Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.

Abstract

많은 생물학 세포/조직은 기계 수용 체를 통해 그들의 현지 환경의 기계적인 속성을, 압력 또는 기계적인 섭 동 같은 힘에 반응할 수 있는 단백질을 감지 합니다. 기계 수용 체는 자극을 감지 하 고 다양 한 메커니즘을 통해 신호를 전송 합니다. 기계 수용 체에 대 한 가장 일반적인 역할 중 일부는 신경 반응에, 터치와 통증 같은, 또는 균형 및 청각에서 기능 하는 머리 세포. 기계 감각은 또한 정기적으로 혈관 내 피 세포와 같은 전단 응력에 노출 되는 세포 종류에 대 한 중요 한, 어떤 라인 혈액 혈관, 또는 정상적인 순환에 전단을 경험 하는 혈액 세포. 점도 계는 유체의 점도를 감지 하는 장치입니다. 회전 점도 계는 또한 유체에 공지 된 전단 력을 적용 하기 위해 사용 될 수 있다. 유체에 균일 한 전단을 소개 하는이 계기의 능력은 혈액과 플라스마를 포함 하 여 많은 생물학 액체를 연구 하기 위하여 착취 되었습니다. 점도는 또한 용액 내의 세포에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍에 전단의 영향을 시험 하기 위해 사용 될 수 있다. 여기에서, 우리는 콘 플레이트 점도 혈소판 기계 감각 수용 체 복잡 한 GPIb에 대하여 항 체로 처리 한 혈소판에 전단 응력의 내 인 성 수준의 효력을 시험 하기 위하여 이용 합니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

기계 수용 체는 압력 또는 기계적인 섭 동/변형과 같은 기계적인 자극에 반응 하는 단백질입니다. 일부 기계 수용 체의 경우, 이러한 기계적 섭 동을 감지 하는 것은 그들이 발현 되는 세포 유형의 기능에 명시 적 이다. 복용, 예를 들어, baroreceptor 뉴런의 스트레칭 수용 체; 이러한 기계 과민 이온 채널은 혈관 "스트레칭"1,2를 감지 하 여 혈압을 조절 합니다. 내이에서 머리카락 세포의 이온 채널은 음파3으로 인 한 기계적 변형을 감지 하 고 피부 낮은 임계 기계 수용 체 (ltmrs)는 촉각 정보4의 전달을 용이 하 게 합니다. 다른 경우에, 기계 수용 체는 접착 또는 성장의 설치를 위해 세포에 중요 한 정보를 제공 합니다. 세포는 그들의 국부 환경의 강성을 감지할 수 있고, 성장 또는5확산을 지시 하는 액 틴 세포 골격 및 인 테 그린을 통해 수축 힘에 의존할 수 있다.

세포 또는 조직 기반 모델에서 수용 체-리간드 상호 작용을 연구 할 때, 온도, pH, 리간드 농도, 음조, 막 전위 및 기타 여러 매개 변수를 변경 하는 효과를 신속 하 고 정확 하 게 보고할 수 있는 일반적인 분석 법이 존재 합니다. 생체 내에서 다를 수 있습니다. 그러나,이 같은 분석은 수용 체 활성화에 기계적인 힘의 기여를 검출 하는 관해서 짧은 떨어질 수 있습니다. 세포가 그들의 미세 환경을 감지 하 고, 음파를 감지 하거나, 스트레칭에 반응 하 든, 앞서 언급 한 기계 수 용기가 공통적으로가지고 있는 것은 리간드, 수용 체 또는 둘 모두가 상호 작용에 참여 한다는 것입니다. 표면. 수용 체 상호 작용에 기계적인 힘의 효력을 시험 하기 위하여 개발 된 분석은 수시로이 패러다임을 반영 합니다. 미세 유체 및 유량 챔버는 세포 및 수용 체7,8에 대 한 전단 흐름의 효과를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이러한 유형의 실험은 확립 된 흐름 속도를 통해 전단 속도를 미세 조정할 수 있는 이점이 있습니다. 다른 기술은 형광 분자 프로브를 사용 하 여 리간드가 풍부한 표면에 세포가가 해지는 힘을 감지 하 고 상호 작용9,10에 관련 된 힘의 크기와 방향을 정확 하 게 판독 합니다.

