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Biology

Ein Uniform Shear Assay für menschliche Platelets und Zelloberflächen per Cone-plate Viscometry

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Wir beschreiben eine In-Solation-Methode, mit der mittels der Vonenplattenviskometrie einheitliche Schere auf Plattenoberflächen aufgetragen werden kann. Diese Methode kann auch breiter verwendet werden, um Schere auf andere Zelltypen und Zellfragmente aufzutragen und muss nicht auf ein bestimmtes Liga-Rezeptor-Paar zielen.

Abstract

Viele biologische Zellstoffe spüren die mechanischen Eigenschaften ihrer lokalen Umgebung durch Mechanorezeptoren, Proteine, die auf Kräfte wie Druck oder mechanische Störungen reagieren können. Mechaniker erkennen ihre Reize und übertragen Signale über eine Vielzahl von Mechanismen. Einige der häufigsten Rollen für Mechanorezeptoren sind in neuronalen Reaktionen, wie Berührung und Schmerz, oder Haarzellen, die im Gleichgewicht und Hören funktionieren. Das Mechanosensation ist auch wichtig für Zelltypen, die regelmäßig Scherkelsteinen ausgesetzt sind, wie Endothelzellen, die Blutgefäße säumen, oder Blutkörperchen, die im normalen Kreislauf Schere erleben. Viscometer sind Geräte, die die Viskosität von Flüssigkeiten erkennen. Rotationsviskometer können auch verwendet werden, um eine bekannte Scherkraft auf Flüssigkeiten anzuwenden. Die Fähigkeit dieser Instrumente, eine gleichmäßige Schere zu Flüssigkeiten einzuführen, wurde genutzt, um viele biologische Flüssigkeiten einschließlich Blut und Plasma zu untersuchen. Die Viscometrie kann auch verwendet werden, um die Schere auf die Zellen in einer Lösung aufzutragen und die Wirkung der Schere auf bestimmte Liga-Rezeptor-Paare zu testen. Hier verwenden wir die Visometrie der Kegelplatte, um die Auswirkungen der endogenen Scherkräbellenstress auf die Blutplättchen zu testen, die mit Antikörpern gegen den Plattenmechanosensoren-Rezeptor-Komplex GPIb-IX behandelt werden.

Introduction

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Mechanorezeptoren sind Proteine, die auf mechanische Reize reagieren, wie Druck oder mechanische Störungen/Verformung. Bei einigen Mechanorezeptoren ist das Empfinden dieser mechanischen Störungen explizit für die Funktion der Zelltypen, in denen sie ausgedrückt werden. Nehmen wir zum Beispiel die Stretchrezeptoren in Baroreceptor-Neuronen; Diese mechanoempfindlichen Ionenkanäle regulieren den Blutdruck, indem sie Gefäß-"Dehnung" 1,2wahrnehmen. Im Innenohr erkennen Ionenkanäle an Haarzellen mechanische Verformungen,die durch Schallwellen 3 verursacht werden, und kutane niedrige Schwellenmechanorezeptoren (LTMR) erleichtern die Übertragungvon taktilen Informationen 4. In anderen Fällen liefern Mechanorezeptoren wichtige Informationen an die Zelle für die Herstellung von Haftung oder Wachstum. Zellen können die Starrheit ihrer lokalen Umgebung spüren und können sich auf Kontrahenzkräfte über das Aktin-Zytoskelett und Integrine verlassen, um Wachstum zu diktieren odersichzu verbreiten 5,6.

Bei der Untersuchung von Rezeptor-Ligak-und Wechselwirkungen in Zell-oder Gewebemodellen gibt es gängige Assays, die schnell und präzise die Auswirkungen von Temperaturveränderungen, pH-Wert, Ligakonkonzentration, Tonizität, Membranpotenzial und vielen anderen Parametern melden können. Die in vivo variieren kann. Diese Untersuchungen können jedoch zu kurz kommen, wenn es darum geht, den Beitrag mechanischer Kraft zur Aktivierung des Rezeptors zu erkennen. Ob Zellen ihre Mikroumgebung spüren, Schallwellen erkennen oder auf Dehnung reagieren, eines haben die genannten Mechanorezeptoren gemeinsam, dass sie an Interaktionen teilnehmen, in denen der Ligand, der Rezeptor oder beides zu einem oberfläche. Die zur Untersuchung der Auswirkungen mechanischer Kräfte auf die Interaktionen der Rezeptoren entwickelten Assays spiegeln dieses Paradigma oft wider. Mikrofluidik und Strömungskammern werden verwendet, um die Auswirkungen des Scherflusses auf Zellen und Rezeptoren7,8zu untersuchen. Diese Experimente haben den Vorteil, dass die Scherfrequenz über etablierte Strömungsgeschwindigkeiten verfeinert werden kann. Andere Techniken verwenden fluoreszierende molekulare Sonden, um Kräfte zu erkennen, die von Zellen auf ligandreichen Oberflächen angewendet werden, und ergeben eine genaue Auslesung der Größe und der Orientierung der Kräfte,die an der Interaktion 9,10beteiligtsind.

Neben dem Mechanosensation, bei dem ein oder beide Partner an einer Oberfläche verankert sind, kann Scherspannung Proteine und Zellen in der Lösung beeinflussen. Dies wird oft bei Blutzellenproteinen beobachtet, die sich ständig im Kreislauf befinden, und kann sich durch die Aktivierung von Mechanorezeptoren manifestieren, die normalerweise 11 überlagert sind, oder durch die Exposition von Zielsequenzen, die unter Statische Bedingungen12. Allerdings wird die Wirkung der Scherkraft auf die Partikel in der Lösung relativ weniger Techniken untersucht. Einige in der Lösung befindliche Ansätze führen Schere über Wirbelzellen in Flüssigkeitsaufhängung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Längen ein, obwohl diese Ansätze möglicherweise keine sehr genaue Bestimmung der erzeugten Scherspannung erlauben. Rotationsviskometer messen die Viskosität, indem sie eine bestimmte Scherkraft auf Flüssigkeiten anwenden. Hierin beschreiben wir eine angewandte Methode zur Bestimmung der Wirkung bestimmter laminarer Schere auf Zellen oder Zellfragmente in der Lösung.

Eines der am stärksten ausgedrückten Proteine auf der Plattenoberfläche ist der Glykoprotein (GP) Ib-IX-Komplex. GPIb-IX ist der primäre Rezeptor für das Plasma-Protein von Willebrand Factor (VWF). Zusammen ist dieses Rezeptor-Ligandpaar längst als Fundament der Plattenreaktion auf Scherspannung13anerkannt. Im Falle von Gefäßschäden bindet der VWF in der subendothelialen Matrix14exponierte Kollagen und rekrutiert so über die VWF-GPIb-IX-Interaktion Blutplättchen an den Verletzungsort. VWF-Engagement an seiner Bindungsstelle in der GPIbα Untereinheit, wenn GPIb-IX unter physiologischer Schere Stress die Entfaltung einer Membran-proximalen mechanosensorischen Domäne (MSD) bewirkt, die wiederum GPIb-IX15aktiviert. In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass Antikörper gegen GPIbα, wie sie bei vielen Immunthrombozytopenie-Patienten (ITP) erzeugt werden, auch in der Lage sind, Blutplättenssignale über MSD zu induzieren,die sich unter Scherstress 11 entfaltet. Im Gegensatz zu VWF, das die Shear-induzierte GPIb-IX-Aktivierung erleichtert, indem der Komplex unter normaler Zirkulation immobilisiert wird, sind die bivalenten Antikörper jedoch in der Lage, die Platelets über GPIb-IX zu kreuzen und die MSD im Umlauf zu entfalten. Auf diese Weise kann ein Mechanorektor, der normalerweise durch Oberflächen-Immobilisierung unter Schere aktiviert wird, in Lösung aktiviert werden. Im vorliegenden Bericht werden wir zeigen, wie ein viskometerbasierter einheitlicher Scherenuntersuchung verwendet wurde, um die Auswirkungen bestimmter Scherkräterbelastungen auf die Rezeptor-Aktivierung in der Lösung zu erkennen.

