur11, active les plaquettes lorsqu’elles sont exposées au cisaillement (représentées dans le modèle de la figure 1), contrairement à la IgG de contrôle qui ne lie pas le GPIb-IX plaquettaire. Cette application fournit simultanément la preuve que l’effet est spécifique à la paire récepteur-ligand choisie et dépend du cisaillement. L’essai de cisaillement uniforme peut également distinguer les effets des ligands qui peuvent et ne peuvent pas maintenir leurs liaisons à un récepteur sous des niveaux de cisaillement spécifiques. Dans la figure 3, nous voyons un manque de lecture de signalisation de l’anticorps anti-GPIB-IX AK2, qui lie son épitope avec une force non contraignante particulièrement faible11. Ce chiffre démontre également les effets de la variation du niveau de contrainte de cisaillement appliqué par le viscosimètre à plaques coniques d’un cisaillement faible à élevé.

La figure 4 démontre que ce dosage peut être utilisé pour moduler la longueur de l’exposition au cisaillement et suggère une stratégie pour l’affichage de ces données. Dans la figure 5, deux lectures alternatives basées sur la cytométrie en flux pour le dosage sont utilisées, toutes deux ne reposant pas sur des marqueurs fluorescents de l’activation des récepteurs, mais peuvent être utilisées pour décrire la réticulation et le changement de taille/forme. Figure 5 b montre comment la dispersion de l’avant, qui augmente proportionnellement à la taille d’un événement, peut distinguer entre les populations distinctes de non liés (Singlet), doublet, triplet, ou plus élevé multiplet des événements croisés. Comme dans la figure 5b, le dosage peut être appliqué à des billes conjuguées à un récepteur d’intérêt, ce qui élimine la possibilité d’autres récepteurs participant aux événements de réticulation observés par d’autres méthodes. Dans la figure 6, le plasma, un liquide biologique contenant des ligands potentiels pour notre récepteur d’intérêt est utilisé à la place des anticorps monoclonaux purifiés. Ceci illustre une application dans laquelle un ligand ou un partenaire de liaison connu spécifique pour un récepteur d’intérêt peut ne pas être nécessaire.

Bien que le dosage soit assez accessible tel qu’il est écrit, il y a quelques étapes clés qui doivent être exécutées avec précaution. Parmi ceux-ci, il faut veiller à ne pas introduire de cisaillement de sources externes autres que le traitement de cisaillement proprement dit. Lors du prélèvement de sang, comme mentionné à l’étape 1,1 de ce protocole, il est important de le dessiner par des aiguilles de jauge appropriées. Pour la collecte de sang humain par ponction veineuse de donneurs adultes consentants, ceci peut être accompli avec un ensemble de 21 G de prélèvement sanguin (répertorié dans le tableau des matériaux). Une fois que le sang est prélevé et que le PRP est isolé, il peut être conservé à température ambiante jusqu’à 6 h sur le banc ou sur une rôtisserie lente.

Si la centrifugeuse utilisée pour isoler le PRP peut freiner à différentes vitesses, il est préférable de choisir un frein lent afin de minimiser la perturbation de la couche PRP et l’application de la force inutile. Une fois que le PRP est isolé ou que le type de cellule d’intérêt est en suspension liquide, évitez de Pipetter les mélanges trop rapidement. Au lieu de cela, aspirer et expulser des échantillons de façon lente et régulière, surtout au cours de l’étape 2,5, où l’échantillon est dessiné à travers une pointe de pipette particulièrement étroite. Pour les volumes d’échantillons qui peuvent être soigneusement pipettés par des pointes de pipette de différentes tailles, il est conseillé d’utiliser le plus grand parmi eux. Pour les échantillons particulièrement sensibles ou visqueux, la fin de l’embout de la pipette peut être coupée à un angle pour élargir l’ouverture à travers laquelle l’échantillon doit être dessiné.

De nombreux essais qui testent l’effet du cisaillement sur la mécanosensation cellulaire reposent sur une interaction entre un ligand ancré et son récepteur. Les Microfluidics et les chambres d’écoulement sont un exemple, où l’interaction entre un ligand ancré et un récepteur, généralement sur une cellule en solution, peut être observée entemps réel 7,8. D’autres techniques utilisent la microscopie pour détecter les événements survenant à l’interface entre une couche cellulaire et le substrat sous-jacent ou la sonde9. Ces techniques ont été utilisées pour un effet particulièrement grand dans l’étude des cellules sanguines en circulation. D’autre part, les techniques qui permettent l’interrogation d’événements qui se produisent entièrement en solution sous écoulement sont plus limitées. Pour l’application générique de la force en solution, le vortex d’un échantillon peut servir de méthode «rapide et sale». Cependant, il est difficile de déterminer la force exacte appliquée, et le cisaillement n’est pas certain de résulter du flux laminaire. C’est l’un des avantages de l’essai de cisaillement uniforme. D’autre part, l’inconvénient principal de l’essai de cisaillement uniforme est un intervalle de temps entre le cisaillement de l’application et l’observation des cellules elles-mêmes. Le cisaillement est appliqué, puis les cellules sont colorées et fixées, mais les techniques d’imagerie ne peuvent pas observer les cellules pendant le processus de cisaillement lui-même. Une adaptation de cette méthode impliquerait d’ajouter les cellules directement aux marqueurs désirés et de ciser avec les marqueurs présents. Cela permettrait la détection immédiate de tout effet transitoire.

Jusqu’à présent, nous avons appliqué ce dosage pour détecter l’effet en solution dépendant du cisaillement des anticorps ciblant le complexe GPIb-IX. Bien que les anticorps fournissent un partenaire de liaison divalents, pratique et simple, il est logique de supposer que la réticulation des mécanorécepteurs sur les cellules opposées en circulation peut être accomplie par l’intermédiaire de multiples ligands multivalents avec une forces. Cette technique peut être utile à l’avenir dans la détection des effets spécifiques de ces ligands. En outre, l’essai de cisaillement uniforme peut être utilisé en conjonction avec des techniques d’imagerie non décrites dans la présente, telles que la microscopie standard par fluorescence. En fin de compte, l’essai de cisaillement uniforme fournit une méthode raisonnablement bon marché, quantitative et spécifique pour appliquer le cisaillement laminaire aux cellules et aux fragments cellulaires en solution, et peut être utilisé en amont de nombreuses méthodes de détection.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les travaux pertinents à cette étude ont été appuyés en partie par les instituts nationaux de santé (NIH) National Heart, Lung et Blood Institute octroie HL082808, HL123984 (R.L.) et F31HL134241 (M.E.Q.). Financement également fourni par l’Institut national des sciences médicales générales de la NIH Grant T32GM008367 (M.E.Q.); et les fonds de subvention pilote de Children’s Healthcare d’Atlanta et de l’Université Emory cytométrie en flux pédiatrique de base. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Hans Deckmyn pour avoir partagé l’anticorps 6B4 et le centre de cytométrie en flux de l’Emory Children’s pédiatrique Center pour le support technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
Un dosage de cisaillement uniforme pour les récepteurs plaquettaires et de surface cellulaires humains via la viscosimètre à plaques coniques
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Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

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