Summary
Descriviamo un metodo in-Solution per applicare un taglio uniforme ai recettori della superficie piastrinica utilizzando la viscometria a piastra conica. Questo metodo può anche essere utilizzato in modo più ampio per applicare il taglio ad altri tipi di cellule e frammenti di cellule e non è necessario indirizzare una coppia specifica del recettore ligare.
Abstract
Molte cellule/tessuti biologici percepiscono le proprietà meccaniche dei loro ambienti locali tramite meccanorecettori, proteine che possono rispondere alle forze come la pressione o le perturbazioni meccaniche. I meccanorecettori rilevano i loro stimoli e trasmettono segnali attraverso una grande varietà di meccanismi. Alcuni dei ruoli più comuni per i meccanorecettori sono nelle risposte neuronali, come il tatto e il dolore, o le cellule dei capelli che funzionano in equilibrio e udito. La meccanosensazione è anche importante per i tipi di cellule che sono regolarmente esposti a stress da taglio come le cellule endoteliali, che linea vasi sanguigni, o cellule del sangue che sperimentano il taglio in circolazione normale. I viscosimetri sono dispositivi che rilevano la viscosità dei fluidi. I viscosimetri rotazionali possono essere utilizzati anche per applicare una forza di taglio nota ai fluidi. La capacità di questi strumenti di introdurre un taglio uniforme ai fluidi è stata sfruttata per studiare molti fluidi biologici, tra cui sangue e plasma. La viscometria può anche essere utilizzata per applicare il taglio alle cellule in una soluzione e per testare gli effetti del taglio su specifiche coppie del recettore del Ligano. Qui, usiamo la viscometria cono-piastra per testare gli effetti dei livelli endogeni di stress da taglio sulle piastrine trattate con anticorpi contro il complesso recettore meccanosensoriale piastrinica GPIb-IX.
Introduction
I meccanorecettori sono proteine che rispondono agli stimoli meccanici, come la pressione o la perturbazione meccanica/deformazione. Per alcuni meccanorecettori, il rilevamento di queste perturbazioni meccaniche è esplicito alla funzione dei tipi di cellule in cui sono espressi. Prendete, per esempio, i recettori elasticizzati nei neuroni barorecettori; questi canali ionici meccanosensibili regolano la pressione sanguigna rilevando il "tratto" vascolare1,2. Nell'orecchio interno, i canali ionici sulle cellule dei capelli rilevano deformazioni meccaniche causate da onde sonore3e i meccanorecettori a soglia bassa cutanea (ltmrs) facilitano la trasmissione delle informazioni tattili4. In altri casi, i meccanorecettori forniscono informazioni importanti alla cellula per la creazione di adesione o crescita. Le cellule possono percepire la rigidità del loro ambiente locale e possono contare su forze contrattili tramite il citoscheletro e le integrine actina per dettare la crescita o la diffusione di5,6.
Studiando le interazioni recettore-ligando in modelli cellulari o basati su tessuti, esistono saggi comuni che possono segnalare in modo rapido e accurato gli effetti dell'alterazione della temperatura, del pH, della concentrazione di ligando, della tonicità, del potenziale di membrana e di molti altri parametri che possono variare in vivo. Tuttavia, questi stessi saggi possono cadere in breve quando si tratta di rilevare il contributo della forza meccanica all'attivazione del recettore. Se le cellule stanno rilevando il loro microambiente, rilevando onde sonore o rispondendo a stiramento, una cosa che i suddetti meccanorecettori hanno in comune è che partecipano a interazioni in cui il ligando, recettore, o entrambi, sono ancorati a un superficie. I saggi sviluppati per testare gli effetti delle forze meccaniche sulle interazioni dei recettori spesso riflettono questo paradigma. Microfluidica e camere di flusso sono utilizzati per studiare gli effetti del flusso di taglio su cellule e recettori7,8. Questi tipi di esperimenti hanno il vantaggio di consentire la messa a punto dei tassi di taglio tramite velocità di flusso consolidate. Altre tecniche impiegano sonde molecolari fluorescenti per rilevare le forze applicate dalle cellule su superfici ricche di ligando, ottenendo una lettura accurata della grandezza e degli orientamenti delle forze coinvolte nell'interazione9,10.
Oltre alla meccanosensazione che si verifica quando uno o entrambi i partner sono ancorati ad una superficie, lo stress da taglio può influenzare le proteine e le cellule in soluzione. Questo è spesso osservato nelle cellule del sangue/proteine che sono costantemente in circolazione, e può manifestarsi tramite l'attivazione di meccanorecettori che sono normalmente ancorati in superficie11, o attraverso l'esposizione di sequenze bersaglio che sarebbero occlusi sotto condizioni statiche12. Tuttavia, relativamente meno tecniche di saggio gli effetti della forza di taglio sulle particelle in soluzione. Alcuni approcci in-Solution introducono il taglio attraverso le cellule Vortex in sospensione fluida con velocità e durate variabili, anche se questi approcci potrebbero non consentire una determinazione molto precisa della sollecitazione di taglio generata. I viscosimetri rotazionali misurano la viscosità applicando una forza di taglio specifica ai fluidi. Qui descriviamo un metodo applicato per determinare l'effetto di specifiche velocità di taglio laminare su cellule o frammenti di cellule in soluzione.
Una delle proteine più altamente espresse sulla superficie piastrinica è il complesso di glicoproteina (GP) IB-IX. GPIb-IX è il recettore primario per la proteina plasmatica von Willebrand Factor (VWF). Insieme, questa coppia recettore-ligante è stata a lungo riconosciuta come il fondamento della risposta piastrinica alla sollecitazione di taglio13. In caso di danno vascolare, il VWF si lega al collagene esposto nella matrice sub-endoteliale14, reclutando così le piastrine nel sito di lesione tramite l'interazione VWF-GPIb-IX. Il coinvolgimento del VWF nel suo sito di legame nella subunità GPIbα se GPIb-IX sotto stress di taglio fisiologico induce lo svolgimento di un dominio meccanosensoriale prossimale (MSD) a membrana, che a sua volta attiva GPIb-IX15. In uno studio recente, abbiamo dimostrato che gli anticorpi contro il GPIbα, come quelli generati in molti pazienti affetti da trombocitopenia immunitaria (ITP), sono anche in grado di indurre la segnalazione piastrinica tramite MSD che si sta svolgendo sotto sforzo di taglio11. Tuttavia, a differenza di VWF, che facilita l'attivazione di GPIb-IX indotta da taglio immobilizzando il complesso in normali condizioni di circolazione, gli anticorpi bivalenti sono in grado di Crosslink piastrine tramite GPIb-IX e dispiegano la MSD in circolazione. In questo modo, un meccanorecettore che viene normalmente attivato dall'immobilizzazione superficiale sotto il taglio può essere attivato in soluzione. Nella presente relazione, dimostreremo come è stato sfruttato un saggio di taglio uniforme basato su un viscosimetro per rilevare gli effetti di specifici livelli di stress da taglio sull'attivazione del recettore in soluzione.
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Protocol
Tutti i metodi che utilizzano le piastrine umane derivate dal donatore qui descritte sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della Emory University/Children ' s Healthcare di Atlanta.
1. prelievo di sangue e isolamento piastrinico
- Attirare il sangue umano dal consenso dei donatori adulti sani attraverso la venipuntura il giorno dell'esperimento in 3,8% citrato trisodico. Un 4,5 mL di tubo di sangue è sufficiente a produrre abbastanza plasma ricco di piastrine (PRP) per 20-25 condizioni in donatori la cui conta piastrinica è vicina a 250 x 103 per μl.
Nota: evitare di trafilare il sangue tramite aghi a scartamento ridotto (inferiori a 21 G). - Preparare PRP tramite centrifugazione a 22 ° c e 140 x g per 12 min con un freno lungo. Questo si tradurrà in due strati distinti, con globuli rossi nella parte inferiore e la luce di colore PRP in alto.
- Isolare lo strato superiore, nuvoloso e giallo del PRP tramite un accurato pipettaggio attraverso una punta della pipetta tagliata ad un angolo di 45 ° e ottenere la conta piastrinica attraverso un conteggio ematico completo (CBC).
- Se necessario, lavare le piastrine in soluzione salina tamponata a tubi (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) in presenza di prostaglandina E1 (PGE1) e risospendere nel buffer di Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM MgCl2,5mm glucosio, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) con glucosio 5 mm, altrimenti, procedere al passo 1,5. I seguenti passaggi descrivono il lavaggio in breve.
- Regolare il volume PRP a 10 mL con soluzione salina tamponata a tubo e aggiungere 0,6 μM PGE1.
- Centrifugare per 8 min a 1.900 x g, poi scartare surnatante e lasciare che il pellet piastrinico si sieda in 400 μl di soluzione di Tyrode e glucosio per 5 min.
- Risospendere delicatamente il pellet piastrinico e tenerlo indisturbato per 30 min.
- Regolare la conta piastrinica a ~ 250 x 103 piastrine per μl con plasma umano in pool (PPP) povero di piastrine e mantenere la sospensione a 22 ° c indisturbata o sotto rotazione delicata.
2. legatura e trattamento di taglio uniforme
Nota: tutte le fasi della sezione 2 che richiedono il pipettaggio devono essere eseguite lentamente, in modo da non introdurre alcun taglio.
- Aggiungete l'anticorpo o il ligando desiderati al PRP o alle piastrine lavate e mescolate delicatamente con il pipettaggio su e giù o mescolandosi con una punta della pipetta. Lasciarlo indisturbato a temperatura ambiente per 5-10 min. aggiungere un volume equivalente di PPP o buffer di Tyrode a un controllo negativo.
- Accendere il viscosimetro della piastra conica, impostare la temperatura della piastra a 22 ° c e lasciare che il piatto raggiunga questa temperatura.
- Pipettare il PRP trattato o le piastrine lavate sul viscosimetro a piastra conica a temperatura controllata direttamente al centro della piastra. Assicurarsi che tutto il campione sia depositato tra il cono e la piastra nel punto di contatto e non all'esterno del cerchio del cono.
- Taglio ad una velocità e durata appropriate.
- Calcolare il taglio come indicato dal manuale del viscosimetro, o come mostrato in precedenza15,16.
- Determinare la velocità di taglio da viscosità e sollecitazione di taglio desiderata tramite la legge di Newton di viscosità;
; la viscosità plasmatica è 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Ad esempio, un intervallo di taglio normale per la circolazione umana è 5-30 dyn/cm2 e il taglio deve essere applicato sulla scala temporale a singola cifra.
- Sollevare il cono dalla leggermente piastra (~ 2 mm) in modo che il campione rimanga a contatto sia con la piastra e cono, e utilizzare un gel-caricamento o altra punta di pipetta lunga per raccogliere 5-10 μl dal centro del volume del campione.
- Incubare i campioni tagliati con i marcatori desiderati per 20 minuti a temperatura ambiente. Per i marcatori di fosfatidilserina, β-galattosio, e P-selectin esposizione uso Lattaderin C2 dominio (LactC2) a 0,08 μM18, Erythrina cristagalli lectina (ECL) a 6,25 μg/ml, e anti-p-selectin anticorpo (20 μg/ml), rispettivamente.
- Fissare i campioni in 2% paraformaldeide per 20 minuti a RT prima della diluizione o della conservazione a freddo, e procedere al passo 3,1 o conservare i campioni a 4 ° c per non più di 12 h.
; la viscosità plasmatica è 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Ad esempio, un intervallo di taglio normale per la circolazione umana è 5-30 dyn/cm2 e il taglio deve essere applicato sulla scala temporale a singola cifra.3. rilevamento di marcatori di superficie e reticolazione tramite citometria a flusso
- Analizzare il campione tramite citometria a flusso, raccogliendo almeno 20.000 eventi per ogni condizione.
- Quantitare la potenza del segnale dei marcatori fluorescenti utilizzando il valore di altezza per l'intensità di ogni fluoroforo, o l'intensità di fluorescenza media geometrica (MFI).
- Se si mira a rilevare il reticolazione piastrinica dopo il trattamento di taglio, analizzare il campione su un citometro a flusso capace di imaging e quantificare il reticolato per parametri di area e proporzioni.
- Tracciare un istogramma di area e/o proporzioni.
- Utilizzare un controllo negativo con albumina sierica bovina (BSA) o veicolo per disegnare un cancello escludendo gli eventi più completamente circolari (questo cancello è di solito disegnato ad un rapporto di aspetto ~ 0,819,20) e quantitare la percentuale di eventi all'interno di questo cancello. Gli eventi con proporzioni più basse hanno maggiori probabilità di essere reticolati.
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Representative Results
La Figura 1 illustra come il modello di trigger dell'attivazione di GPIb-IX, inizialmente introdotto per spiegare l'attivazione del recettore dipendente dal taglio quando ancorato alla parete del vaso, può anche supportare l'attivazione di piastrine incrociate da un ligando multivalente. La Figura 2 Mostra letture dell'attivazione piastrinica umana trattate da due anticorpi che si rivolgono al dominio N-terminale di GPIB-IX (6B4 e 11A8) e un anticorpo di controllo (IgG normale) in condizioni di taglio e statica. Nella Figura 3, le piastrine sono state trattate con 6B4 e un anticorpo con una forza non vincolante troppo bassa per innescare l'attivazione di GPIb-IX, AK2. Figura 4 Mostra un corso temporale. Marcatori di attivazione piastrinica sono stati sondati e rilevati a punti temporali progressivi durante il trattamento di taglio con 11A8 o AK2. In Figura 5a, l'anticorpo reticolazione perline piastrine decorate con il dominio N-terminale di GPIB-IX è stato analizzati tramite citometria a flusso convenzionale. Figura 5 b Mostra il reticolazione delle piastrine mediata da 6B4, con la citometria a flusso di imaging. Nella Figura 6, sono stati utilizzati campioni clinici di siero di pazienti con trombocitopenia immunitaria al posto degli anticorpi monoclonali divalenti contro GPIb-IX utilizzati in figure precedenti. Gli anticorpi contenenti plasma del paziente contro GPIb-IX hanno innescato risposte dipendenti dal taglio, in contrasto con il plasma di pazienti affetti da ITP senza anticorpi che si rivolgono a GPIb-IX.
Figura 1 : Il meccanorecettore della superficie piastrinica GPIb-IX può legare un Ligato divalente solubile (come un anticorpo). Quando due complessi GPIb-IX su piastrine contrapposte si legano allo stesso ligando divalente, si verifica il reticolazione. Sotto taglio fisiologico, le piastrine reticolate possono generare una forza di trazione per agire su GPIb-IX e dispiegare il MSD in esso. Come conseguenza del MSD che si sta svolgendo, GPIb-IX è attivato e induce la segnalazione piastrinica e la clearance piastrinica a valle, come illustrato. La figura è stata adattata da Quach et al.21per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Espressione di marcatori di attivazione piastrinica in PRP umano trattati con anticorpi di controllo IgG o anti-GPIb-IX 11A8 e 6B4 in condizioni statiche o Cesate (30 dyn/cm2). In questi risultati rappresentativi, l'esposizione superficiale piastrinica della fosfatidilserina (PS), β-galattosio e P-selectina sono state sondate da proteina fluorescente verde (GFP)-LACT-C2 coniugata, FITC-coniugato Erythrina cristagalli lectina (ECL) e APC-coniugato anticorpi anti-P-selectin, rispettivamente. La fluorescenza è stata rilevata tramite citometria a flusso. I dati sono espressi in percentuale di eventi con fluorescenza al di sopra del controllo negativo. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; valore determinato tramite t-test dello studente. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : PRP umano trattati con due anticorpi anti-GPIb-IX. PRP umano trattato con due anticorpi anti-GPIb-IX, uno con elevata forza non vincolante (6B4) e uno con bassa forza non vincolante (AK2) in condizioni statiche (0 dyn/cm2), a basso taglio (5 dyn/cm2) e ad alto taglio (30 dyn/cm2). I grafici mostrano la percentuale di eventi positivi per l'espressione superficiale di β-galattosio, PS e P-selectin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. La significatività è stata determinata tramite una ANOVA unidirezionale con Tukey test. Le barre di errore rappresentano SD. la figura è stata adattata da Quach et al.11per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4 : Tempo di esposizione al taglio (20 dyn/cm2) per il PRP umano trattato con IgG di controllo, 11a8 o AK2. L'esposizione superficiale piastrinica di PS e P-selectin è stata rilevata tramite citometria a flusso per campioni tranciati per 0, 0,5, 1, 3 e 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001. La significatività è stata determinata tramite una ANOVA unidirezionale con Tukey test. Barre di errore rappresentano SD. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Quantitating reticolazione per parametri di area e proporzioni. (a) le perle di dimensione piastrinica (4 μm) sono state coniugate con il dominio N-terminale di gpibα e incubati con IgG (grigio), AK2 (rosso) o 6B4 (blu) sotto Tosato (20 dyn/cm2). Qui sono mostrati i grafici di contorno della dispersione in avanti (FSC-A) rispetto alla fluorescenza anticorpale anti-topo. b) istogramma per il rapporto di aspetto delle piastrine in PRP incubato con 6B4 e anticorpi anti-CD41 (un marcatore piastrinico) etichettati in modo fluorescente sotto taglio. Vengono mostrate le immagini rappresentative a vari rapporti di aspetto. La figura è stata adattata da Quach et al.11per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6 : Sono stati utilizzati campioni clinici di siero da pazienti con trombocitopenia immunitaria al posto degli anticorpi monoclonali divalenti contro GPIb-IX. a) capacità di legame del plasma di GPIB-IX da pazienti affetti da ITP, analizzati mediante saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA). b) piastrine umane lavate ricostituite in ITP plasma paziente in condizioni statiche e Cesate (30 dyn/cm2). I grafici mostrano la percentuale di eventi positivi per l'espressione superficiale di P-selectin o PS. * * * * P ≤ 0,0001. La significatività è stata determinata tramite ANOVA unidirezionale con Tukey test. Le barre di errore rappresentano SD. la figura è stata adattata da Quach et al.11per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto consente una valutazione rapida e versatile dell'effetto della cesoia laminare sui recettori della superficie piastrinica e cellulare. I risultati rappresentativi specifici presentati qui sottolineano come gli effetti dei ligandi multimerica o bivalenti possono essere influenzati dal flusso di taglio. Oltre a questa applicazione, un saggio di taglio uniforme ha ampie applicazioni nell'osservare gli effetti di taglio-dipendente. In assenza di una coppia di recettori ligando conosciuti, un saggio di taglio uniforme può anche rilevare gli effetti del taglio su fattori quali la forma e la segnalazione delle cellule, soprattutto se accoppiato con analisi citometria di flusso. Accennato in parte dalla Figura 5b, un saggio di taglio uniforme si presta a una vasta gamma di metodi di rilevazione diversi da o in complemento alle analisi citometria a flusso standard delineate in questo protocollo, tra cui Imaging, biochimica, e cellule-based Saggi.
La Figura 2 esemplidi l'applicazione di base del saggio, in particolare per distinguere tra un'interazione tra il recettore del ligando e un controllo negativo. 6B4, un anticorpo che è in grado di reticolare le piastrine attraverso il legame ai recettori GPIb-IX e sostenere una forza sufficiente per attivare il recettore11, attiva le piastrine quando esposte al taglio (raffigurata nel modello in Figura 1), a differenza della controllare le IgG che non legano il GPIb-IX piastrinico. Questa applicazione fornisce simultaneamente la prova che l'effetto è specifico per la coppia recettore-ligante scelto e dipende dal taglio. Il saggio di taglio uniforme può anche distinguere tra gli effetti dei ligandi che possono e non possono sostenere i loro legami con un recettore sotto specifici livelli di taglio. In Figura 3, vediamo una mancanza di lettura di segnalazione dall'anticorpo anti-GPIb-IX AK2, che lega il suo epitopo con una forza non vincolante11particolarmente debole. Questa cifra dimostra anche gli effetti di variare il livello di sollecitazione di taglio applicato dal viscosimetro a cono-piastra da un basso ad alto taglio.
La Figura 4 dimostra che questo saggio può essere utilizzato per modulare la lunghezza dell'esposizione al taglio e suggerisce una strategia per la visualizzazione di questi dati. Nella Figura 5vengono utilizzate due letture alternative basate sulla citometria a flusso per il saggio, che non si basano su marcatori fluorescenti di attivazione del recettore, ma possono invece essere utilizzate per descrivere il reticolazione e il cambiamento di dimensione/forma. Figura 5 b Mostra come la dispersione in avanti, che aumenta proporzionalmente alle dimensioni di un evento, può distinguere tra distinte popolazioni di eventi reticolati (Singlet), doppietto, terzina o superiore. Come nella Figura 5b, il dosaggio può essere applicato a perle coniugate ad un recettore di interesse, che elimina la possibilità di altri recettori che partecipano agli eventi di reticolazione osservati attraverso altri metodi. In Figura 6, plasma, un fluido biologico contenente potenziali ligandi per il nostro recettore di interesse è utilizzato al posto di anticorpi monoclonali purificati. Ciò illustra un'applicazione in cui potrebbe non essere necessario uno specifico legante o partner vincolante per un recettore di interesse.
Anche se il saggio è abbastanza accessibile come scritto, ci sono alcuni passaggi chiave che devono essere eseguiti con cura. Soprattutto tra questi è quello di stare attenti a non introdurre il taglio da fonti esterne diverse dal vero e proprio trattamento di taglio stesso. Quando si disegna il sangue, come accennato nel passaggio 1,1 di questo protocollo, è importante disegnarlo attraverso aghi calibro appropriati. Per la raccolta di sangue umano tramite venipuntura da donatori adulti Consenti, questo può essere realizzato con un set di raccolta del sangue di 21 G (elencato nella tabella dei materiali). Una volta che il sangue viene disegnato e il PRP è isolato, può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 h sul banco o su un girarrosto lento.
Se la centrifuga utilizzata per isolare il PRP può frenare a velocità diverse, è meglio scegliere un freno lento in modo da minimizzare il disturbo dello strato PRP e l'applicazione della forza inutile. Una volta che PRP è isolato o il tipo di cellula di interesse è in sospensione fluida, evitare di pipettare le miscele troppo rapidamente. Invece, aspirare ed espellere campioni in modo lento e costante soprattutto durante il passaggio 2,5, dove il campione viene disegnato attraverso una punta di pipetta particolarmente stretta. Per i volumi di campionamento che possono essere accuratamente pipettati tramite puntali per pipette di diverse dimensioni, è consigliabile utilizzare il più grande tra di loro. Per campioni particolarmente sensibili o viscosi, l'estremità della punta della pipetta può essere tagliata con un angolo per allargare l'apertura attraverso la quale deve essere disegnato il campione.
Molti saggi che testano l'effetto del taglio sulla meccanosensazione cellulare si basano su un'interazione tra un Ligano ancorato e il suo recettore. Microfluidica e camere di flusso sono un esempio, in cui l'interazione tra un Ligano ancorato e un recettore, di solito su una cellula in soluzione, può essere osservata in tempo reale7,8. Altre tecniche utilizzano la microscopia per rilevare gli eventi che si verificano all'interfaccia tra uno strato cellulare e il substrato sottostante o la sonda9. Queste tecniche sono state utilizzate per un effetto particolarmente grande nello studio delle cellule del sangue in circolazione. D'altra parte, le tecniche che consentono l'interrogatorio di eventi che si verificano interamente in soluzione sotto flusso sono più limitate. Per l'applicazione generica della forza in soluzione, Vortex un campione può servire come un metodo "veloce e sporco". Tuttavia, è difficile determinare la forza precisa applicata, e il taglio non è certo di conseguenza dal flusso laminare. Questo è uno dei vantaggi del saggio di taglio uniforme. Dall'altro lato, lo svantaggio primario del saggio di taglio uniforme è un divario temporale tra il taglio dell'applicazione e l'osservazione delle cellule stesse. Il taglio viene applicato, quindi le celle sono macchiate e fisse, ma le tecniche di imaging non possono osservare le cellule durante il processo di taglio stesso. Un adattamento di questo metodo comporterebbe l'aggiunta delle celle direttamente ai marcatori desiderati e la tosatura con i marcatori presenti. Ciò consentirebbe l'individuazione immediata di eventuali effetti transitori.
Finora abbiamo applicato questo saggio per rilevare l'effetto in-soluzione dipendente dal taglio degli anticorpi che si rivolgono al complesso GPIb-IX. Mentre gli anticorpi forniscono un partner vincolante, semplice e divalente, è logico supporre che il reticolazione dei meccanorecettori sulle cellule avversarie in circolazione possa essere realizzato attraverso una miriade di ligandi multivalenti con un livello di slegamento sufficientemente elevato Forze. Questa tecnica può essere utile in futuro nel rilevare gli effetti specifici di tali ligandi. Inoltre, il saggio di taglio uniforme può essere utilizzato in combinazione con tecniche di imaging non descritte nel presente documento, come la microscopia a fluorescenza standard. In definitiva, il saggio di taglio uniforme fornisce un metodo ragionevolmente economico, quantitativo e specifico per l'applicazione di taglio laminare alle cellule e frammenti di cellule in soluzione, e può essere utilizzato a Monte di molti metodi di rilevamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I lavori pertinenti a questo studio sono stati sostenuti in parte dagli istituti nazionali di sanità (NIH) National Heart, Lung e Blood Institute, che concede HL082808, HL123984 (R.L.) e F31HL134241 (M.E.Q.). Finanziamento fornito anche da NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); e i fondi di sovvenzione pilota da Children ' s Healthcare di Atlanta e Emory University Pediatric Flow citometria nucleo. Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Hans Deckmyn per aver condiviso l'anticorpo 6B4, e il nucleo di citometria a flusso del centro di ricerca pediatrica Emory Children ' s per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | - | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
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