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Protocol

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Alle Methoden, die von Spendern abgeleitete menschliche Blutplättchen verwenden, wurden vom Institutional Review Board der Emory University/Children es Healthcare of Atlanta genehmigt.

1. Blutverlosung und Platzverungrank-Isolation

  1. Ziehen Sie menschliches Blut von einvernehmlichen gesunden erwachsenen Spendern über Venipunktion am Tag des Experiments in 3,8% Trisodium Citrate. Ein 4,5 mL Blutrohr reicht aus, um genügend plateletreiches Plasma (PRP) für 20-25 Bedingungen bei Spendern zu liefern, deren Plattenzählungen bei fast 250 x 103 pro μL liegen.
    Hinweis: Vermeiden Sie es, Blut über Schmalspurnadeln zu ziehen (kleiner als 21 G).
  2. Bereiten Sie PRP über Zentrifugation bei 22 ° C und 140 x g für 12 min mit einer langen Bremse vor. Dies führt zu zwei verschiedenen Schichten, mit roten Blutkörperchen unten und dem hellfarbenen PRP an der Spitze.
  3. Isolieren Sie die obere, wolkige, gelbe Schicht von PRP durch sorgfältiges Pipettieren durch eine Pipette-Spitze, die in einem 45 °-Winkel geschnitten wird, und erhalten Sie die Plattenzählung über ein komplettes Blutbild (CBC).
  4. Bei Bedarf in der Anwesenheit von Prostaglandin E1 (PGE1) die Platten in PIPES-gepufferter Saline (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) waschen und im Tirode-Puffer wiederbeleben (134 mM NaCl, 0.34 mM Na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mM MgCl2,5mM Glukose, 12 mM NaHCO 3,20mM HEPES, pH 7.35) mit 5 mM Glukose, ansonsten auf Schritt 1,5. Die folgenden Schritte beschreiben das Waschen kurz.
    1. Passen Sie das PRP-Volumen auf 10 mL mit PIPES-gepufferter Saline an und fügen Sie 0,6 μM PGE1 hinzu.
    2. Zentrifuge für 8 min bei 1.900 x g,dann abwerfen supernatant und lassen Sie das Plattenpellet in 400 μL von Tyrode es und Glukose-Lösung für 5 min sitzen.
    3. Das Platelet Pellet vorsichtig wiederbeleben und 30 Minuten ungestört halten.
  5. Stellen Sie die Platte auf ca. 250 x 103 Platten pro μL mit gebündeltem, platelettarmem Plasma (PPP) ein und halten Sie die Aufhängung bei 22 ° C ungestört oder unter sanfter Rotation.

2. Ligand-und einheitliche Scherbehandlung

Achtung: Alle Schritte in Abschnitt 2, die Pipettieren erfordern, sollten langsam durchgeführt werden, um keine Schere einzuführen.

