Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Describimos un método en solución para aplicar una cizalla uniforme a los receptores de superficie plaquetaria usando viscometry de placa cónica. Este método también se puede utilizar más ampliamente para aplicar cizallamiento a otros tipos de células y fragmentos de células y no necesita apuntar a un par de ligando-receptor específico.

Abstract

Muchas células/tejidos biológicos detectan las propiedades mecánicas de sus ambientes locales a través de mecánicos, proteínas que pueden responder a fuerzas como la presión o perturbaciones mecánicas. Los mecánicos detectan sus estímulos y transmiten señales a través de una gran diversidad de mecanismos. Algunas de las funciones más comunes para los mecánicos son las respuestas neuronales, como el tacto y el dolor, o las células ciliadas que funcionan en el equilibrio y la audición. La mechanosensation también es importante para los tipos celulares que se exponen regularmente a la tensión de cizallamiento como las células endoteliales, que la línea de los vasos sanguíneos, o células sanguíneas que experimentan cizalla en la circulación normal. Los viscometers son dispositivos que detectan la viscosidad de los fluidos. Los viscosítros rotatorios también se pueden utilizar para aplicar una fuerza de cizallamiento conocida a los fluidos. La capacidad de estos instrumentos para introducir una cizalla uniforme en los fluidos ha sido explotada para estudiar muchos fluidos biológicos, incluyendo sangre y plasma. Viscometry también se puede utilizar para aplicar cizallamiento a las células en una solución, y para probar los efectos de la cizalla en pares de ligando-receptores específicos. Aquí, utilizamos viscometría de placa cónica para probar los efectos de los niveles endógenos de estrés por cizallamiento en las plaquetas tratadas con anticuerpos contra el complejo de receptores mecanosensoriales plaquetarios GPIB-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Los mecánicos son proteínas que responden a estímulos mecánicos, como la presión o la perturbación/deformación mecánica. Para algunos mecánicos, la detección de estas perturbaciones mecánicas es explícita a la función de los tipos de células en las que se expresan. Tomar, por ejemplo, los receptores de estiramiento en las neuronas barorreceptora; estos canales de iones mecanosensibles regulan la presión arterial por detección vascular "estiramiento"1,2. En el oído interno, los canales de iones en las células ciliadas detectan las deformaciones mecánicas causadas por las ondas sonoras3, y los mecánicos de bajo umbral cutáneo (ltmrs) facilitan la transmisión de la información táctil4. En otros casos, los mecánicos proporcionan información importante a la célula para el establecimiento de la adherencia o el crecimiento. Las células pueden percibir la rigidez de su entorno local, y pueden depender de fuerzas contráctiles a través del citoesqueleto de actina e integrinas para dictar crecimiento o propagación de5,6.

Cuando se estudian interacciones receptor-ligando en modelos basados en células o tejidos, existen ensayos comunes que pueden reportar de forma rápida y precisa los efectos de alterar la temperatura, el pH, la concentración de ligando, la tonicidad, el potencial de la membrana y muchos otros parámetros que pueden variar en vivo. Sin embargo, estos mismos ensayos pueden caer corto cuando se trata de detectar la contribución de la fuerza mecánica a la activación del receptor. Ya sea que las células detectan su microambiente, detecten ondas sonoras o respondan al estiramiento, una cosa que los mecánicos antes mencionados tienen en común es que están participando en interacciones donde el ligando, receptor, o ambos, están anclados a un Superficie. Los ensayos desarrollados para probar los efectos de las fuerzas mecánicas en las interacciones del receptor a menudo reflejan este paradigma. Las cámaras de flujo y microfluidos se utilizan para estudiar los efectos del flujo de cizallamiento en las células y los receptores7,8. Estos tipos de experimentos tienen la ventaja de permitir el ajuste fino de las tasas de cizallamiento a través de velocidades de flujo establecidas. Otras técnicas emplean sondas moleculares fluorescentes para detectar las fuerzas aplicadas por las células en superficies ricas en ligando, produciendo una lectura precisa de la magnitud y las orientaciones de las fuerzas involucradas en la interacción9,10.

Además de la mecanosensación que ocurre cuando uno o ambos socios están anclados a una superficie, el estrés cortante puede afectar las proteínas y las células en solución. Esto se observa a menudo en las células sanguíneas/proteínas que están constantemente en la circulación, y puede manifestarse a través de la activación de los mecánicos que normalmente están anclados en la superficie11, o a través de la exposición de las secuencias de destino que sería ocludido bajo condiciones estáticas12. Sin embargo, relativamente menos técnicas de ensayo de los efectos de la fuerza de cizallamiento en partículas en solución. Algunos enfoques en la solución introducen la cizalla a través de las células de vórtex en la suspensión de fluidos con diferentes velocidades y duraciones, aunque estos enfoques pueden no permitir una determinación muy precisa de la tensión de cizallamiento generada. Los viscosítros rotatorios miden la viscosidad aplicando una fuerza de cizallamiento específica a los fluidos. Aquí describimos un método aplicado para determinar el efecto de las tasas de cizallamiento laminar específicas en las células o fragmentos celulares en solución.

Una de las proteínas más altamente expresadas en la superficie de las plaquetas es el complejo IB-IX de glicoproteína (GP). GPIb-IX es el receptor primario de la proteína plasmática von Willebrand factor (FWF). Juntos, este par receptor-ligand ha sido reconocido durante mucho tiempo como la base de la respuesta plaquetaria a la tensión de cizallamiento13. En caso de daño vascular, el VWF se une al colágeno expuesto en la matriz sub-endotelial14, reclutando así las plaquetas en el sitio de la lesión a través de la interacción vWF-GPIB-IX. La participación del VWF en su sitio de Unión en la subunidad GPIbα si el GPIb-IX bajo tensión fisiológica de cizallamiento induce el despliegue de un dominio mecanosensorial de membrana proximal (MSD) que a su vez activa el GPIb-IX15. En un estudio reciente, hemos demostrado que los anticuerpos contra el GPIbα, como los generados en muchos pacientes con trombocitopenia inmunitaria (PTI), también son capaces de inducir la señalización plaquetaria vía MSD desplegando bajo tensión de cizallamiento11. Sin embargo, a diferencia del VWF, que facilita la activación inducida por cizalla GPIb-IX ininmovilizando el complejo bajo circulación normal, los anticuerpos bivalentes son capaces de unir las plaquetas a través de GPIb-IX y desplegar el MSD en circulación. De esta manera, un mecánico que normalmente se activa por inmovilización superficial bajo cizalla se puede activar en solución. En el presente informe, demostraremos cómo se aprovechó un ensayo de cizallamiento uniforme basado en viscómetro para detectar los efectos de niveles específicos de tensión de cizallamiento en la activación del receptor en la solución.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Todos los métodos que utilizan plaquetas humanas derivadas de donantes descritos en el presente documento fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad Emory/children's Healthcare de Atlanta.

1. extraer sangre y aislamiento plaquetario

  1. Extraer sangre humana del consentimiento de donantes adultos sanos a través de la venopunción en el día del experimento en citrato de trisodio al 3,8%. Un tubo de 4,5 mL de sangre es suficiente para producir suficiente plasma rico en plaquetas (PRP) para 20-25 afecciones en donantes cuyos recuentos plaquetarios están cerca de 250 x 103 por μl.
    Nota: Evite dibujar sangre a través de agujas de calibre estrecho (menores de 21 G).
  2. Preparar PRP a través de centrifugación a 22 ° c y 140 x g durante 12 min con un freno largo. Esto resultará en dos capas distintas, con glóbulos rojos en la parte inferior y el PRP de color claro en la parte superior.
  3. Aísle la capa superior, nublada y amarilla del PRP mediante un pipeteo cuidadoso a través de un corte de punta de pipetas en un ángulo de 45 ° y obtenga el recuento de plaquetas a través de un hemograma completo (CBC).
  4. Si es necesario, lave las plaquetas en solución salina tamponada (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) en presencia de prostaglandina E1 (PGE1) y resuspendio en el tampón de Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mm MgCl2, 5 mm glucosa, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) con 5 mm de glucosa, de lo contrario, proceda al paso 1,5. Los siguientes pasos describen el lavado en breve.
    1. Ajuste el volumen de PRP a 10 mL con solución salina tamponada de tuberías y agregue 0,6 μM PGE1.
    2. Centrifugar durante 8 min a 1.900 x g, luego desechar el sobrenadante y dejar que el pellet de plaquetas se sienta en 400 ΜL de Tyrode y la solución de glucosa durante 5 min.
    3. Resuspende suavemente el pellet de plaquetas y Manténlo sin molestar durante 30 min.
  5. Ajustar el recuento de plaquetas a ~ 250 x 103 plaquetas por μl con plasma humano pobre en plaquetas (PPP) y mantener la suspensión a 22 ° c sin perturbaciones o bajo rotación suave.

2. ligand y tratamiento de cizallamiento uniforme

Nota: todos los pasos de la sección 2 que requieran pipetear deben realizarse lentamente, a fin de no introducir ninguna cizalla.

  1. Agregue el anticuerpo o ligando deseado a la PRP o las plaquetas lavadas y mezcle suavemente al pipetear hacia arriba y hacia abajo o revolviendo con una punta de pipetas. Déjalo sin molestar a temperatura ambiente durante 5-10 min. Agregue un volumen equivalente de PPP o búfer de Tyrode a un control negativo.
  2. Encienda el Viscosímetro de la placa cónica, ajuste la temperatura de la placa a 22 ° c y deje tiempo para que la placa alcance esta temperatura.
  3. Pipetear el PRP tratado o las plaquetas lavadas en el Viscosímetro de la placa cónica de temperatura controlada directamente en el centro de la placa. Asegúrese de que toda la muestra se deposita entre el cono y la placa en el punto de contacto, y no en el exterior de la llanta del cono.
  4. Cizallamiento a una velocidad y duración apropiadas.
    1. Calcule la cizalla según lo indicado por el manual del viscómetro, o como se muestra anteriormente15,16.
    2. Determine la velocidad de cizallamiento de la viscosidad y la tensión de cizallamiento deseada mediante la ley de viscosidad de Newton; Equation 1; viscosidad del plasma es 1.5-1,6 centipoises (CP)17. Por ejemplo, un rango de cizallamiento normal para la circulación humana es 5-30 dyn/cm2 y la cizalla se debe aplicar en la escala de tiempo de minutos de un solo dígito.
  5. Levante el cono de la lámina de la placa (~ 2 mm) para que la muestra permanezca en contacto con la placa y el cono, y utilice una punta de carga de gel u otro extremo largo para recolectar 5-10 μL del centro del volumen de la muestra.
  6. Incubar las muestras esquiadas con los marcadores deseados durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para los marcadores de fosfatidilserina, β-galactosa, y la exposición P-selectin utilizar Lactadherin C2 dominio (LactC2) a 0,08 μM18, Erythrina cristagalli lectina (ECL) en 6,25 μg/ml, y anti-P-selectin anticuerpo (20 μg/ml), respectivamente.
  7. Fije las muestras en el 2% de paraformaldehído durante 20 min en RT antes de la dilución o el almacenamiento en frío, y proceda al paso 3,1 o almacene las muestras a 4 ° c durante no más de 12 h.

3. detección de marcadores de superficie y reticulación mediante citometría de flujo

  1. Analice la muestra mediante citometría de flujo, recopilando al menos 20.000 eventos para cada condición.
  2. Cuantificación de la intensidad de la señal de los marcadores fluorescentes utilizando el valor de altura para la intensidad de cada fluoróforo, o la media geométrica de fluorescencia (IMF).
  3. Si tiene como objetivo detectar la reticulación plaquetaria después del tratamiento de cizallamiento, analice la muestra en un CITOMETRO de flujo con capacidad de imagen y cuantificese reticulación por área y parámetros de relación de aspecto.
    1. Trace un histograma de área y/o relación de aspecto.
    2. Utilice un control negativo con albúmina sérica bovina (BSA) o vehículo para dibujar una puerta excluyendo los eventos más totalmente circulares (esta puerta se dibuja generalmente en una relación de aspecto ~ 0,819,20) y cuantitar el porcentaje de eventos dentro de esta puerta. Los eventos con una relación de aspecto más baja son más propensos a ser reticulantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La figura 1 describe cómo el modelo desencadenante de activación del GPIB-IX, inicialmente introducido para explicar la activación del receptor dependiente de la cizalla cuando se ancla a la pared del recipiente, también puede apoyar la activación de plaquetas reticuladas por un ligando multivalente. La figura 2 muestra lecturas de la activación plaquetaria humana tratadas por dos anticuerpos dirigidos al dominio N-terminal de GPIB-IX (6B4 y 11A8), y un anticuerpo de control (IgG normal) bajo condiciones de cizada y estática. En la figura 3, las plaquetas se trataron con 6B4 y un anticuerpo con una fuerza no vinculante demasiado baja para desencadenar la activación del GPIB-IX, AK2. La figura 4 muestra un curso de tiempo. Los marcadores de activación plaquetaria fueron sonados y detectados en puntos de tiempo progresivos durante el tratamiento de cizallamiento con 11A8 o AK2. En la figura 5a, el anticuerpo reticulado de perlas de tamaño plaquetario decorado con el dominio N-terminal del GPIB-IX fue atacado mediante citometría de flujo convencional. Figura 5 b muestra la reticulación de plaquetas mediada por 6B4 como imagen mediante citometría de flujo de imágenes. En la figura 6, se utilizaron muestras clínicas de suero de pacientes con trombocitopenia inmunitaria en lugar de los anticuerpos monoclonales divalentes contra el GPIB-IX utilizados en cifras anteriores. Los anticuerpos que contienen plasma del paciente contra el GPIb-IX desencadenaron respuestas dependientes de la cizalla, en contraste con el plasma de pacientes con PTI sin anticuerpos dirigidos a GPIb-IX.

Figure 1
Figura 1 : El mecánico de superficie de plaquetas GPIb-IX puede unir un ligante divalente soluble (como un anticuerpo). Cuando dos complejos de GPIb-IX en plaquetas opuestas se unen al mismo ligando divalente, se produce reticulación. Bajo la cizalla fisiológica, las plaquetas reticulada pueden generar una fuerza de tracción para actuar sobre el GPIb-IX y desplegar el MSD en el mismo. Como consecuencia del despliegue de MSD, el GPIb-IX se activa e induce la señalización plaquetaria y el aclaramiento plaquetario descendente, como se ilustra. Figura fue adaptada de Quach et al.21por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Expresión de marcadores de activación plaquetaria en PRP humana tratada con control IgG o anticuerpos anti-GPIB-IX 11a8 y 6b4 bajo condiciones estáticas o cortado (30 dyn/cm2). En estos resultados representativos, exposición superficial de las plaquetas de fosfatidilserina (PS), β-galactosa, y P-selectin fueron sonados por la proteína fluorescente verde (GFP)-conjugados Lact-C2, la Erythrina cristagalli lectina (ECL) conjugada con FITC y anticuerpo anti-P-selectin, respectivamente. La fluorescencia se detectó mediante citometría de flujo. Los datos se expresan como porcentaje de eventos con fluorescencia por encima del control negativo. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; importancia determinada a través de la prueba tdel estudiante. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : PRP humana tratada con dos anticuerpos anti-GPIb-IX. PRP humano tratado con dos anticuerpos anti-GPIB-IX, uno con alta fuerza desvinculación (6b4) y uno con baja fuerza no vinculante (AK2) bajo estático (0 dyn/cm2), baja cizalla (5 dyn/cm2), y alta cizalla (30 DYN/cm 2) condiciones. Los gráficos muestran el porcentaje de eventos positivos para la expresión superficial de β-galactosa, PS y P-selectin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. El significado se determinó a través de un ANOVA de un solo sentido con la prueba de Tukey. Las barras de error representan SD. figura ha sido adaptado de Quach et al.11por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Curso de tiempo de exposición al cizallamiento (20 dyn/cm2) para PRP humano tratado con control IgG, 11a8 o AK2. La exposición superficial de plaquetas de PS y P-selectin se detectó mediante citometría de flujo para muestras esquiadas para 0, 0,5, 1, 3 y 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001. El significado se determinó a través de un ANOVA de un solo sentido con la prueba de Tukey. Las barras de error representan SD. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Cuantificación de reticulación por área y parámetros de relación de aspecto. (a) las perlas de tamaño plaquetario (4 μm) fueron conjugadas con el dominio N-terminal de GPIbα e incubadas con IgG (gris), AK2 (rojo) o 6B4 (azul) bajo condiciones de cizada (20 dyn/cm2). Aquí se muestran las parcelas de contorno de dispersión hacia adelante (FSC-A) frente A la fluorescencia de anticuerpos anti-ratón. (b) histograma para la relación de aspecto de las plaquetas en PRP incubado con 6B4 y fluorescentemente etiquetados anti-CD41 (un marcador plaquetario) anticuerpos bajo cizallamiento. Se muestran imágenes representativas con varias proporciones de aspecto. Figura ha sido adaptado de Quach et al.11por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Se utilizaron muestras clínicas de suero de pacientes con trombocitopenia inmunitaria en lugar de los anticuerpos monoclonales divalentes contra el GPIb-IX. (a) capacidad de unión del GPIB-IX de plasma de pacientes con PTI, a través de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). (b) las plaquetas humanas lavadas reconstituidas en el plasma del paciente en ITP bajo condiciones estáticas y esquiadas (30 dyn/cm2). Los gráficos muestran el porcentaje de eventos positivos para la expresión superficial de P-selectin o PS. * * * * P ≤ 0,0001. El significado se determinó a través de ANOVA de un solo sentido con prueba de Tukey. Las barras de error representan SD. figura ha sido adaptado de Quach et al.11por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El protocolo descrito en este manuscrito permite una evaluación rápida y versátil del efecto de la cizalla laminar sobre los receptores de las plaquetas y de la superficie celular. Los resultados representativos específicos presentados aquí subrayan cómo los efectos de los ligandos multiméricos o bivalentes pueden verse afectados por el flujo de cizallamiento. Además de esta aplicación, un ensayo de cizallamiento uniforme tiene amplias aplicaciones en la observación de efectos que dependen de la cizalla. En ausencia de un par de ligando-receptor conocido, un ensayo de cizallamiento uniforme también puede detectar los efectos de la cizalla en factores como la forma de la célula y la señalización, especialmente cuando se combina con análisis citométricos de flujo. Aludido en parte por la figura 5b, un ensayo de cizallamiento uniforme se presta a una amplia variedad de métodos de detección distintos o complementarios a los análisis citométricos de flujo estándar descritos en este protocolo, incluyendo imágenes, bioquímica y base celular Ensayos.

La figura 2 ejemplifica la aplicación básica del ensayo, específicamente para discriminar entre una interacción de ligando-receptor dependiente de la cizalla y un control negativo. 6B4, un anticuerpo que es capaz de reticulando plaquetas a través de la Unión a los receptores GPIb-IX y sosteniendo suficiente fuerza para activar el receptor11, activa las plaquetas cuando se expone a la cizalla (representado en el modelo en la figura 1), a diferencia de la control IgG que no une el GPIb-IX plaquetario. Esta aplicación proporciona simultáneamente evidencia de que el efecto es específico para el par receptor-ligand elegido y depende de la cizalla. El ensayo de cizallamiento uniforme también puede distinguir entre los efectos de los ligandos que pueden y no puede sostener sus enlaces a un receptor bajo niveles de cizallamiento específicos. En la figura 3, vemos una falta de lectura de la señalización del anticuerpo de anti-GPIB-IX AK2, que une su epítopo con una fuerza desvinculadora particularmente débil11. Esta figura también demuestra los efectos de variar el nivel de esfuerzo de cizallamiento aplicado por el Viscosímetro de la placa cónica de una cizalla baja a alta.

La figura 4 demuestra que este ensayo se puede utilizar para modular la longitud de la exposición al cizallamiento y sugiere una estrategia para mostrar estos datos. En la figura 5, se utilizan dos lecturas alternativas basadas en citometría de flujo para el ensayo, las cuales no dependen de marcadores fluorescentes de activación del receptor, sino que pueden utilizarse para describir la reticulación y el cambio de tamaño/forma. Figura 5 b muestra cómo la dispersión hacia adelante, que aumenta de forma proporcional al tamaño de un evento, puede distinguir entre distintas poblaciones de eventos reticulantes desvinculados (Singlet), doblete, triplete o más multiplet. Como en la figura 5b, el ensayo se puede aplicar a perlas conjugadas con un receptor de interés, lo que elimina la posibilidad de que otros receptores participen en los eventos de reticulación vistos a través de otros métodos. En la figura 6, el plasma, se utiliza un fluido biológico que contiene ligandos potenciales para nuestro receptor de interés en lugar de anticuerpos monoclonales purificados. Esto ilustra una aplicación en la que puede no ser necesario un ligando o socio vinculante conocido específico para un receptor de interés.

Aunque el ensayo es bastante accesible como está escrito, hay algunos pasos clave que deben realizarse con cuidado. Principalmente entre estos es tener cuidado de no introducir cizalla de fuentes externas que no sea el propio tratamiento de cizallamiento en sí. Cuando se dibuja sangre, como se menciona en el paso 1,1 de este protocolo, es importante dibujarlo a través de agujas de calibre apropiadas. Para la recolección de sangre humana a través de la venopunción de donantes adultos que consientes, esto se puede lograr con un conjunto de recolección de sangre de 21 G (incluido en la tabla de materiales). Una vez que se extrae la sangre y se aísla el PRP, se puede almacenar a temperatura ambiente para hasta 6 h en el Banco o en un Rotisserie lento.

Si la centrífuga utilizada para aislar PRP puede frenar a diferentes velocidades es mejor elegir un freno lento con el fin de minimizar la perturbación de la capa de PRP y la aplicación de la fuerza innecesaria. Una vez que el PRP está aislado o el tipo de célula de interés está en suspensión de fluidos, evite pipetear las mezclas demasiado rápido. En su lugar, aspirar y expulsar las muestras de forma lenta y constante, especialmente durante el paso 2,5, donde la muestra se dibuja a través de una punta de pipetas particularmente estrecha. Para volúmenes de muestra que se pueden pipetear con precisión a través de puntas de pipetas de diferentes tamaños, es aconsejable utilizar el más grande entre ellos. Para muestras especialmente sensibles o viscosas, el extremo final de la punta de la Piera se puede cortar en un ángulo para ensanchar la abertura a través de la cual se va a dibujar la muestra.

Muchos ensayos que prueban el efecto de la cizalla en la mecanosensación celular dependen de una interacción entre un ligando anclado y su receptor. Microfluidos y cámaras de flujo son un ejemplo, donde la interacción entre un ligando anclado y un receptor, por lo general en una célula en solución, se puede observar en tiempo real7,8. Otras técnicas utilizan la microscopía para detectar eventos que ocurren en la interfaz entre una capa celular y el sustrato subyacente o la sonda9. Estas técnicas se han utilizado para particularmente gran efecto en el estudio de las células sanguíneas en circulación. Por otro lado, las técnicas que permiten la interrogación de eventos que ocurren enteramente en solución bajo flujo son más limitadas. Para la aplicación genérica de la fuerza en la solución, la vórtex de una muestra puede servir como un método "rápido y sucio". Sin embargo, es difícil determinar la fuerza precisa aplicada, y la cizalla no es seguro que resulte del flujo laminar. Esta es una de las ventajas del ensayo de cizallamiento uniforme. Por otro lado, el inconveniente principal del ensayo de cizallamiento uniforme es una brecha horaria entre la aplicación de cizalla y observar las propias células. La cizalla se aplica, luego las células están manchadas y fijas, pero las técnicas de imagen no pueden observar las células durante el proceso de cizallamiento en sí. Una adaptación de este método implicaría la adición de las células directamente a los marcadores deseados y esquila con los marcadores presentes. Esto permitiría la detección inmediata de cualquier efecto transitorio.

Hasta ahora hemos aplicado este ensayo para detectar el efecto en solución dependiente de la cizalla de los anticuerpos dirigidos al complejo GPIb-IX. Mientras que los anticuerpos proporcionan un compañero de Unión conveniente, simple y divalente, es lógico suponer que la reticulación de los mecánicos en las células opuestas en circulación se puede lograr a través de innumerables ligandos multivalentes con Fuerzas. Esta técnica puede ser útil en el futuro en la detección de los efectos específicos de tales ligandos. Además, el ensayo de cizallamiento uniforme se puede utilizar junto con técnicas de imagen no descritas aquí, como la microscopía de fluorescencia estándar. En última instancia, el ensayo de cizallamiento uniforme proporciona un método razonablemente barato, cuantitativo y específico para aplicar cizalla laminar a las células y fragmentos celulares en solución, y se puede utilizar en la parte superior de muchos métodos de detección.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo pertinente a este estudio fue apoyado en parte por los institutos nacionales de salud (NIH) del Instituto Nacional del corazón, los pulmones y la sangre otorga HL082808, HL123984 (R.L.), y F31HL134241 (M.E.Q.). Los fondos también proporcionados por el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de NIH otorgan T32GM008367 (M.E.Q.); y fondos de becas piloto de children's Healthcare of Atlanta y la citometría de flujo pediátrica de la Universidad Emory Core. A los autores les gustaría agradecer al Dr. Hans Deckmyn por compartir el anticuerpo 6B4, y el centro de investigación pediátrica de la citometría de flujo de Emory children's para soporte técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter