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Biochemistry

Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Published: July 20, 2019 doi: 10.3791/59750
Automatic Translation
1, 1
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

Summary

हम सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के आनुवंशिक संशोधन के बाद पूरी कोशिकाओं में mitochondria और एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एसकोरबेट पेरोक्सिडस 2 और हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस धुंधला शामिल है, के साथ और एक ही खंड में लक्ष्य जीन के बिना कोशिकाओं के सीरियल अनुभाग, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सीरियल इमेजिंग.

Abstract

कोशिकीय आर्गेनेल्स, जैसे माइटोकोंड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), विभिन्न प्रकार के कार्यों को करने के लिए एक नेटवर्क बनाते हैं। इन अत्यधिक घुमावदार संरचनाओं सेलुलर शर्तों के आधार पर एक गतिशील नेटवर्क बनाने के लिए विभिन्न आकारों में जोड़ रहे हैं। Mitochondria और ईआर के बीच इस नेटवर्क के दृश्य सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का प्रयास किया गया है; हालांकि, सीमित संकल्प विस्तार में mitochondria और ईआर के बीच झिल्ली का निरीक्षण करने के लिए अपर्याप्त है. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर organelles के अवलोकन के लिए अच्छा झिल्ली विपरीत और नैनोमीटर पैमाने पर संकल्प प्रदान करता है; हालांकि, यह असाधारण समय लेने वाली है जब अत्यधिक घुमावदार organelles के तीन आयामी (3 डी) संरचना का आकलन. इसलिए, हमने सहसंबंधी प्रकाश-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (CLEM) और वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के माध्यम से माइटोकोंड्रिया और ईआर की आकृति विज्ञान को देखा जिसमें वर्धित एसकोरबेट पेरोक्सिडस 2 और हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस धुंधला होता है। एक एन ब्लॉक धुंधला विधि, अल्ट्राथिन सीरियल सेक्शनिंग (आरे टोमोग्राफी), और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी संरचना का निरीक्षण करने के लिए लागू किए गए थे। इस प्रोटोकॉल में, हम mitochondria और ईआर की विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए CLEM और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन का सुझाव देते हैं।

Introduction

माइटोकोंड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली से बंधे सेलुलर आर्गेनेल्स हैं। उनके कनेक्शन उनके कार्य के लिए आवश्यक है, और उनके नेटवर्क से संबंधित प्रोटीन1वर्णित किया गया है. माइटोकोंड्रिया और ईआर के बीच की दूरी लगभग 100 एनएम प्रकाश माइक्रोस्कोपी2का उपयोग करते हुए सूचित की गई है; तथापि, हाल ही में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी3 और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)4 अध्ययनों से पता चला है कि यह लगभग 10-25 एनएम पर काफी छोटा है। सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में प्राप्त संकल्प EM की तुलना में कम है, और विशिष्ट लेबलिंग आवश्यक है. EM mitochondria और ईआर के बीच कनेक्शन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक पर्याप्त उच्च संकल्प विपरीत प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है. हालांकि, एक नुकसान सीमित z-अक्ष जानकारी है क्योंकि पतली वर्गों लगभग 60 एनएम या पारंपरिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) के लिए पतली होना चाहिए. पर्याप्त EM z-अक्ष इमेजिंग के लिए, त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (3DEM) 5 इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह पूरी कोशिकाओं के पतले धारावाहिक वर्गों के सैकड़ों की तैयारी शामिल है, जो बहुत मुश्किल काम है कि केवल कुछ कुशल प्रौद्योगिकीविदों में महारत हासिल है. इन पतली वर्गों नाजुक formvar फिल्म लेपित एक छेद TEM ग्रिड पर एकत्र कर रहे हैं. यदि फिल्म एक गिड्डी पर टूट तीज, सीरियल इमेजिंग और वॉल्यूम पुनर्निर्माण संभव नहीं है। सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM) 3DEM के लिए एक लोकप्रिय तकनीक है कि या तो एक हीरे की चाकू (Dik-SBEM) या एक केंद्रित आयन बीम (FIB-SEM) के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) वैक्यूम कक्ष के अंदर विनाशकारी एन ब्लॉक अनुभाग का उपयोग करता है 6. हालांकि, क्योंकि उन तकनीकों सभी सुविधाओं पर उपलब्ध नहीं हैं, हम सरणी टोमोग्राफी7 सीरियल सेक्शनिंग और SEM का उपयोग कर सुझाव देते हैं। सरणी टोमोग्राफी में, अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके काटे गए सीरियल सेक्शनों को टीईएम ग्रिड के बजाय कांच के कवरस्लिप में स्थानांतरित किया जाता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी तथा SEM8के माध्यम से कल्पना की जाती है। बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉन (बीएसई) इमेजिंग के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए, हमने ऑस्मोरियमटेट्रॉक्साइड (ओसो 4) को ओस्मोफिलिक थायोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीएचच)9के साथ एक एन ब्लॉक ईएम धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग किया, जिससे हमें बिना चित्र प्राप्त करने में सक्षम बनाता है पोस्ट-एम्बेडिंग डबल धुंधला.

इसके अतिरिक्त, mitochondrial मार्कर SCO1 (साइटोक्रोम c oxidase विधानसभा प्रोटीन 1)- ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 आणविक टैग EM स्तर पर mitochondria कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एपेक्स2 लगभग 28 केडीए है और सोयाबीन एस्कोरबेट पेरोक्सिडस11से प्राप्त होता है। यह उसी तरह है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी में प्रयोग किया जाता है EM स्तर पर विशिष्ट प्रोटीन की विस्तृत स्थान दिखाने के लिए विकसित किया गया था. APEX2 कोकारक हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ 2) की उपस्थिति में टैग की साइट पर एक अघुलनशील osmiophilicबहुलक में 3,3' -diaminobenzidine (DAB) धर्मान्तरित. APEX2 EM में पारंपरिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, पूरे सेल की गहराई में एक प्रोटीन स्थानीयकरण के साथ. दूसरे शब्दों में, APEX2-टैग प्रोटीन अल्ट्रा-cryosectioning के बाद इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और permebilization के बिना विशिष्ट osmication11 द्वारा कल्पना की जा सकती है। हॉर्सराडिश peroxidase (HRP) भी एक संवेदनशील टैग है कि एक स्थानीयकृत वेग में DAB के एच2ओ2निर्भर बहुलकीकरण उत्प्रेरित करता है, OsO4के साथ उपचार के बाद EM इसके विपरीत प्रदान करते हैं. ईआर लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 एक पूरे सेल के भीतर ईआर कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। आनुवंशिक टैग का उपयोग करने के हमारे प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए और कम osmium और TCH (आरटीओ विधि) के साथ धुंधला दाग, एक ही समय में osmication प्रभाव का उपयोग कर, हम के साथ और आरटीओ में प्रत्येक आनुवंशिक टैग के उपयोग के बिना झिल्ली इसके विपरीत तुलना में ब्लॉक धुंधला. हालांकि 3DEM सरणी टोमोग्राफी और DAB के साथ APEX और HRP के साथ धुंधला है, क्रमशः, अन्य प्रयोजनों के लिए उपयोग किया गया है, हमारे प्रोटोकॉल अद्वितीय है क्योंकि हम 3DEM और DAB mitochondria और ईआर लेबलिंग के लिए धुंधला के लिए सरणी टोमोग्राफी संयुक्त है. विशेष रूप से, हम के साथ और एक ही खंड में APEX टैग जीन के बिना पांच कोशिकाओं को दिखाया, जो कोशिकाओं पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव की जांच में सहायता की.

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Protocol

1. SCO1-APEX2 और HRP-KDEL प्लाज्मिड वेक्टर के साथ पैटर्न ग्रिड संस्कृति पकवान और सेल transfection के साथ सेल संस्कृति

  1. बीज 1 x 105 HEK293T कोशिकाओं उन्हें 35 मिमी ग्लास ग्रिड में रखकर संस्कृति व्यंजन एक humidified वातावरण में 5% सीओ2 से युक्त 37 डिग्री पर Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 U/ पेनिसिलिन, और 100 यू/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  2. कोशिकाओं को बोने के बाद, जब वे 50%-60% संगम तक बढ़ गए हैं, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का उपयोग करके कोशिकाओं को SCO1-APEX210 और एचआरपी-केडीएल12 प्लास्मिड का परिचय दें (SCO1-APEX2 CDNA 0.5 g + HRP-KDEL प्लाज्मिड डीएनए 0.5 $g प्रति 3 $L ट्रांसफेक्शन रिएजेंट)।

2. पैटर्न संस्कृति व्यंजनों और APEX2 और एचआरपी के लिए DAB धुंधला पर बढ़ रही कोशिकाओं की प्रकाश माइक्रोस्कोपी

  1. transfection के बाद 16-24 h पर, सभी संस्कृति मीडिया को हटा दें और तुरंत कोमल pipeting द्वारा गर्म (30-37 डिग्री सेल्सियस) निर्धारण समाधान (तालिका 1) के 250 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। तुरंत निर्धारण समाधान निकालें और ताजा निर्धारण समाधान के 1.5 एमएल के साथ बदलें। 60 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, और फिर बर्फ ठंडा 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर (तालिका1) के 1 एमएल में प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार धो लें।
    चेतावनी: Aldehyde धुएं बेहद विषाक्त कर रहे हैं. एक हवादार धूआं हुड के तहत सभी काम करते हैं।
  2. 1 एमएल ठंड (0-4 डिग्री सेल्सियस) 20 एमएल ग्लिसिन विलयन जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, इसके बाद ठंड 0.1 एम सोडियम कोडीलेट बफर के 1 एमएल में 5 मिनट के तीन washes द्वारा किया जाता है।
  3. एक ताजा 1x DAB समाधान तैयार (3.33 एमएल 0.3 एम cacodylate समाधान + 30% एच2हे 2 के 10 $L2 + 5.67 एमएल ठंडे पानी की + 1 एमएल 10x DAB समाधान).
  4. ताजा तैयार 1x DAB समाधान (चरण 2.3) के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और लगभग 5-45 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट जब तक एक हल्के भूरे रंग का दाग एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देता है (चित्र 1A)।
  5. धीरे से DAB समाधान को हटाने और ठंड 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर के 10 मिनट प्रत्येक के लिए 1 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला.
  6. 100x या उच्चतर के आवर्धन पर DAB धुंधला कल्पना करने के लिए एक चरण विपरीत उल्टे माइक्रोस्कोप (या एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप) का प्रयोग करें। काँच के निचले भाग को चिह्नित करने के लिए मार्कर पेन का उपयोग करें जहाँ ब्याज का क्षेत्र (आरओआई) स्थित है (चित्र 1ठ,ब्)।

3. EM ब्लॉक के लिए नमूना तैयारी

  1. 2-1-2.6 के चरणों में वर्णित कक्ष संस्कृति और DAB धुंधला करें.
  2. 2% कम OsO4 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल के साथ नमूनों को ठीक करने के बाद।
    चेतावनी: OsO4 धुएं अत्यधिक विषाक्त कर रहे हैं. एक हवादार धूआं हुड के तहत सभी काम करते हैं।
  3. चरण 3-2 के दौरान एक नया TCH समाधान (तालिका 1) तैयार की और 0ण्2ण्2ण्0उ फ़िल्टर से गुज़रें।
    चेतावनी: टीसीएच धुएं अत्यधिक विषाक्त कर रहे हैं। एक हवादार धूआं हुड के तहत सभी काम करते हैं।
  4. स्थिर निकालें और कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 1 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला।
  5. आरटी में 20 मिनट के लिए पहले से तैयार और फ़िल्टर किए गए TCH समाधान के 1 एमएल में कोशिकाओं को रखें।
  6. आरटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला।
  7. आरटी में 30 मिनट के लिए आसुत पानी में 2% ऑस्मियम टेत्रोक्साइड के 1 एमएल के लिए एक दूसरी बार कोशिकाओं को उजागर करें।
  8. फिक्सेटिव निकालें और आरटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 1 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला. 1% यूरेनिल एसीटेट (एक्क्यूस) का 1 एमएल जोड़ें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  9. आरटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 1 एमएल में कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
  10. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पूर्व गर्म वाल्टन का सीसा aspartate समाधान (तालिका 1)
  11. पूर्व-गर्म नेतृत्व aspartate समाधान के 1 एमएल जोड़कर वाल्टन के नेतृत्व aspartate समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग, और फिर 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ओवन में जगह है।
  12. आरटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला।
  13. 2-एमएल इथेनॉल एलिकोट्स (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) की एक वर्गीकृत श्रृंखला में इनक्यूबेट आरटी में 20 मिनट प्रत्येक के लिए.
  14. 3:1 इथेनॉल के 1 एमएल में 30 मिनट के लिए इथेनॉल और इनक्यूबेट को कम करें: आरटी में मिश्रण माध्यम को कम-विस्कोसिटी embedding।
  15. मध्यम निकालें और 1:1 इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें: मिश्रण मध्यम embedding कम visosity. आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  16. मध्यम निकालें और 1:3 इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें: मिश्रण मध्यम embedding कम visosity. आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  17. मध्यम निकालें और 100% कम-विस्कोसिटी एम्बेडिंग मध्यम और रात भर इनक्यूबेट के 1 एमएल जोड़ें।
  18. 100% कम-विस्कोसिटी एम्बेडिंग मिश्रण में नमूना एम्बेड करें और 60 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  19. अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके 90-nm मोटी धाराओं को तैयार करें।
  20. 200 केवी पर TEM के अंतर्गत ग्रिड का प्रेक्षण कीजिए।

4. सीरियल सेक्शनिंग और SEM इमेजिंग के लिए indium-tin-ऑक्साइड लेपित coverslips पर बढ़ते

  1. Substrate तैयारी
    1. 30-60 एस के लिए आइसोप्रोपेनॉल में कोमल आंदोलन द्वारा स्वच्छ इंडियम-टिन-ऑक्साइड (ITO)-कोट किए गए ग्लास कवरलिप्स (22 मिमी x 22 मिमी)।
    2. कवरलिप ्स्स्ड निकालें, अतिरिक्त आइसोप्रोपेनोल को निकाल दें, और सूखे तक धूल मुक्त वातावरण में छोड़ दें।
    3. 1 मिनट के लिए एक प्लाज्मा कोटर का उपयोग कर चमक निर्वहन द्वारा ITO लेपित ग्लास coverslips का इलाज करें।
      नोट: प्लाज्मा सक्रिय सब्सट्रेट सतह पर एक हाइड्रोफिलिक संपत्ति प्रदान करता है। यह सब्सट्रेट पर पानी की एक बहुत पतली फिल्म बनाता है वर्गों में शिकन गठन को रोकने के लिए जब अनुभाग सब्सट्रेट से जुड़ा हुआ है.
    4. ITO लेपित ग्लास कवरलिप्स को सब्सट्रेट धारक में डालें, और चाकू की नाव में रखें।
  2. नमूना ब्लॉक और सीरियल अनुभागीकरण की ट्रिमिंग
    1. अल्ट्रामाइक्रोटोम के नमूना धारक में नमूना ब्लॉक डालें और ट्रिमिंग ब्लॉक में सेट करें।
    2. लक्ष्य स्थिति के आसपास सभी अतिरिक्त राल दूर ट्रिम करने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करें (चरण 2.6 में पहचान की, चित्र 1D-G).। ब्लॉक चेहरे का आकार trapezoid या आयताकार होना चाहिए। अग्रणी किनारे और पीछे की धार बिल्कुल समानांतर होनी चाहिए (चित्र 1H,I)।
    3. अल्ट्रामाइक्रोटोम के हाथ पर नमूना धारक डालें और चाकू धारक में हीरे की चाकू रखें। रिबन वाहक में ITO ग्लास coverslips डालें और संभाल के साथ वाहक दबाना (चित्र 1J) रिबन वाहक को चाकू की नाव में सेट करें और फ़िल्टर किए गए आसुत जल से चाकू की नाव भरें (चित्र 1K)।
    4. चाकू के पास ITO कांच के किनारे सेट करने के लिए धारक के हैंडल को सावधानी से धकेलकर चाकू की स्लाइड के साथ वाहक स्थिति को समायोजित करें (चित्र 1L)।
    5. अनुभाग काटने के बाद, अनुभागप्रक्रिया को बंद करो, और धीरे-धीरे ट्यूब के क्लैम्पिंग पेंच को खोलें और पानी की नाव (प्रति सेकंड पानी की एक बूंद की प्रवाह दर) को नाली करें।
    6. रिबन-संग्रह प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, clamping डिवाइस के हैंडल के साथ सब्सट्रेट निकालें और रिबन (चित्र 1M)को सूखा।

5. SEM और SEM छवि स्टैक के संरेखण में इमेजिंग

  1. चिपचिपा कार्बन टेप के साथ एल्यूमीनियम स्टब पर ITO लेपित कवरस्लिप माउंट करें। कांच की सतह और चिपचिपा कार्बन टेप के साथ स्टब में सतह को सील करें, और फिर 10-nm मोटी कार्बन परत के साथ कोट करें (चित्र 1छ)।
  2. 5 केवी के कम त्वरण वोल्टेज पर एक क्षेत्र उत्सर्जन SEM में ITO लेपित कवरस्लिप और बीएसईई के कुशल संग्रह के लिए एक उपयुक्त कार्य दूरी का निरीक्षण करें।
  3. सीरियल छवियों छवि J सॉफ़्टवेयर (फिजी)13 वर्चुअल स्टैक विकल्प का उपयोग कर में आयात करें। कोई नया TrakEM14खोलें, और छवि स्टैक TrakEM में आयात करें। दाएँ-माउस बटन क्लिक करें और संरेखित करें मेनू चुनें.
  4. फिर छवि श्रेणी (पहली छवि से अंतिम छवि तक) का चयन करें. स्वत: संरेखण समाप्त करें, संरेखित डेटासेट सहेजें, और चयनित छवि श्रेणी (पहली छवि से अंतिम छवि तक) एक समतल छवि संकलित करने के लिए निर्यात चुनें. अंत में, छवि जम्मू मुख्य मेनू में AVI प्रारूप में फ्लैट छवि डेटा को बचाने के.
    नोट: पूरक मूवी 1 और पूरक मूवी 2 SEM छवि स्टैक और फसली छवि स्टैक, क्रमशः दिखा.

6. सीरियल छवियों से mitochondria और ईआर के विभाजन

  1. IMOD15 सॉफ्टवेयर और खुली छवि फ़ाइलों में 3dmod शुरू करो.
  2. जैप विंडो में, मध्य-माउस बटन का उपयोग करके माइटोकोंड्रिया और ईआर की समोच्च रेखा बनाएँ।
  3. विभाजित वॉल्यूम को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, मॉडल दृश्य विंडो खोलें (पूरक मूवी 3).

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Representative Results

चित्र 1 इस प्रोटोकॉल के लिए शेड्यूल और वर्कफ़्लो का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल 7 दिनों की आवश्यकता है; हालांकि, SEM इमेजिंग पर बिताए समय के आधार पर, यह बढ़ सकता है. कोशिका रूपांतरण के लिए कोशिकाओं के संगम को नियंत्रित किया जाना चाहिए ताकि संपूर्ण ग्रिड प्लेट के नीचे को कवर न किया जा सके (चित्र 1क)। एक उच्च सेल घनत्व प्रकाश माइक्रोस्कोप और EM अवलोकन के दौरान ब्याज की सेल की पहचान को रोका जा सकता है. हम आनुवंशिक रूप से टैग प्लाज्मिड कि APEX2 और एचआरपी व्यक्त करने के लिए संस्कृति पकवान में कई सुसंस्कृत कोशिकाओं के बीच कुशलता पूर्वक transfected कोशिकाओं का चयन किया. हमने HEK293T कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया और सह-ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में SCO1 से जुड़े APEX2 (माइटोकोंड्रिल इंटरमेम्ब्रेन स्पेस [IMS]) और एचआरपी-संयोजित केडीएल (ईआर) की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत, एपेक्स2-ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को भूरे रंग का रंग दिया गया था, जबकि बिना ट्रांसफेक्शन वाली कोशिकाओं को बिना दागदार बना दिया गया था (चित्र 1क और चित्र2)। इसने ट्रांसफेटेड टारगेट सेल की पहचान की अनुमति दी, जिसका उपयोग तब एक सुसंस्कृत कोशिका जनसंख्या में DAB धुंधला का उपयोग करके सहसंबंधी प्रकाश-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (CLEM) के लिए किया जाता था (चित्र 3D-F और चित्रा 4B)। फ्लैट एम्बेडिंग चरण के दौरान लक्ष्य सेल के स्थान की पहचान करना आसान बनाने के लिए कांच के नीचे (चित्र 1B,C) को चिह्नित करना उपयोगी था (चित्र 1E,F)। जब HEK293T कोशिकाओं एक बढ़ाया "डबल osmium" धुंधला प्रोटोकॉल (आरटीओ) के साथ इलाज किया गया, पूरी कोशिकाओं को एक गहरे रंग दाग रहे थे (चित्र 1D). संस्कृति डिश से ग्रिड्ड कवरस्लिप को हटाने के बाद, हमने स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे ब्लॉक सतह पर लक्ष्य स्थान की पहचान की (चित्र 1जी)। हमने ROI में कोशिकाओं को एक trapezoid आकार में ट्रिम किया, और अग्रणी और पीछे के किनारों को समानांतर बनाया गया (चित्र 1H,I)। माइटोकोंड्रिया और ईआर नेटवर्क पुनर्निर्माण को लागू करने के लिए, हमने एक बड़े हीरे की नाव के साथ एक बड़े हीरे के चाकू का उपयोग किया ताकि SCO1-APEX2 और एचआरपी-केडीएल-expressing HEK293T कोशिकाओं (चित्र 1J-L) को क्रमबद्ध रूप से अनुभाग में रखा जा सके। सीरियल 90-nm मोटी रिबन वर्गों सफलतापूर्वक ITO लेपित ग्लास कवरस्लिप (चित्र 1M) से जुड़े थे , और सतह SEM के माध्यम से अवलोकन के लिए 10 एनएम मोटी कार्बन के साथ लेपित किया गया था (चित्र 1N)।

एससीओ1-एपेक्स2 और एचआरपी-केडेल प्रोटीन डीएबी रूपांतरण से प्राप्त अत्यधिक सघन इलेक्ट्रॉनिक संकेतों को उत्पन्न करते हैं जो TEM (चित्र 3) और SEM ( चित्र4) में पता लगाने योग्य हैं। SCO1-APEX2 द्वारा उत्पन्न काले दाग विशेष रूप से आईएमएस में देखा गया था न कि माइटोकोंड्रिया के मैट्रिक्स अंतरिक्ष में (चित्र 3डी)। सह-अनुवादित कोशिकाओं (चित्र 3 डी, ईमें बाएं सेल ) एससीओ1-एपेक्स2 और एचआरपी-केडीएल प्लाज्मिड दोनों के साथ माइटोकोंड्रियाल आईएमएस और ईआर में अत्यधिक सघन इलेक्ट्रॉन संकेत व्यक्त किया; तथापि, हमने देखा कि उन कोशिकाओं में कोई ईआर धुंधला नहीं है जो केवल SCO1-APEX2 (चित्र 3D,Fमें दाएँ कक्ष) के साथ ट्रांसफेक्टेड थे। SEM का उपयोग करके सीरियल छवियों के लिए, पहले, हमने एक बड़े क्षेत्र पर बीएसई डिटेक्टर का उपयोग करके संपूर्ण सरणी छवि का अवलोकन बनाया (चित्र 4A)। दूसरा, आरओआई को पहले भाग में रखा गया था और अन्य सभी अनुभागों में प्रचारित किया गया था (चित्र4ख)। अंत में, हमने 5-nm छवि पिक्सेल (चित्र4C) के साथ पांच लक्ष्य कक्षों वाले ROI की कल्पना की। ज़ूम-इन छवियों से विस्तृत उपकोशिकीय संरचनाओं का पता चला (चित्र 4D) जैसे कि गोलगी उपकरण, माइटोकोंड्रिया, नाभिक, और ईआर। धारावाहिक छवियों स्पष्ट रूप से पता चला है कि ईआर-mitochondria संपर्क अलग z-planes पर हो रही थी (पूरकमूवी 2 और पूरक मूवी 3).

Figure 1
चित्र 1 : एस पर्याप्त तैयारी कार्यप्रवाह SEM और TEM के लिए. (ए) ग्रिड्ड कवरलिप्स युक्त एक संस्कृति डिश कोशिकाओं के साथ बीजित किया गया था और DAB के साथ दाग. (बी,सी) DAB धुंधला करने के बाद, एक मार्कर पेन कांच जहां लक्ष्य कोशिकाओं स्थित थे के नीचे चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (डी) ओएसओ4 धुंधला करने के बाद, कोशिकाएं गहरे रंग की हो जाती हैं। (ई, एफ) Polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब (या embedding कैप्सूल के किसी भी प्रकार) आसानी से एक EM ब्लॉक है कि चिह्नित पदों निहित बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया. (ई) शीर्ष देखें. (एफ) नीचे दृश्य. (छ) ई एम ब्लॉक की सतह की एक निम्न-आवर्धन स्टीरियो माइक्रोस्कोपी छवि। (ज) आरओआई सपाट सतह के मध्य में है। (I) आयताकार ROI की उच्च-आवर्धन स्टीरियो माइक्रोस्कोपी छवि। (जे) ITO-coated ग्लास coverslips (सफेद तारांकन) रिबन वाहक (नीले तीर) में डाला जाता है, और वाहक संभाल दक्षिणावर्त मोड़ द्वारा clamped है. (के, एल) धारक के संभाल ध्यान से धक्का दिया है, और वाहक फिसलने से चाकू के करीब ITO लेपित ग्लास coverslip के किनारे की स्थिति के लिए समायोजित किया जाता है। (एम) रिबन ITO लेपित ग्लास कवरलिप्स से जुड़े होते हैं। (छ) ITO लेपित कांच कवरलिप्स SEM स्टब से जुड़े होते हैं, और अवशिष्ट कांच चिपचिपा कार्बन टेप के साथ बंद होता है और 10-nm कार्बन थ्रेड परत के साथ लेपित होता है। सफेद तारांकन ITO लेपित ग्लास कवरस्लिप से संकेत मिलता है, और काले तारांकन कार्बन टेप का संकेत देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उलटे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि सुसंस्कृत HEK293T कोशिकाओं DAB के साथ दाग. (ए) केवल DAB के साथ कोशिकाओं के दाग (ओएसओ4 धुंधला के बिना). सफेद तीर बेदाग कोशिकाओं से संकेत मिलता है, और काले तीर DAB दाग कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (बी) आरओआई की उच्च-आवर्धन छवि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : लक्षित माइटोकोंड्रियाल आईएमएस (एससीओ1-APEX2) और ईआर (HRP-KDEL) का प्रदर्शन करने वाली HEK293T कोशिकाओं की TEM इमेजिंग। (ए -सी) mitochondria (एम) और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) की डबल झिल्ली दिखा untransfected HEK293T कोशिकाओं। (डी-एफ) APEX2 और HRP DAB के बहुलकीकरण को स्थानीय वेग में उत्प्रेरित करते हैं, जो बाद में इलेक्ट्रॉन-घन ओसो4के साथ दागित होता है। एक अंधेरे विपरीत mitochondrial आईएमएस (काला arrowhead) और ईआर (काला तीर) में स्पष्ट है; हालांकि, कक्ष जो HRP-KDEL के साथ transfected नहीं थे बेदाग ईआर (सफेद तीर) प्रदर्शन। स्केल बार: 1 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: HEK293T कोशिकाओं के सीरियल SEM इमेजिंग लक्षित mitochondrial आईएमएस (SCO1-APEX2) और ईआर (HRP-KDEL) का प्रदर्शन. (A) बीएसई डिटेक्टर का उपयोग करके देखे गए धारावाहिक अनुभाग रिबन का अवलोकन। (ख) उच्च-आवर्धन बीएसई छवि (सफेद डॉटेड-लाइन बॉक्स) के साथ कम-आवर्धन छवि (इनसेट) का सहसंबंध DAB-सना हुआ कोशिकाओं का ROI इंगित करता है। (सी) 5-nm छवि पिक्सल के साथ रॉय लक्ष्य कोशिकाओं के उच्च आवर्धन। (डी, ई) एक अंधेरे विपरीत mitochondrial आईएमएस और ईआर में स्पष्ट है, लेकिन नहीं Golgi उपकरण. (एफ-I) ईआर-माइटोकोंड्रिटोकसंपर्क (सफेद तीर) अलग-अलग z-प्लेन पर होते हैं। छ, नाभिक; एम, माइटोकोंड्रिया; ईआर, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; जी, Golgi उपकरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: समाधान व्यंजनों.

Movie 1
पूरक मूवी 1: SEM छवि स्टैक. TrakEM 14 सॉफ्टवेयर के साथ फिजी13 91 छवियों को संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मूल संरेखित डेटा सेट 11 GB है. स्टैक को डाउनआकार करने के लिए, आकार बदला गया और क्रॉप किया गया छवि सेट उपयोग किया गया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
पूरक मूवी 2: फसली छवि ढेर. माइटोकोंड्रिया, ईआर, और उनके संपर्क साइटों को विस्तार से देखने के लिए, छवियों को मूल डेटा सेट (5 एनएम/पिक्सेल) से क्रॉप किया गया था। स्केल बार: 1 $m. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 3
पूरक मूवी 3: mitochondria और ईआर के 3 डी पुनर्निर्माण. 3 डी दृश्य के लिए, mitochondria और ईआर की समोच्च विभाजित किया गया था और IMOD15 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर visualized. Mitochondria लंबे ट्यूबलर संरचनाओं (लाल) के रूप में कल्पना की गई, और ईआर नेटवर्क (हरा) उनके जटिल आकारिकी से पता चला. पीला विभिन्न z-planes में mitochondria और ईआर के बीच संपर्क स्थल के एक बड़े सतह क्षेत्र का प्रतिनिधित्व किया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

EM का उपयोग कर एक नैनोमीटर संकल्प पर विशिष्ट प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण का निर्धारण प्रोटीन के सेलुलर कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. आम तौर पर, वहाँ दो तकनीकों EM के माध्यम से एक लक्ष्य प्रोटीन के स्थानीयकरण का अध्ययन कर रहे हैं. एक इम्यूनोगोल्ड तकनीक है, जो EM में 1960 के बाद से इस्तेमाल किया गया है, और अन्य एक तकनीक हाल ही में विकसित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग टैग16का उपयोग कर रहा है. पारंपरिक इम्यूनोगोल्ड तकनीकों ने लेबल किए गए प्रोटीन के स्थान को दिखाने के लिए एंटीबॉडी-संयुग्मी सोने के कणों या क्वांटम डॉट्स को नियोजित किया है। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता और राल और फिक्सेटिव से प्रभावित एंटीबॉडी की प्रवेश क्षमता के कारण, यह तकनीक काफी सीमित है17। विशेष रूप से, क्योंकि इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग मुख्य रूप से एन ब्लॉक धातु धुंधला और मजबूत ऑस्मियम निर्धारण के बिना एक अल्ट्राथिन अनुभाग की सतह तक सीमित है, यह तकनीक आधुनिक 3DEM18पर सीधे लागू नहीं है। प्रोटीन लेबलिंग के साथ SBEM और सरणी टोमोग्राफी सहित हाल ही में 3DEM विधियों का उपयोग करने के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल में आनुवंशिक रूप से एनकोडेड EM टैग का उपयोग किया। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग टैग permeabilization की आवश्यकता नहीं है, तकनीकी रूप से अल्ट्रा cryosectioning की मांग, और व्यक्तिगत वर्गों के इम्यूनोस्टेनिंग क्योंकि वे निर्धारण से पहले ब्याज की साइट के लिए स्थानीयकृत.

3DEM में नमूना तैयारी के लिए प्रक्रियाओं आम तौर पर आम रासायनिक निर्धारण और भारी धातु धुंधला तरीकों का एक संयोजन शामिल है क्योंकि कोशिकाओं को मुख्य रूप से सी, एच, ओ, और एन से बना रहे हैं, भारी धातुओं के साथ धुंधला की आवश्यकता के लिए EM 9 के तहत इसके विपरीत प्राप्त . इसलिए, हम कम osmium निर्धारण और धातु धुंधला कार्यरत करने के लिए इसके विपरीत और सीरियल इमेजिंग के लिए चालकता बढ़ाने के लिए. अनुभागीकरण से पहले नमूनों को दागने की प्रक्रिया, जिसे एन ब्लॉक धुंधला के रूप में जाना जाता है, को एसबीईएम और एफआईबी-SEM19जैसे 3DEM विधियों के लिए एक आवश्यक कदम के रूप में सूचित किया गया है। हमने इस बात की पुष्टि की है कि हमारे प्रोटोकॉल में एन ब्लॉक-सना हुआ कोशिकाओं ने स्पष्ट SCO1-APEX2 और HRP-KDEL EM विपरीत विशेष रूप से माइटोकोंड्रियाल आईएमएस और ईआर में क्रमशः TEM (चित्र3) में प्रदर्शित किया है। इसके अलावा, 90-nm धारावाहिक वर्गों से SEM छवियों दोनों organelles में एक स्पष्ट विपरीत से पता चला (चित्र 4). विशेष रूप से, एन ब्लॉक धुंधला द्वारा बढ़ाया विपरीत DAB संकेत से स्पष्ट रूप से अलग था, और इसके विपरीत और चालकता अच्छी गुणवत्ता वाले धारावाहिक छवियों में हुई (चित्र4). इसके अतिरिक्त, यह उच्च विपरीत तीन आयामी (3 डी) छवि सॉफ्टवेयर के साथ संरेखण और विभाजन जैसे बाद के कार्यों की सुविधा एड्स.

हाल के वर्षों में, मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक (dik-SBEM, FIB-SEM, और सरणी टोमोग्राफी) जैविक सवालों का जवाब दिया है कि देखने के एक बड़े क्षेत्र और एक 3 डी दृश्य के अवलोकन की आवश्यकता है. Dik-SBEM और FIB-SEM वर्गों की भौतिक हैंडलिंग शामिल नहीं है, इसलिए छवियों के संरेखण के लिए समय लेने को कम किया जा सकता है. हालांकि, नमूना सीरियल छवियाँ प्राप्त करने के लिए नष्ट किया जा करने के लिए है, और दृश्य का क्षेत्र सरणी टोमोग्राफी की तुलना में छोटा है। सीरियल SEM इमेजिंग सरणी टोमोग्राफी का उपयोग कर तेजी से TEM सीरियल अनुभागके लिए एक विकल्प के रूप में कार्यरत है, और इस तकनीक का प्रमुख लाभ अपने गैर विनाशकारी तरीके और देखने के बड़े क्षेत्र है. इस तरह के डिक-SBEM और FIB-SEM के रूप में अन्य 3DEM तकनीकों के विपरीत, वर्गों एक coverslip, एक ITOलेपित कवरस्लिप, एक सिलिकॉन वेफर, या एक टेप पर संग्रहीत किया जा सकता है और बार-बार 7 छवि की जा सकती है।

APEX2 का उपयोग करने के लिए आसान है और विशेष उपकरणों के बिना धुंधला घनत्व की एक विस्तृत श्रृंखला दे सकते हैं, मिनी एकल ऑक्सीजन जनरेटर के विपरीत20 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन21 तकनीक, एक photooxidation के माध्यम से DAB वर्षा पैदा. इसके चर अनुप्रयोग नाभिक सहित कई सेलुलर organelles में परीक्षण किया गया है, प्लाज्मा झिल्ली, mitochondria मैट्रिक्स, mitochondrial cristae, ईआर, ट्यूबुलिन, और COS 7 और HEK293T सेल22में actin . तथापि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफों में आनुवंशिक रूप से एनकोडेड टैगिंग के उपयोग के लिए कुछ सीमाएँ और कई जाँच-चौकी हैं। exogenous जीन की अभिव्यक्ति के स्तर EM स्तर पर उचित धुंधला प्राप्त करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए क्योंकि अगर आनुवंशिक टैग की अभिव्यक्ति बहुत अधिक है, यह झूठी सकारात्मक संकेतों को प्रेरित कर सकते हैं और झिल्ली टूटना के माध्यम से कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर परेशान और उपकोशिकीय अंगएकत्र23| एक अन्य संभावित समस्या DAB overstaining है, जो धुंधलापन और झिल्ली विनाश22पैदा करने के लिए सूचित किया गया है. जीनों की उचित अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, DAB-stained कोशिकाओं की तुलना प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ईएम दोनों का उपयोग करके बेदाग कोशिकाओं से की गई थी (चित्र 2 और चित्र3)। इसके अतिरिक्त, स्थिरीकरण स्तर को यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से विनियमित किया जाना चाहिए कि अंतर्जात ऑक्सीडेस पूरी तरह से निष्क्रिय हैं। प्रसंस्करण के दौरान अंतर्जात oxidases से किसी भी कलाकृतियों को रोकने के लिए, हम अलग और छर्रों कोशिकाओं का उपयोग करने के बजाय कोशिकाओं की एक परत तय24. यह भी ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने में मदद की जब हम प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत DAB संकेत की जाँच की. इस प्रकार, हमारे परिणाम ों से संकेत मिलता है कि सेल मोनोलेयर्स का धुंधला और निर्धारण DAB धुंधला का उपयोग करके CLEM के लिए उपयोगी होते हैं(चित्र2)। सरणी टोमोग्राफी और 3 डी मॉडल के साथ धारावाहिक छवियों से पता चला कि ईआर-माइटोकोंड्रिटोक संपर्क साइटों अलग z-planes पर होते हैं (पूरक मूवी 2 और पूरक मूवी 3).. छवि पूरी कोशिकाओं में mitochondrial और ईआर नेटवर्क की एक पूरी 3 डी दृश्य पैदा करता है (पूरक मूवी 1)। यह पता चलता है 3 डी मात्रा विश्लेषण ईआर-mitochondria संपर्कों की मात्रात्मक तुलना के लिए आवश्यक है. जब intracellular organelles के जटिल नेटवर्क का अध्ययन, यह एक असाधारण उपयोगी तकनीक है.

अंत में, इस प्रोटोकॉल CLEM और 3DEM तकनीक है कि EM स्तर पर पूरे सेल जांच की अनुमति का एक कुशल संयोजन था. विशेष रूप से, एक ही समय में दो अलग अलग टैग और दो अलग organelles में DAB संकेत एक पूरे सेल में दिखाई दे रहे थे. इसके अलावा, बड़े पैमाने पर EM के कारण, एक ही अनुभाग में लेबल किए गए कक्षों और unlabeled कोशिकाओं की तुलना की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में, एन ब्लॉक धुंधला और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग टैग से DAB संकेतों को पूरी कोशिकाओं में झिल्ली organelles के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उपयोगी थे. यह अन्य सेलुलर बातचीत की जांच करने के लिए बड़े पैमाने पर EM के लिए एक उपयुक्त अनुप्रयोग हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अनुसंधान कोरिया मस्तिष्क अनुसंधान विज्ञान और आईसीटी (19-BR-01-08) द्वारा वित्त पोषित संस्थान के माध्यम से KBRI बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, और कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) कोरिया सरकार (MSIT) द्वारा वित्त पोषित अनुदान (नहीं. 2019R1A2C1010634. SCO1-APEX2 और HRP-KDEL plasmids कृपया ह्यून-वू री (सियोल राष्ट्रीय विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई. टीईएम डेटा KBRI में मस्तिष्क अनुसंधान कोर सुविधाओं में अधिग्रहण किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glutaraldehyde EMS 16200 Use only in fume hood
Paraformaldehyde EMS 19210 Use only in fume hood
Sodium cacodylate EMS 12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution EMS 16320 Use only in fume hood
Epon 812 EMS 14120 EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D Leica ARTOS 3D
Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
Lead citrate EMS 17900
35mm Gridded coverslip dish Mattek P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger Pelco easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid Ted Pella 01805-F
Hydrochloric acid SIGMA 258148
Fugene HD Promega E2311
Glycine SIGMA G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) SIGMA D8001 Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution Merck 107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate SIGMA P3289
0.22 um syringe filter Sartorius 16534
Thiocarbonyldihydrazide SIGMA 223220 Use only in fume hood
Potassium hydroxide Fluka 10193426
L-aspartic acid SIGMA A9256
Ethanol Merck 100983
Transmission electron microscopy FEI Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips SPI 06489-AB fragil glass
Isopropanol Fisher Bioreagents BP2618-1
Diamond knife Leica AT-4
Inveted light microscopy Nikon ECLipse TS100
Scanning electron microscopy Zeiss Auriga

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References

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जैव रसायन अंक 149 mitochondria ईआर APEX एचआरपी सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3DEM
Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
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Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria… More

Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59750, doi:10.3791/59750 (2019).

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