하나 또는 두 파트너가 표면에 고정 되는 경우 발생 하는 기계 감각 외에도 전단 응력은 용액의 단백질과 세포에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 수시로 순환에서 지속적으로 혈액 세포/단백질에서 관찰 되 고, 일반적으로 표면 앵커 링 되는 기계 수용 체의 활성화를 통해 나타날 수 있다11, 또는 아래 폐색 되는 대상 시퀀스의 노출을 통해 정적 조건12. 그러나 상대적으로 적은 기법은 용액 내 입자에 대 한 전단 력의 영향을 분석 합니다. 일부 인-솔루션 접근법은 다양 한 속도와 기간으로 유체 현 탁 액의 볼 텍 싱 세포를 통해 전단을 도입 하지만, 이러한 접근법은 생성 된 전단 응력의 매우 정밀한 결정을 허용 하지 않을 수 있다. 회전 점도 계 유체에 특정 전단 력을 적용 하 여 점도를 측정 합니다. 본 명세서에서는 용액 중의 세포 또는 세포 단편에 대 한 특정 층 류 전단 율의 효과를 결정 하기 위한 적용 방법을 설명 한다.

혈소판 표면에 가장 높게 발현 된 단백질 중 하나는 당단백질 (GP) Ib-IX 복합체 이다. GPIb-IX는 본 플라즈마 단백질에 대 한 1 차 수용 체 폰 빌 레 브란트 팩터 (VWF) 이다. 함께,이 수용 체-리간드 쌍은 전단 응력 (13)에 대 한 혈소판 반응의 기초로 서 오랫동안 인식 되 고 있다. 혈관 손상이 발생 하는 경우, VWF는 부 내 피 매트릭스14의 노출 된 콜라겐에 결합 하 여 Vwf-GPIB-IX 상호작용을 통해 부상 부위를 혈소판으로 모집 합니다. VWF는 GPIbα 서브 유닛에서의 결합 부 위에 참여 하 여 생리 적 전단 응력 하에서 GPIb-IX는 멤브레인 근 위부 (MSD) 도메인의 전개를 유도 하 고이는 GPIb-IX15를 차례로 활성화 시킨다. 최근의 연구에서, 우리는 많은 면역 혈소판 감소 증 (ITP) 환자에서 생성 된 것과 같은 GPIbα에 대 한 항 체가 또한 전단 응력11하에서 MSD를 통해 서 발생 하는 혈소판 신호를 유도할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나 일반적인 순환 하에서 복합체를 고 정화 함으로써 전단 유도 된 GPIb-IX 활성화를 용이 하 게 하는 VWF와는 달리,이가 항 체는 GPIb-IX를 통해 혈소판을 가교 결합 하 고, 순환 하 여 MSD를 펼칠 수 있습니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 전단 하에서 표면 고 정화에 의해 활성화 되는 기계 수용 체는 용액에서 활성화 될 수 있다. 본 보고서에서는 용액에서의 수용 체 활성화에 대 한 특정 수준의 전단 응력의 영향을 검출 하기 위해 점도 계 기반 균일 전단 분석을 활용 하는 방법을 설명 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

본 원에 기재 된 기증자 유래 인간 혈소판을 사용 하는 모든 방법은에 모리 대학교/아 틀 란 타의 어린이 건강 관리 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 혈액 채취 및 혈소판 분리

  1. 실험 당일에에 동의 건강 한 성인 기증자를 통해 인간의 혈액을 그립니다 3.8% 트리 구 연산 나트륨. 혈액의 1 개의 4.5 mL 관은 혈소판이 1 μ l 당 250 x 10에 가까운 기증자에 있는 20-25 조건에 대 한 충분 한 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 산출 하기 위하여 충분 합니다.
    참고: 좁은 게이지 바늘 (21G 보다 작음)을 통해 혈액을 채취 하지 마십시오.
  2. 22 ° c에서의 원심 분리를 통해 PRP를 준비 하 고, 긴 브레이크로 12 분 동안 140 x g . 이것은 두 개의 별개의 층으로 이어질 것입니다, 아래에 적혈구와 상단에 밝은 색깔의 PRP.
  3. 45 ° 각도로 절단 된 피 펫 팁을 통해 신중한 파이 펫 팅을 통해 PRP의 위, 흐린, 노란 층을 분리 하 고 완전 한 혈 수 (CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.
  4. 필요한 경우에는 파이프에서 혈소판을 세척 하 고, 2.9 0.34 134 Tyrode의 프로 스타 글란 딘 E1 (PGE1)과 소생의 존재 하에 완충 식 염 분 (150 mM의 염화 나트륨, 20mm 파이프)에,1mmmgcl 2, 5mm 포도 당,12mm 3, 20 MM 헵 스, pH 7.35) 5 mm 글루코스를 사용 하는 경우, 1.5 단계로 진행 합니다. 다음 단계는 간단한 세척을 설명 합니다.
    1. PRP 볼륨을 10 mL의 파이프 완충 식 염 수로 조정 하 고 0.6 μ m PGE1를 추가 합니다.
    2. 1900 x g에서 8 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버리고 5 분 동안 Tyrode 및 글루코스 용액의 400 μ l에 혈소판 펠 렛을 둡니다.
    3. 혈소판 펠 렛을 부드럽게 소생 시켜 30 분 동안 그대로 유지 합니다.
  5. 혈소판 계수를 풀링 된 인간 혈소판-불 쌍 한 혈장 (PPP)과 함께 μ l 당 10 ~ 250 x 103으로 조절 하 고 방해 받지 않는 또는 완만 한 회전 하에서 22 ° c에서 현 탁 액을 유지 한다.

2. 리간드 및 균일 한 전단 처리

참고: 파이 펫 팅을 필요로 하는 섹션 2의 모든 단계는 어떤 전단도 도입 하지 않도록 천천히 이루어져야 합니다.

  1. PRP 또는 세척 된 혈소판에 원하는 항 체 또는 리간드를 추가 하 고 피 펫 팁으로 위아래로 피 펫 팅 하 여 부드럽게 섞 습니다. 5-10 분 동안 실 온에서 그대로 두십시오. 동등한 양의 PPP 또는 Tyrode의 버퍼를 음수 컨트롤에 추가 합니다.
  2. 콘 플레이트 점도 계의 전원을 켜고, 플레이트 온도를 22 ° c로 설정 하 고, 플레이트가이 온도에 도달 하 게 할 시간을 허용 합니다.
  3. 처리 된 PRP 또는 세척 된 혈소판을 플레이트의 중앙에 직접 온도 조절 된 원추 판 점도 계에 피 펫 한다. 모든 샘플이 콘과 플레이트 사이에 접촉 지점에 침착 되 고 원뿔의 림의 바깥쪽이 아니라는 것을 확인 합니다.
  4. 적절 한 속도와 지속 시간에 전단.
    1. 점도 계 설명서에 표시 된 대로 또는 앞에서15,16으로 표시 된 대로 전단을 계산 합니다.
    2. 뉴턴의 점도 법칙을 통해 점도 및 원하는 전단 응력에서 전단 속도를 결정 합니다. Equation 1; 플라즈마 점도는 1.5 ~ 1.6 센 포 이즈 (cP)17입니다. 예를 들어, 인간의 순환에 대 한 일반적인 전단 범위는 5-30 dyn/cm2 이 고 전단은 단일 자릿수 분 시간 척도에 적용 되어야 합니다.
  5. 샘플이 플레이트와 콘 모두와 접촉 하 게 유지 되도록 플레이트 약간 (~ 2mm)의 콘을 들어올려, 샘플 부피의 중심에서 5-10 μ l를 수집 하기 위해 겔 로딩 또는 다른 긴 피 펫 팁을 사용 한다.
  6. 실 온에서 20 분 동안 원하는 마커로 전단 된 시료를 배양 합니다. 포스 파티 딜 세 린, β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴 (LactC2)을 0.08 μ m에서 C2 도메인에사용 하 고, 6.25 μ g/m l에서, 그리고 안티 피-셀 리 틴 항 체 (20 µ를 각각)에 노출 시켰다.
  7. 희석 또는 냉장 보관 전에 RT에서 20 분 동안 2% 파라 포 름 알 데히드로 샘플을 고정 하 고, 3.1 단계까지 진행 하거나 4°c에서 12 시간 이상 동안 시료를 보관 하십시오.

3. 유 세포 분석을 통한 표면 마커 및 가교의 검출

  1. 유 세포 분석기를 통해 샘플을 분석 하 고 각 조건에 대해 최소 2만 이벤트를 수집 합니다.
  2. 각 형광 물질의 세기에 대 한 높이 값 또는 기하학적 평균 형광 강도 (MFI)를 사용 하는 형광체 마커의 정량 신호 강도.
  3. 전단 처리 후에 혈소판 가교 결합을 검출 하는 것을 목표로 하는 경우, 이미징 가능한 유 세포 계와 수량자로 면적 및 종횡비 매개 변수로 샘플을 분석 합니다.
    1. 면적 및/또는 종횡비의 히스토그램을 플로팅합니다.
    2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 차량이 대부분의 완전 원형 이벤트를 제외 하 고 게이트를 그리는 네거티브 컨트롤을 사용 하 여 (이 게이트는 일반적으로 종횡비 ~ 0.819에서 그려진,20)이 게이트의 내부 이벤트의 비율을 정량화. 종횡비가 낮은 이벤트는 가교 화 될 가능성이 더 높습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

도 1 은 상기 혈관 벽에 앵커 되었을 때 전단 의존적 수용 체 활성화를 설명 하기 위해 처음 도입 된 GPIB-IX 활성화의 트리거 모델을 개략적으로 설명 하 고, 또한 다가 리간드에 의해 가교 된 혈소판의 활성화를 지원할 수 있다. 도 2 는 GPIB-IX (6B4 및 11A8)의 N-말단 도메인을 표적화 하 고 전단 및 정적 조건 하에서 하나의 대조 항 체 (정상 IgG)를 대상으로 하는 2 개의 항 체에 의해 처리 된 인간 혈소판 활성화의 판독을 보여준다. 도 3에서, 혈소판은 6b4 및 비 결합 력이 지나치게 낮은 항 체로 처리 하 여 GPIB-IX 활성화를 AK2. 그림 4 에는 시간 코스가 나와 있습니다. 혈소판 활성화의 마커는 11A8 또는 AK2로 전단 처리 시 진보적인 시점에서 프로브 및 검출 되었다. 도 5, GPIb-IX N-말단 도메인으로 데코 레이트 된 항 체 가교 결합 혈소판 크기 비드가 통상적인 유 세포 분석기를 통해 분석 되었다. 그림 5 b 는 이미징 유 세포 분석을 통해 이미지화 된 혈소판의 6b4 매개 가교 결합을 보여준다. 도 6에서, 면역 혈소판 감소 증을 가진 환자 로부터 혈 청의 임상 샘플은 이전 도면에서 사용 된 GPIB-IX에 대 한 2가의 단일 클론 항 체 대신에 사용 되었다. Gpib-ix에 대항하는 환자 혈장 함유 항 체는 GPIb-IX를 표적으로 하는 항 체가 없는 ITP 환자의 혈장과는 대조적으로 전단 의존적 반응을 촉발 시켰다.

Figure 1
그림 1 : 혈소판 표면 기계 리셉터 GPIb-IX는 가용성 2가 리간드 (예컨대 항 체)를 결합할 수 있다. 반대 혈소판에 두 개의 GPIb-IX 복합체가 동일한 2가 리간드에 결합할 때, 가교 결합이 일어난다. 생리 적 전단 하에서, 가교 된 혈소판은 GPIb-IX에 작용 하 고 그 안에 MSD를 펼쳐 당기는 힘을 생성할 수 있다. MSD의 결과로 서, GPIb-IX는 예시 된 바와 같이 활성화 되 고 혈소판 신호 전달 및 하류 혈소판 클리어런스를 유도 합니다. 그림은 Quach et al에서 적응 되었다.21이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 대조 IgG 또는 안티 GPIb-IX 항 체 11A8 및 6B4를 정적 또는 전단 하에 처리 한 인간 PRP에서 혈소판 활성화 마커의 발현. 이러한 대표적인 결과에 있어서, 포스 파티 딜 세 린 (PS), β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴에의 한 혈소판 표면 노출은 녹색 형광 단백질 (GFP) 공액에 의해 양성자 화 되었고, FITC에 컨 쥬 게이 트 된 리 티 나 크리스 티 리 렌 (ECL) 및 APC 공액 항-P-Selectin 항 체 각각. 형광은 유 세포 분석을 통해 검출 되었다. 데이터는 네거티브 컨트롤 위의 형광 이벤트의 백분율로 표현 된다. p ≤ 0.001, ≤ 0.0001; 학생의 t-검정을 통해 결정 되는 의미. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 인간 PRP는 두 항-GPIb-IX 항 체로 처리. 인간 PRP는 2 개의 안티 GPIb-IX 항 체로 처리 하 고, 하나는 고 결합 력이 높은 (6B4)이 고 하나는 정적 (0dyn/2cm 2),낮은 전단 력 (AK2) 및 고 전단 (30dyn/2cm)의 조건입니다. 그래프는 β-갈 락 토즈, PS 및 P-Selectin의 표면 발현을 위해 양성 된 이벤트의 퍼센트를 보여준다. * p ≤ 0.001 0.05. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 제어 IgG, 11A8 또는 AK2로 처리 된 인간 PRP를 위한 전단 노출 시간 과정 (20dyn/2cm2). PS 및 P-Selectin의 혈소판 표면 노출은 0, 0.5, 1, 3 및 5 분에 대 한 샘플에 대 한 유 세포 분석을 통해 검출 되었다 0.0001 0.001. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 면적 및 종횡비 매개 변수에의 한 양자화 교차. (a) 혈소판 크기 (4 µm) 비드의 N-말단 도메인과 함께 컨 쥬 게이 트 된 GPIbα 및 IgG (20dyn/2cm) 조건 하에서 AK2 (적색) 또는 6b4(청색)로 인큐베이션 하였다. 다음은 전방 산포 (FSC-A) 대 항 항 체 형광에 대 한 등고선 도표입니다. (b) PRP에서 혈소판의 종횡비에 대 한 히스토그램은 6b4 및 형광 표지 된 안티 CD41 (혈소판 마커) 항 체를 전단 하에 인큐베이션 한다. 다양 한 종횡비의 대표 이미지가 표시 됩니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 면역 혈소판 감소 증 환자 로부터 혈 청의 임상 샘플을 GPIb-IX에 대 한 2가의 모노 클로 날 항 체 대신 사용 하였다. (a) itp를 갖는 환자 로부터 혈장의 GPIB-IX 결합 용량은, 효소 결합 면역 흡수 분석 법을 통해 서 (ELISA). (b) 정전기 및 전단 하에 itp 환자 혈장에서 재구성 된 인간 혈소판을 세척 (30 dyn/cm2) 조건. 그래프는 P-Selectin 또는 0.0001 PS의 표면 표현식에 대해 양수 인 이벤트의 백분율을 표시 합니다. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 원고에 설명 된 프로토콜은 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 층 류 전단 효과의 신속 하 고 다양 한 평가를 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 특정 대표적인 결과는 다이 성체 또는이가 리간드의 영향이 전단 흐름에 의해 영향을 받을 수 있는 방법을 강조 한다. 이 응용 분야 외에도 균일 한 전단 분석은 전단 의존적 효과를 관찰 하는 광범위 한 응용 분야를가지고 있습니다. 알려진 리간드-수용 체 쌍의 부재 하에서, 균일 한 전단 분석은 또한 특히 유 세포 분석 분석과 쌍을 이루는 경우 세포 형태 및 신호와 같은 요인에 대 한 전단의 영향을 검출할 수 있습니다. 그림 5b에 의해 부분적으로 언급 되는 균일 한 전단 분석은 이미징, 생화학 및 세포 기반을 포함 하 여이 프로토콜에 설명 된 표준 유 세포 측정 분석을 보완 하는 것 이외의 다양 한 검출 방법에 적합 합니다. 분석.

도 2 는 특히 전단 의존적 리간드-수용 체 상호작용 및 음성 대조 군 사이를 감 별 하는 분석 법의 기본적인 응용을 예증 한다. 6B4는, GPIb-IX 수용 체에 결합을 통해 혈소판을 가교 시키고 수용 체 (11)를 활성화 시키기에 충분 한 힘을 지지 하는 항 체 이며, 달리 ( 도 1에서 모델에 묘사 된) 전단에 노출 될 때 혈소판 활성화 혈소판 GPIb-IX를 결합 하지 않는 제어 IgG. 이 응용 프로그램은 동시에 효과가 선택 된 수용 체-리간드 쌍에 특정 하 고 전단에 의존 한다는 증거를 제공 한다. 균일 한 전단 분석은 또한 특정 전단 수준 하에서 수용 체에 대 한 결합을 유지할 수 있는 리간드의 효과를 구별할 수 있습니다. 도 3에서, 우리는 그의에 피토 프를 특히 약한 결합 력 (11)과 결합 하는 항-GPIb-IX 항 체 AK2 로부터의 시그널링 판독의 결여를 볼 수 있다. 또한이 수치는 원추 판 점도 계에 의해 적용 되는 전단 응력의 수준이 낮은 것에서 높은 전단까지 다양 한 영향을 보여줍니다.

그림 4 는이 분석을 사용 하 여 전단 노출의 길이를 조절 하 고이 데이터를 표시 하는 전략을 제안 한다는 것을 보여줍니다. 도 5에서, 분석을 위한 2 개의 대안적인 유 세포 분석 기반의 리드 아웃이 사용 되며, 둘 다 수용 체 활성화의 형광 마커에 의존 하지 않고 대신에 가교 결합 및 크기/형태 변화를 설명 하기 위해 사용 될 수 있다. 그림 5 b 는 이벤트의 크기에 비례하여 증가 하는 전방 분산을 통해 연결 되지 않은 (일 중), 의심, 삼중 항 또는 더 높은 복합성 가교 이벤트의 고유 인구를 구분할 수 있는 방법을 보여줍니다. 도 5에서와 같이, 분석은 관심 있는 수용 체에 접합 된 비드에 적용 될 수 있으며,이는 다른 방법을 통해 본 가교 결합 사건에 참여 하는 다른 수용 체의 가능성을 제거 한다. 도 6에서, 우리의 관심 수용 체에 대 한 잠재적 리간드를 함유 하는 생물학적 유체는 정제 된 단일 클론 항 체 대신에 사용 된다. 이는 관심 있는 수용 체에 대 한 특정 공지 된 리간드 또는 결합 파트너가 필요 하지 않을 수 있는 응용을 예시 한다.

분석은 기록 된 대로 상당히 접근 가능 하지만, 주의 해 서 수행 해야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 그 중 가장 중요 한 것은 실제 전단 처리 자체 이외의 외부 소스에서 전단을 도입 하지 않도록 주의 하는 것입니다. 혈액을 그릴 때,이 프로토콜의 1.1 단계에서 언급 한 바와 같이, 적절 한 게이지 바늘을 통해 그것을 그리는 것이 중요 하다. 인간 혈액 수집을 통한 성병에 대 한 동의 로부터 성인 기증자에 게이는 21 G의 혈액 채취 세트 ( 재료 표에나열 됨)로 달성할 수 있습니다. 피가 그려지고 PRP가 분리 되 면, 그것은 벤치 또는 느린 로티 서 스에 최대 6 시간 동안 실 온에서 저장할 수 있습니다.

원심 분리기가 다른 속도로 PRP 수 브레이크를 분리 하는 데 사용 되는 경우는 PRP 층의 교란과 불필요 한 힘의 적용을 최소화 하기 위해 느린 브레이크를 선택 하는 것이 가장 좋습니다. PRP가 분리 되거나 관심 있는 세포 유형이 유체 현 탁 액 인 경우, 혼합물을 너무 빨리 피 펫 팅 하지 마십시오. 대신 특히 좁은 피 펫 팁을 통해 샘플이 그려진 2.5 단계에서 느리고 꾸준한 방식으로 샘플을 흡 인 및 추방 합니다. 다양 한 크기의 파이 펫 팁을 통해 정확 하 게 파이프 될 수 있는 샘플 부피의 경우, 그 중에서 가장 큰 것을 사용 하는 것이 좋습니다. 특히 민감하거나 점성이 있는 시료의 경우, 피 펫 팁의 끝 부분을 각도로 절단 하 여 시료를 그릴 수 있는 개 구 부를 넓힐 수 있습니다.

세포질 기계 감각에 전단의 효과 테스트 많은 분석은 앵커 리간드와 수용 체 사이의 상호 작용에 의존. 마이크로 유체 및 유동 챔버는 하나의 예를 들면, 앵커 된 리간드와 수용 체 사이의 상호작용이 일반적으로 용액의 세포에 있는 경우, 실시간으로 관찰 될 수 있다7,8. 다른 기술은 현미경 검사 법을 사용 하 여 세포 층과 기초 기판 또는 프로브9사이의 계면에서 발생 하는 사건을 검출 한다. 이러한 기술은 혈액 세포를 순환 연구에 특히 큰 영향을 사용 되었습니다. 반면에, 흐름에 따라 솔루션에서 완전히 발생 하는 이벤트의 심문을 허용 하는 기술은 더 제한적입니다. 솔루션에서 힘의 일반적인 응용 프로그램에 대 한, 볼 텍 싱 샘플은 "신속 하 고 더러운" 방법으로 작용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 힘이가 해지는 것을 결정 하는 것은 어려우며, 전단은 층 류로 인해 발생 하는 것이 확실 하지 않다. 이것은 균일 한 전단 분석의 장점 중 하나입니다. 반면에, 균일 한 전단 분석의 주된 단점은 애플리케이션 전단과 세포 자체 관찰 사이의 시간 갭 이다. 전단이 적용 되 면 세포가 염색 되 고 고정 되지만 이미징 기술은 전단 공정 자체에서 세포를 관찰할 수 없습니다. 이 방법의 한 가지 적응은 마커가 존재 하는 원하는 마커와 전단에 직접 셀을 추가 하는 것을 포함 한다. 이렇게 하면 일시적인 효과를 즉시 감지할 수 있습니다.

지금까지 우리는 GPIb-IX 복합물을 표적으로 하는 항 체의 전단 의존적 인 용액 효과를 검출 하기 위하여이 분석 법을 적용 했습니다. 항 체가 편리 하 고 단순한 2가 결합 파트너를 제공 하는 반면, 순환 중에 대립 세포에 대 한 기계 수용 체의 가교 결합이 충분히 높은 결합 해제를 가진 무수 한 다가 리간드를 통해 이루어질 수 있다고 가정 하는 것이 논리적입니다 세력. 이러한 기술은 미래에 이러한 리간드의 특이 적 효과를 검출 하는데 유용할 수 있다. 추가적으로, 균일 한 전단 분석은 표준 형광 현미경과 같은 본 원에 기술 되지 않은 이미징 기술과 함께 사용 될 수 있다. 궁극적으로, 균일 한 전단 분석은 용액에서 세포 및 세포 단편에 층 류 전단을 적용 하기 위한 합리적으로 저렴 하 고 정량적 이며 구체적인 방법을 제공 하며, 많은 검출 방법의 업스트림을 사용할 수 있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구에 관련 된 작업은 국가 보건 연구소 (NIH) 국립 심장, 폐 및 혈액 학회 보조금 HL082808, HL123984 (R.L.) 및 F31HL134241 (M.E.Q.)에 의해 부분적으로 지원 되었습니다. 자금 조달은 또한 NIH 국립 연구소 일반 의료 과학 교부 금 T32GM008367 (M.E.Q.)에 의해 제공; 애 틀 란 타 및에 모리 대학교 소아과 유 세포 분석 코어의 아동 건강 관리에서 파일럿 보조금을 지급 합니다. 저자는 6B4 항 체를 공유 하는 Dr. Hans Deckmyn과 기술 지원을 위한 Emory 아 이들의 소아과 연구 센터 유 세포 분석 코어를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter