Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en membran matsmältning teknik för beredning av prover för masspektrometri. Denna teknik underlättar den praktiska analysen av protein-proteininteraktioner.
Abstract
Många intracellulära proteiner interagerar fysiskt i enlighet med deras intracellulära och extracellulära omständigheter. Faktum cellulära funktioner beror till stor del på intracellulära protein-protein interaktioner. Därför är forskning om dessa interaktioner oumbärlig för att underlätta förståelsen av fysiologisk processer. Samfällning av associerade proteiner, följt av masspektrometri (MS) analys, möjliggör identifiering av nya proteininteraktioner. I denna studie har vi tillhandahållit Detaljer om den nya tekniken för immunoprecipitation-vätskekromatografi (LC)-MS/MS-analys kombinerat med på-membran nedbrytning för analys av protein-proteininteraktioner. Denna teknik är lämplig för rå immunoprecipitants och kan förbättra genomströmningen av proteomiska analyser. Märkta rekombinanta proteiner fälldes med hjälp av specifika antikroppar; Nästa, immunoprecipitants utblottade på av polyvinylidenklorid vinylidendifluorid membran bitar utsattes för reduktiv alkylering. Efter trypsinization analyserades de smälta proteinhalterna med LC-MS/MS. med hjälp av denna teknik, kunde vi identifiera flera kandidat associerade proteiner. Sålunda, denna metod är bekvämt och användbart för karakterisering av nya protein-protein interaktioner.
Introduction
Även om proteiner spelar konstitutiva roller i levande organismer, de är ständigt syntetiseras, bearbetas, och degraderas i den intracellulära miljön. Vidare samverkar intracellulära proteiner ofta fysiskt och biokemiskt, vilket påverkar funktionen hos en eller båda1,2,3. Till exempel, den direkta bindningen av spliceosome-associerade protein homolog CWC22 med eukaryotisk översättning initierings faktor 4A3 (eIF4A3) är nödvändig för montering av exon Junction Complex4. I överensstämmelse med detta, en eIF4A3 Mutant som saknar samhörighet för CWC22 misslyckas med att underlätta exon Junction Complex-driven mRNA splitsning4. Således är studiet av proteininteraktioner avgörande för den exakta förståelsen av fysiologisk reglering och cellulära funktioner.
De senaste framstegen inom masspektrometri (MS) har tillämpats på den omfattande analysen av protein-proteininteraktioner. Till exempel, samfällning av endogena proteiner eller exogent introducerade märkta proteiner med tillhörande proteiner, följt av MS-analys, möjliggör identifiering av nya proteininteraktioner5. En stor flaskhals av MS/MS-analys är dock dålig återhämtning från tryptic sammandrag av protein prover. För att utföra proteomiska analyser på cell Lysates, i-gel och på membran matsmältningen tekniker är i allmänhet används för att förbereda MS/MS prover. Vi har tidigare jämfört en in-gel rötning förfarande med en on-membran digestionsteknik6, och visade att den senare var förknippad med bättre sekvens täckning. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran kan vara lämplig för detta ändamål eftersom det är mekaniskt robust och motståndskraftig mot höga koncentrationer av organiska lösningsmedel7,8, vilket möjliggör enzymatisk nedbrytning av immobiliserade proteiner i närvaro av 80% acetonitril9. Dessutom kan immobilisering på ett membran inducera kon Formations förändringar i målproteiner, vilket leder till förbättringar i tryptic rötnings effektivitet10. Följaktligen, i denna artikel, vi har beskrivit användningen av immunoprecipitation-LC/MS/MS-analys av proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik. Denna enkla metod underlättar den praktiska analysen av protein-protein interaktioner även i icke-specialiserade laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunoprecipitation
Anmärkning: vi använde icke-natriumdodecylsulfat (SDS) lysis buffert och citrat eluering, som beskrivs i följande avsnitt. Användning av en alternativ egen immunoprecipiteringsteknik kan dock också vara tillämplig för beredning av LC-MS/MS-prover.
- Transfect odlade celler med vektorer kodning en epitop tagg ensam eller ett fusionsprotein. För att förvärva representativa data, överföra J774 celler (1 x 106) med vektorer kodning grönt fluorescerande protein (GFP) ensam eller GFP-smält Capn6 (calpain-6 Gene) med hjälp av katjoniska liposomer.