  1. Den gewünschten Antikörper oder Ligand in den PRP oder gewaschene Blutplättchen geben und vorsichtig vermischen, indem man auf-und abkneift oder mit einer Pipette-Spitze rühren. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 5-10 min ungestört.
  2. Schalten Sie den Von-Platte-Viskometer ein, stellen Sie die Platte auf 22 ° C und lassen Sie sich Zeit, um die Platte diese Temperatur erreichen zu lassen.
  3. Die behandelte PRP oder gewaschene Blutplättchen direkt in der Mitte der Platte auf den temperaturgesteuerten Kegelplatten-Viskometer piptieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe zwischen Kegel und Platte an der Stelle des Kontakts abgelagert wird, und nicht auf der Außenseite des Kegels.
  4. In angemessener Geschwindigkeit und Dauer erklingen die Ohren.
    1. Berechnen Sie die Schere, wie sie im Viscometer-Handbuch angegeben ist,oder wie zuvor 15,16gezeigt.
    2. Bestimmen Sie die Schere von der Viskosität und der gewünschten Schear-Stress durch Newtons Viskositätsgesetz; Equation 1; Die Plasma-Viskosität beträgt 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Zum Beispiel ist ein normaler Scherbereich für den menschlichen Kreislauf 5-30 dyn/cm 2 und die Schere sollte auf der einstelligen Minutenzeit aufgetragen werden.
  5. Heben Sie den Kegel der Platte leichter (~ 2 mm), so dass die Probe in Kontakt mit der Platte und Kegel bleibt, und verwenden Sie eine Gel-Loadung oder eine andere lange Pipette-Spitze, um 5-10 μL aus der Mitte des Probenvolumens zu sammeln.
  6. Die geschirmen Proben mit den gewünschten Markierungen 20 min bei Raumtemperatur einweichen. Für Phosphatidylserine, β-Galactose-und P-Selectin-Belichtung verwenden die Lactadherin C2-Domäne (LactC2) bei 0,08 μM 18, Erythrina cristagalli lectin (ECL) bei 6,25 μg/mL und Anti-P-selectin Antikörper (20 μg/mL).
  7. Fixieren Sie Proben in 2% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei RT vor der Verdünnung oder Kühllagerung, und gehen Sie zu Schritt 3.1 oder speichern Sie Proben bei 4 ° C für nicht länger als 12 Stunden.

3. Erkennung von Oberflächenmarkierungen und Vernetzung über Strömungszytometrie

  1. Analysieren Sie die Probe über die Strömungszytometrie und sammeln Sie mindestens 20.000 Ereignisse für jede Erkrankung.
  2. Quantitatsignalstärke der fluoreszierenden Marker, die den Höhenwert für die Intensität jedes Fluorophors oder die geometrische mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) verwenden.
  3. Wenn Sie nach der Scherbehandlung eine Platelet-Vernetzung erkennen wollen, analysieren Sie die Probe auf einem bildfähigen Strömungszytometer und quantitieren Sie die Vernetzung nach Flächen-und Seitenverhältnis-Parametern.
    1. Plot ein Histogramm der Fläche and/oder Seitenverhältnis.
    2. Verwenden Sie eine negative Steuerung mit Rinder-Serum Albumin (BSA) oder Fahrzeug, um ein Tor zu zeichnen, das die meisten kreisförmigen Ereignisse ausschließt (dieses Tor wird in der Regel mit einem Seitenverhältnis ~ 0,819,20gezeichnet) und den Prozentsatz der Ereignisse innerhalb dieses Tores zu bestimmen. Ereignisse mit einem niedrigeren Seitenverhältnis sind eher miteinander verknüpft.

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Representative Results

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Abbildung 1 skizziert, wie das Triggermodell der GPIb-IX-Aktivierung, das ursprünglich eingeführt wurde, um die schiearabhängige Rezeptor-Aktivierung zu erklären, wenn es an der Gefäßwand verankert ist, kann auch die Aktivierung von Platten unterstützen, die durch einen multivalenten Ligand miteinander verbunden sind. Abbildung 2 zeigt Auslesungen der Aktivierung menschlicher Blutplättchen, die von zwei Antikörpern behandelt werden, die auf die N-Terminal-Domäne von GPIb-IX (6B4 und 11A8) abzielen, und einen Kontrollantikörper (normales IgG) unter geschogenen und statischen Bedingungen. In Abbildung3 wurden die Blutplättchen mit 6B4 und einem Antikörper mit einer zu geringen Unverbindlichkeit behandelt, um die GPIb-IX-Aktivierung, AK2, auszulösen. Bild 4 zeigt einen Zeitverlauf. Marker der Platelet-Aktivierung wurden während der Scherbehandlung mit 11A8 oder AK2 an progressiven Zeitpunkten probiert und erkannt. In Abbildung5awurde die mit der GPIb-IX N-Terminal-Domäne verzierte Antikörper-Verkabelung von Platelett-großen Perlen über die herkömmliche Strömungszytometrie untersucht. Bild 5 B zeigt die 6B4-vermittelte Vernetzung von Blutplättchen, wie sie über die Bildflusszytometrie abgebildet ist. In Abbildung6 wurden an Stelle der divalenten monoklonalen Antikörper gegen GPIb-IX, die in früheren Zahlen verwendet wurden, klinische Proben von Serum von Patienten mit Immunthrombozytopenie verwendet. Patient Plasma-haltige Antikörper gegen GPIb-IX löste scherzabhängige Reaktionen aus, im Gegensatz zu Plasma von ITP-Patienten, ohne Antikörper, die auf GPIb-IX zielen.

Figure 1
Bild 1 : Platelet-Oberflächenmechanorektor GPIb-IX kann einen löslichen, divalenten Ligand (wie etwa einen Antikörper) binden. Wenn zwei GPIb-IX-Komplexe auf gegnerischen Blutungen an den gleichen divalenten Ligand binden, kommt es zu einer Vernetzung. Unter physiologischer Schere können die vernetzten Platten eine Zugkraft erzeugen, um auf GPIb-IX zu wirken und die MSD darin zu entfalten. Als Folge der MSD-Entfaltung wird GPIb-IX aktiviert und induziert, wie dargestellt, die Signalsignalisierung und den nachgelagerten Plattenabstand. Die Abbildung wurde von Quach et al.21 angeklickt.

Figure 2
Bild 2 : Ausdruck der Marker der Plattenaktivierung im menschlichen PRP, die mit Kontrolle IgG oder Anti-GPIb-IX Antikörper 11A8 und 6B4 unter statischen oder geschoren (30 dyn/cm 2) Bedingungen behandelt. In diesen repräsentativen Ergebnissen, platelet Oberfläche Exposition von Phosphatidylserin (PS), β-Galactose und P-Selectin wurden von grünem Fluoreszenzprotein (GFP)-konjugierte Lact-C2, FITC-konjugierte Erythrina cristagalli lectin (ECL) und APC-konjugierte Anti-P-Selectin Antikörper, bzw. Fluoreszenz wurde über Strömungszytometrie nachgewiesen. Die Daten werden als Prozentsatz der Ereignisse mit Fluoreszenz über der negativen Kontrolle ausgedrückt. S. Januar 1.001, * * * * und 0.0001; Bedeutung, die durch den Schülert-Testbestimmt wird. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung (SD) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Bild 3 : Human PRP wird mit zwei Anti-GPIb-IX-Antikörpern behandelt. Menschliches PRP behandelt mit zwei Anti-GPIb-IX-Antikörpern, einer mit hoher unverbindlicher Kraft (6B4) und einer mit geringer unverbindlicher Kraft (AK2) unter statischer (0 dyn/cm 2), niedriger Schere(5 dyn/cm 2), und hoher Schere(30 dyn/cm 2) Bedingungen. Graphen zeigen den Anteil der Ereignisse, die für die Oberflächenausübung von β-Galactose, PS und P-Selectin positiv sind. * p-0,05, * * */--0.001. Die Bedeutung wurde über eine Einbahnstraßenanmeldung mit Tukey-Test ermittelt. Fehlerbalken stellen SD dar. Abbildung wurde von Quach et al.11Sie klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4 : Zeitverlauf der Scherenbelichtung (20 dyn/cm 2) für den menschlichen PRP, der mit Kontrolle IgG, 11A8 oder AK2 behandelt wird. Die Platelet-Oberflächenbelichtung von PS und P-Selectin wurde über die Strömungszytometrie für Proben entdeckt, die für 0, 0,5, 1, 3 und 5 min geschoren wurden. * * * p-0.001, * * * p-0.0001. Die Bedeutung wurde über eine Einbahnstraßenanmeldung mit Tukey-Test ermittelt. Fehlerbalken stellen SD dar .

Figure 5
Bild 5 : Quantitative Vernetzung nach Flächen-und Seitenverhältnis-Parametern. (a) Platelett-große (4 μm) Perlen wurden mit der N-Terminal-Domäne von GPIbα konjugiert und mit IgG (grau), AK2 (rot) oder 6B4 (blau) unter geschoren (20 dyn/cm2) Bedingungen bebrütet. Gezeigt werden hier Konturplots für vorwärts Streuung (FSC-A) versus Anti-Maus-Antikörper-Fluoreszenz. (b) Histogramm für das Seitenverhältnis der Blutplättchen in PRP inkubiert mit 6B4 und fluoreszierend beschriftete Anti-CD41 (ein Plattenmarker) Antikörper unter der Schere. Es werden repräsentative Bilder in verschiedenen Seitenverhältnissen gezeigt. Die Abbildung wurde von Quach et al.11Hier angepasst, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 6
Bild 6 : Klinische Serumproben von Patienten mit Immunthrombozytopenie wurden anstelle der divalenten monoklonalen Antikörper gegen GPIb-IX eingesetzt. (a) GPIb-IX-Bindungskapazität von Plasma von Patienten mit ITP, die über Enzym-verknüpfte immunorsorbierte Assay (ELISA) untersucht werden. (b) Waschbare menschliche Blutplättchen, die im ITP-Patientenplasma unter statischen und geschoren (30 dyn/cm2) Bedingungen wiederhergestellt wurden. Graphen zeigen den Prozentsatz der Ereignisse, die positiv für die Oberflächenausübung von P-Selectin oder PS sind. Die Bedeutung wurde über eine Einweg-ANOVA mit Tukey-Test ermittelt. Fehlerbalken stellen SD dar. Abbildung wurde von Quach et al.11Sie klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle und vielseitige Beurteilung der Wirkung von Laminarschere auf Platelets und Zelloberflächen. Die hier vorgestellten spezifischen repräsentativen Ergebnisse unterstreichen, wie die Auswirkungen multimerischer oder bivalenter Liganden durch den Scherfluss beeinflusst werden können. Zusätzlich zu dieser Anwendung hat ein einheitlicher Scherenansatz breite Anwendungen in der Beobachtung von schierabhängigen Effekten. In Ermangelung eines bekannten Liga-Rezeptor-Paares kann ein gleichmäßiger Scher-Test auch die Auswirkungen der Schere auf Faktoren wie Zellform und Signalgebung erkennen, insbesondere wenn sie mit Strömungszytometrie-Analysen gepaart sind. Ein einheitlicher Scherenanalysen , der zum Teil von Abbildung 5b verwendetwird, eignet sich für eine Vielzahl von Erkennungsmethoden, die nicht oder in Ergänzung zu den in diesem Protokoll skizzierten Standardflusszytometrie-Analysen, einschließlich der Bildgebung, biochemischen und zellbasierten, eingesetzt werden. Assays.

Abbildung 2 ist ein Beispiel für die grundsätzliche Anwendung des Tests, um insbesondere zwischen einer scherzabhängigen Ligand-Rezeptor-Interaktion und einer negativen Kontrolle zu unterscheiden. 6B4, ein Antikörper, der in der Lage ist, die Blutplättchen durch Bindung an GPIb-IX-Rezeptoren zu vernetzen und genügend Kraft zu haben, um den Rezeptor11zu aktivieren, aktiviert die Platten, wenn er der Schere ausgesetzt ist (im Modell in Abbildung1 dargestellt). Kontrollierende IgG, die nicht platelet GPIb-IX bindet. Diese Anwendung liefert gleichzeitig den Beweis dafür, dass die Wirkung spezifisch für das gewählte Rezeptor-Ligand-Paar ist und von der Schere abhängig ist. Der einheitliche Scherenanfall kann auch unterscheiden zwischen den Effekten von Liganden, die ihre Bindungen zu einem Rezeptor unter bestimmten Scheren aufrechterhalten können und können. In Abbildung3 sehen wir einen Mangel an Signalauslesung aus dem Anti-GPIb-IX-Antikörper AK2, der sein Epos mit einer besonders schwachen Unverbindungskraft11bindet. Diese Abbildung zeigt auch die Auswirkungen der Variation des Niveaus der Scherspannung, die durch den Kegelplatten-Viskometer von einer niedrigen bis hohen Schere angewendet wird.

Abbildung 4 zeigt, dass dieser Test verwendet werden kann, um die Länge der Scher-Exposition zu modulieren und schlägt eine Strategie für die Darstellung dieser Daten vor. In Abbildung5 werden zwei alternative Flow-cytometrie-basierte Auslesungen für den Test verwendet, die beide nicht auf fluoreszierende Marker der Rezeptor-Aktivierung angewiesen sind, sondern zur Beschreibung von Crosslinerungen und size/-Formveränderungen verwendet werden können. Bild 5 b zeigt, wie die Vorwärtsstreuung, die im Verhältnis zur Größe eines Ereignisses proportional zunimmt, zwischen verschiedenen Populationen von nicht verknüpften (Singlet), Doppeltügen, Triplet oder höheren Multiplet-Cross-Verbindungen unterscheiden kann. Wie in Abbildung5b kannder Test auf Perlen angewendet werden, die auf einen Rezeptor von Interesse konjugiert werden, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass andere Rezeptoren an den vernetzten Ereignissen teilnehmen, die über andere Methoden gesehen werden. In Abbildung6, Plasma, wird anstelle von gereinigten monoklonalen Antikörpern eine biologische Flüssigkeit verwendet, die potentielle Liganden für unseren interessanten Rezeptor enthält. Dies veranschaulicht eine Anwendung, bei der ein bestimmter bekannter ligand oder verbindlicher Partner für einen empfänglichen Rezeptor nicht erforderlich ist.

Obwohl der Test wie geschrieben recht zugänglich ist, gibt es einige Schlüsselschritte, die mit Vorsicht durchgeführt werden sollten. An erster Stelle steht dabei die Achtung, dass man die Schere aus anderen Quellen als der eigentlichen Scherbehandlung selbst nicht einführt. Bei der Blutentnahme, wie in Schritt 1.1 dieses Protokolls erwähnt, ist es wichtig, es durch richtige Spurnadeln zu ziehen. Für die menschliche Blutentnahme durch Venenstiche von einwilligen erwachsenen Spendern kann dies mit einer 21G-Blutentnahme (in der Materiallisteaufgeführt) erreicht werden. Sobald Blut eingezogen und PRP isoliert ist, kann es bei Raumtemperatur für bis zu 6 Stunden auf der Bank oder auf einer langsamen Rotisserie gelagert werden.

Wenn die Zentrifuge, die zur Isolierung von PRP verwendet wird, mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bremsen kann, ist es am besten, eine langsame Bremse zu wählen, um die Störung der PRP-Schicht zu minimieren und unnötige Kraft aufzubringen. Sobald PRP isoliert ist oder die Zellart an der Flüssigkeitsfederung interessiert ist, vermeiden Sie, dass die Mischungen zu schnell pipettieren. Stattdessen werden die Proben langsam und stetig verdrängt, vor allem während des 2.5. Schrittes, wo die Probe durch eine besonders schmale Pipette-Spitze gezogen wird. Für Probenvolumina, die über Pipette-Spitzen unterschiedlicher Größe präzise pipettiert werden können, empfiehlt es sich, die größte unter ihnen zu verwenden. Bei besonders empfindlichen oder viskosen Proben kann das Ende der Pipette-Spitze schräg geschnitten werden, um die Öffnung zu erweitern, durch die die Probe gezogen werden soll.

Viele Assays, die die Wirkung der Schere auf das zelluläre MechanoSensation testen, stützen sich auf eine Interaktion zwischen einem angeschlagenen Ligand und seinem Rezeptor. Mikrofluidik und Strömungskammern sind ein Beispiel dafür, wo die Wechselwirkung zwischen einem angeschlagenen Ligand und einem Rezeptor, in der Regel auf einer Zelle in Lösung,inEchtzeit7,8beobachtetwerden kann. Andere Techniken verwenden die Mikroskopie, um Ereignisse zu erkennen, die an der Schnittstelle zwischen einer Zellschicht und dem zugrunde liegenden Substrat oder Sonde9auftreten. Diese Techniken wurden besonders stark bei der Untersuchung von Blutkörperchen im Umlauf eingesetzt. Auf der anderen Seite sind Techniken, die das Verhör von Ereignissen ermöglichen, die vollständig in der Lösung unter Fluss auftreten, begrenzter. Für die generische Anwendung von Kraft in der Lösung kann das Herumtexieren einer Probe als "schnelle und schmutzige" Methode dienen. Allerdings ist es schwierig, die genaue Kraft zu bestimmen, und die Schere ist nicht sicher, um durch laminaren Fluss zu resultieren. Das ist einer der Vorteile des einheitlichen Scheruntersorgens. Der primäre Nachteil des einheitlichen Scheren-Assays ist hingegen eine Zeitspanne zwischen der Anwendungsschere und der Beobachtung der Zellen selbst. Das Geräuschen wird aufgetragen, dann werden die Zellen gebeizt und fixiert, aber bildgebende Techniken können die Zellen während des Scherprozesses selbst nicht beobachten. Eine Anpassung dieser Methode würde darin bestehen, die Zellen direkt zu den gewünschten Markern hinzuzufügen und mit den vorhandenen Markern zu schälen. Dies würde die sofortige Erkennung von vorübergehenden Auswirkungen ermöglichen.

Bisher haben wir diesen Test angewendet, um den scheuenabhängigen In-Lösung-Effekt von Antikörpern zu erkennen, die auf den GPIb-IX-Komplex abzielen. Während die Antikörper einen bequemen, einfachen, divalenten Bindungspartner bieten, ist es logisch anzunehmen, dass die Vernetzung von Mechanorezeptoren auf entgegengesetzten Zellen im Kreislauf über unzählige multivalente Liganden mit ausreichend hoher Unverbindlichkeit erfolgen kann. truppen. Diese Technik kann in Zukunft nützlich sein, wenn es darum geht, die spezifischen Auswirkungen solcher Liganden zu erkennen. Darüber hinaus kann der einheitliche Scheren-Assay in Verbindung mit bildgebenden Techniken verwendet werden, die hier nicht beschrieben werden, wie die Standard-Fluoreszenzmikroskopie. Letztlich bietet der einheitliche Scheren-Test eine recht billige, quantitative und spezifische Methode für die Anwendung von laminarer Schere auf Zellen und Zellfragmente in der Lösung und kann vor vielen Nachweismethoden eingesetzt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Arbeit, die für diese Studie relevant ist, wurde zum Teil von National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung und Blood Institute, HL082808, HL123984 (R.L.) und F31HL134241 (M.E.Q.), unterstützt. Die Finanzierung auch durch das NIH-Nationale Institut für Allgemeine medizinische Wissenschaften gewährt T32GM008367 (M.E.Q.); Und Pilotzuschüsse von Children es Healthcare of Atlanta und der Emory University Pediatric Flow Cytometry Core. Die Autoren danken Dr. Hans Deckmyn für die gemeinsame Nutzung des 6B4-Antikörpers und des Emory Children es Pediatric Research Center Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ein Uniform Shear Assay für menschliche Platelets und Zelloberflächen per Cone-plate Viscometry
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Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

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