- Konjugatantikroppar mot magnetiska pärlor.
- För detta ändamål, blanda anti-GFP antikropp (2 μL/reaktion) med magnetiska pärlor (25 μL/reaktion) i 500 μL av citrat fosfatbuffert (24,5 mM citronsyra, 51,7 mM dibasiskt natriumfosfat, pH 5,0) i ett 1,5 mL provrör.
- Rotera blandningen vid 50 RPM för 1 h vid rumstemperatur. Tvätta sedan de IgG-konjugerade pärlorna tre gånger med citratfosfatbuffert som innehåller 0,1% polyoxyetylen (20) sorbitanmonolaurat.
- Lysera de transfekterade cellerna med en lämplig lyseringsbuffert. För erhållande av representativa data, lyse de transfekterade cellerna i 30 min på is i 400 μl lyseringsbuffert (50 mm Tris-HCl; pH 7,5, 120 mm NaCl, 0,5% poly (oxyethelene) octylfenyleter) innehållande 40 μmol/L fenylmetylsulfonylfluorid, 50 μg/ml leupeptin, 50 mL aprotinin, 200 μmol/L natrium orthovanadate och 1 mM etylenglykoltetraättiksyra (EGTA) i 1,5 mL provrör 24 h efter transfektion.
- Rensa lysat genom centrifugering vid 15 000 x g i 5 min och samla supernatanten.
- Preclear den lysate. Tillsätt omärkta magnetiska pärlor (25 μL/reaktion) i ett 1,5 mL-provrör. Tvätta pärlorna tre gånger med 500 μL citratfosfatbuffert. Efter avlägsnande av citrat fosfat buffert i sista tvätten, tillsätt cellen lysate över de magnetiska pärlor. Rotera blandningen med hjälp av rotator vid 50 rpm i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Placera provröret på ett magnetiskt stativ i 5 minuter för magnetisk separation, och samla in cellen lysate. Användning av magnet stativet som anges av tillverkaren rekommenderas.
- Bind mål proteinerna till de konjugerade pärlorna. Placera det immunglobulin (ig) G-konjugerade pärlor på ett magnetiskt stativ för 5 min för magnetisk separation, kassera citratbufferten, och tillsätt sedan cellen lysate till de separerade pärlorna.
- Rotera blandningen vid 50 RPM för 1 h vid rumstemperatur.
- Separera mål proteinerna från fria icke-målproteiner. Tvätta pärlorna tre gånger med 500 μL citratfosfatbuffert innehållande 0,1% polyoxyetylen (20) sorbitanmonolaurat. Efter den sista tvätten, tillsätt 30 μL citratbuffert (pH 2 – 3) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att eluera mål proteinerna.
Anmärkning: om återhämtning från immunoprecipitation är otillräcklig, användning av alternativa epitop taggar, såsom flagga eller hans, kan förbättra effektiviteten. Om elueringseffektiviteten är otillräcklig kan användningen av andra eluanter, såsom en SDS-baserad lösning, förbättra effektiviteten.
2. membran nedbrytning av proteiner
Anmärkning: användning av protein fria material och utrustning är nödvändig för att undvika kontaminering med exogena proteiner. Dessutom rekommenderas att operatören använder en kirurgisk mask och handskar för att undvika kontaminering med humana proteiner.
- Skär PVDF membran i 3 mm x 3 mm bitar med hjälp av kirurgiska saxar som har torkas av med metanol och torkas omedelbart före användning.
- Tillsätt 2 – 5 μL etanol på bitarna av PVDF-membran på ren aluminiumfolie.
- Innan de torkar helt, tillsätt eluanten (2 – 5 μL vardera, 4 – 6 stycken per prov) på hydrofila PVDF-membranen, och sedan lufttorka membranen tills membranytan blir Matt. Torkade membran kan förvaras vid 4 ° c.
- Överför alla membran till 1,5 mL plaströr, tillsätt 20 – 30 μL etanol för att göra membranen hydrofila, och ta sedan bort etanolen med hjälp av en pipett.
- Innan membranet torkar ut helt, tillsätt 200 μl Ditiotreitol (dTT)-baserade reaktions lösning (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT, och 20% acetonitril) och inkubera den vid 56 ° c i 1 h.
- Byt ut reaktions lösningen med 300 μL av iodoacetamid-lösningen (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamid och 20% acetonitril) och inkubera i minst 45 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta membranen två gånger med 1 mL destillerat vatten och en gång med 1 mL 2% acetonitril genom vortexblandning för > 10 s.
- Lös upp frystorkade MS-grade trypsin (tabell över material) direkt i reaktions lösningen (30 mm NH4HCO3 som innehåller 70% acetonitril). Tillsätt 100 μL av reaktions lösningen som innehåller 1 μg trypsin (tabell över material) (30 mm NH4hco3 innehållande 70% acetonitril) och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Överför reaktions lösningen som innehåller tryptic-smälter till ett rent 1,5 ml-provrör med en pipett.
- Tillsätt 100 μL tvättlösning (70% acetonitril/1% trifluorättiksyra) till membranet och inkubera vid 60 ° c i 2 timmar. samla upp tvättlösningen och blanda den med reaktions lösningen. Tillsätt ytterligare 100 μL tvättlösning till membranet och Sonikera den i 10 minuter. Samla sedan tvättlösningen och blanda med reaktions lösningen.
- Täck provröret med en bit laboratorie film och gör ett par små hål med en nål. Torka lösningen med en vakuum koncentrator.
- Lös upp återstoden i 10 μL 0,2% myrsyra. Efter centrifugering (12 000 × g, 3 min vid rumstemperatur), överför supernatanten till ett provrör.
Obs: tvättningar är de kritiska stegen i detta avsnitt. Under membranprotein nedbrytning, tvättning av membranen som innehåller immobiliserade proteiner efter reduktion och alkylering med destillerat vatten, följt av 2% acetonitril, för mer än 10 SEK vardera, är avgörande för avlägsnande av reagenser.
3. LC-elektrospray jonisering (ESI)-MS/MS-analys
- Aktivera ett ESI-MS/MS-instrument (tabell över material) tillsammans med ett nano-LC HPLC-system (tabell över material). Länka en för kolumn (tabell över material) och en analytisk kolumn (tabell över material).
- Innan analysen, kalibrera masspektrometern med hjälp av tryptic sammandrag av bovint serum albumin upplöst i 0,2% myrsyra, som ger standard peptider.
- Analysera proverna med hjälp av positivt Jon läge och ett Mass intervall på 400 – 1250 m/z; sedan förvärva upp till 10 MS/MS Spectra (100 MS vardera) med en massa intervall på 100 – 1600 m/z och en linjär lutning på 2% – 80% acetonitril och 0,2% myrsyra för 80 min vid en flödeshastighet av 300 nL/min.
- Analysera utdata med hjälp av programvara för protein identifiering (tabell över material) för att identifiera de associerade proteiner som kandidat. För den positiva identifieringen av ett kandidat protein krävs detektion av minst ett HiFi-peptidfragment (> 95% Fidelity).
- Utelämna de proteiner som på samma sätt fälls ut i GFP-uttrycker celllysat (transfektion av vektor uttrycker en GFP-tagg ensam) från listan över kandidat proteiner.
Anmärkning: om få proteiner identifieras i databasen analys, modifiering av MS/MS förvärvs förhållanden (t. ex. ändra tiden från 100 MS vardera till 50 ms vardera) kan öka antalet identifierade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den ovan beskrivna proceduren analyserades immunoprecipitanter med LC-MS/MS (figur 1). Efter uteslutning av exogent härledda proteiner (proteiner från andra arter och IgGs) identifierades 17 proteiner i calpain-6-associerade immunoprecipitanter (tabell 1) och 15 proteiner identifierades i GFP-associerade immunoprecipitanter ( Tabell 2). Av de calpain-6 och GFP-associerade proteiner, 11 identifierades i båda immunoprecipitants (figur 2). När dessa och calpain-6 själv uteslöts, fem kandidat calpain-6-associerade proteiner förblev: komplement C1q delkomponenten subenhet C, keratin typ II cytoskelett 8, IgE-bindande protein, ADP/ATP translocase 1, och ubiquitin.
Figur 1. System för membran matsmältning teknik
Cell celllysat fälldes med hjälp av magnetiska pärlor konjugerade med specifika antikroppar. Den eluant från immunoprecipitation var uppblottade på bitar av PVDF membran. Därefter, membranen behandlades med reagenser för reduktiv alkylering, och sedan inkuberas med trypsin. Reaktions lösningen analyserades sedan med LC-MS/MS. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt över de representativa uppgifterna
Sjutton proteiner identifierades i calpain-6-associerade immunoprecipitant och 15 proteiner upptäcktes i den GFP-associerade immunoprecipitanten. Av dessa identifierades 11 proteiner i båda immunoprecipitanter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Anslutning | Peptider (95%) | % COV |
| Actin, cytoplasmiska 2 | SP | P63260 | ACTG | 5 | 18,4 |
| Actin, aorta glatta muskeln | SP | P62737 | Acta | 5 | 18,57 |
| Actin, cytoplasmiska 1 | SP | P60710 | ACTB | 5 | 18,41 |
| Actin, alfa skelettmuskulaturen | SP | P68134 | Rättsakter | 5 | 13,53 |
| Actin, alfa hjärtmuskeln 1 | SP | P68033 | ACTC | 5 | 13,53 |
| Actin, gamma-enterisk glatt mus kula | SP | P63268 | Acth | 5 | 13,56 |
| Förlängnings faktor 1-alfa 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Förlängnings faktor 1-alfa 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Keratin, typ II cytoskelett 8 | SP | P11679 | K2C8 | 3 | 22,65 |
| Komplement C1q delkomponent subenhet C | SP | Q02105 | C1QC | 2 | 8,94 |
| IgE-bindande protein | SP | P03975 | IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | SP | O35646 | CAN6 | 1 | 15,91 |
| ADP/ATP translocase 2 | SP | P51881 | ADT2 | 1 | 27,52 |
| ADP/ATP translocase 1 | SP | P48962 | ADT1 | 1 | 19,13 |
| Ubiquitin | SP | P62991 | UBIQ | 1 | 40,79 |
| Runt-relaterad transkriptionsfaktor 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Isoform 2 av runt-relaterad transkriptionsfaktor 3 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptider (95%)" anger antalet peptider som identifierats med en trohets poäng > 95% i MS/MS-data. "% COV" avser den procentuella andelen aminosyrerester som identifierats i alla peptider (med > 95% trohet) i förhållande till det totala antalet aminosyrerester som utgör motsvarande protein. För att förbättra tydligheten visas inte EXOGEN proteiner (proteiner från andra arter och iggs), ribosomala proteiner och histoner. | |||
Tabell 1. Calpain-6-associerade proteiner
| Namn | Anslutning | Peptider (95%) | % COV |
| Förlängnings faktor 1-alfa 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Förlängnings faktor 1-alfa 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Actin, alfa skelettmuskulaturen | SP | P68134 | Rättsakter | 3 | 13,53 |
| Actin, alfa hjärtmuskeln 1 | SP | P68033 | ACTC | 3 | 13,53 |
| Actin, gamma-enterisk glatt mus kula | SP | P63268 | Acth | 3 | 13,56 |
| Actin, cytoplasmiska 2 | SP | P63260 | ACTG | 3 | 13,6 |
| Actin, aorta glatta muskeln | SP | P62737 | Acta | 3 | 13,53 |
| Actin, cytoplasmiska 1 | SP | P60710 | ACTB | 3 | 13,6 |
| ADP/ATP translocase 2 | SP | P51881 | ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2 '-O-metyltransferas fibrillarin | SP | P35550 | FBRL | 2 | 14,37 |
| Prohibitin | SP | P67778 | Phb | 1 | 9,19 |
| Heterogena nukleära ribonukleoprotein U | SP | Q8VEK3 | HNRPU | 1 | 10,63 |
| Runt-relaterad transkriptionsfaktor 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Isoform 2 av runt-relaterad transkriptionsfaktor 3 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| Förlängnings faktor 1-gamma | SP | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12,36 |
| "Peptider (95%)" anger antalet peptider som identifierats med en trohets poäng > 95% i MS/MS-data. "% COV" avser den procentuella andelen aminosyrerester som identifierats i alla peptider (med > 95% trohet) i förhållande till det totala antalet aminosyrerester som utgör motsvarande protein. För att förbättra tydligheten visas inte EXOGEN proteiner (proteiner från andra arter och iggs), ribosomala proteiner och histoner. | |||
Tabell 2. GFP-associerade proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har tidigare beskrivit en analys av de oxidativa modifieringarna av apolipoprotein B-100 i oxiderat low-density lipoprotein med LC-MS/MS, föregånget av en membran matsmältning teknik6. I den nuvarande studien kombinerade vi denna teknik med immunoprecipitation och har identifierat flera calpain-6-associerade proteiner. Denna nya teknik utgör en bekväm metod för screening för kandidat proteiner. Calpain-6 är en icke-proteolytisk medlem av calpain proteolytiska familj11 som har enligt uppgift modifiera cellulära funktioner genom protein-proteininteraktioner12,13. Med hjälp av en on-membran rötnings teknik, vi har tidigare identifierat andra calpain-6-associerade proteiner som sysselsätter en annan MS set-up12. Därför rekommenderar vi att testa flera MS-villkor för att maximera antalet identifierade kandidater. Av samma anledning är utvärderingen av de immunoprecipitation villkor, såsom de typer av epitop tagg, tvättmedel och eluering lösning som används, viktigt för att uppnå optimala utgångar.
I den nuvarande studien identifierade vi 11 proteiner i både calpain-6-och GFP-associerade immunoprecipitanter. Majoriteten av de överlappande proteinerna var aktin-isotyper, och kontaminering med aktin cytoskeletala proteiner är vanligt i analyserna av cellulära protein-proteininteraktioner eftersom uttrycksnivåerna för dessa proteiner är mycket höga. Dessa kandidater bör därför uteslutas från ytterligare analyser. Dessutom upptäcktes tationskoefficienter i båda immunoprecipitanter. De reglerar hastighet och trohet av proteinsyntes och påverkar protein-vikning14, och därför är co-immunoprecipitation av töjning faktorer inte förvånande. Dessa proteiner bör också uteslutas från ytterligare utvärdering.
Immunoprecipitanter kan utsättas för reduktiv alkylering och enzymatisk matsmältning direkt i elutionslösningen15, och denna nedbrytnings metod i lösningen kan också användas för beredning av prover för MS/MS. Vi anser dock att användningen av membran nedbrytning för att ha betydande fördelar jämfört med i-lösning matsmältningen. PVDF membran fungerar som en byggnadsställning för den efterföljande reduktiva alkylering och enzymatisk matsmältning, vilket innebär att de lösningsmedel som krävs för dessa processer kan bytas ut enkelt. Det är därför möjligt att använda olika Elueringslösningar för immunoprecipitation. Omvänt, för i-lösning matsmältning, det kan vara svårt att använda SDS-baserade eller låg pH Elueringslösningar eftersom proteas aktivitet kan vara begränsad under sådana förhållanden. Dessutom kan immobilisering av målproteiner göra den efterföljande tvättproceduren lättare. Därför är på membran matsmältningen mycket lämplig för beredning av immunoprecipitants för MS/MS-analys. Ett begränsat antal proteaser kan vara lämpliga för detta protokoll. Hittills endast lysyl-C, andra än trypsin, är enligt uppgift aktiv i närvaro av upp till 80% acetonitril6,9,10,15.
Vår membran matsmältning teknik är lämplig för identifiering av proteiner i en liten mängd immunoprecipitant med en mycket känslig detektionsgräns. Man bör dock komma ihåg att detekterings effektiviteten för ett målprotein beror på mängden närvarande. Proteiner som förekommer i större mängder upptäcks företrädesvis och de kan förhindra att andra proteiner som förekommer i mindre mängder upptäcks av MS. Ändå, under normala omständigheter många proteiner upptäcks med hjälp av LC-MS/MS-analys, och andra analyser måste användas för att klargöra vilken av kandidat proteiner är av lämplig biologisk betydelse.
I denna studie har vi utvärderat en on-membran rötnings teknik för analys av immunoprecipitants. En sådan bekväm och heltäckande metod för analys av protein-protein interaktioner bör vara allmänt tillämpliga för att förbättra genomströmningen av framtida proteomiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant Number 17K09869 (till AM), Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), ett forskningsanslag från Kanehara Ichiro Medical Science Foundation och ett forskningsanslag från Suzuken Memorial Foundation (all to TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
