Bakterier kode ulike mekanismer for å engasjere seg i interbacterial konkurranse. Her presenterer vi en kultur-basert protokoll for karakteriserer konkurransedyktige interaksjoner mellom bakteriell isolerer og hvordan de påvirker den romlige strukturen i en blandet befolkning.
Dette manuskriptet beskriver en kultur BAS ert, coincubation analyse for å påvise og karakteriserer konkurrerende interaksjoner mellom to bakterie populasjoner. Denne metoden sysselsetter stabile plasmider som gjør at hver populasjon skal differensielt merket med distinkte antibiotikaresistens evner og fluorescerende proteiner for valg og visuell diskriminering av hver populasjon, henholdsvis. Her beskriver vi utarbeidelse og coincubation av konkurrerende Vibrio fischeri stammer, fluorescens mikroskopi Imaging, og kvantitativ dataanalyse. Denne tilnærmingen er enkel, gir raske resultater, og kan brukes til å avgjøre om en befolkning dreper eller hemmer veksten av en annen befolkning, og om konkurransen er formidlet gjennom et ekstremt molekyl eller krever direkte celle-celle kontakt. Fordi hver bakterie befolkning uttrykker et annet fluorescerende protein, tillater analysen den romlige diskriminering av konkurrerende populasjoner i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metodene utføres med symbiotisk bakterien V. fischeri ved hjelp av betingelser som er optimalisert for denne arten, kan protokollen tilpasses for de fleste culturable bakteriell isolat.
Dette manuskriptet skisserer en kultur-basert metode for å avgjøre om to bakterielle isolerer er i stand til konkurransedyktige interaksjoner. Når man studerer blandede populasjoner, er det viktig å vurdere i hvilken grad bakteriell isolerer samhandle, spesielt om isolat er direkte konkurrerer gjennom forstyrrelser mekanismer. Interferens konkurransen refererer til interaksjoner der en befolkning direkte hemmer veksten eller dreper en konkurrent befolkning1. Disse interaksjoner er viktig å identifisere fordi de kan ha dyptgripende virkninger på en mikrobiell samfunnets struktur og funksjon2,3.
Mekanismer for mikrobiell konkurranse har blitt oppdaget grovt i genomer av bakterier fra ulike miljøer, inkludert både vert-assosiert og fri-levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En rekke konkurranse strategier har blitt beskrevet10,11 , inkludert ekstremt mekanismer, slik som bakteriedrepende kjemikalier1,12 og skilles ut antimikrobielle peptider13 , i tillegg til kontakt avhengige mekanismer som krever celle kontakt for å overføre en hemmende effektor til målcellene9,14,15,16,17 ,18.
Selv om kultur-baserte coincubations brukes ofte i mikrobiologi5,8,19, dette manuskriptet skisserer hvordan du bruker analysen til å karakterisere mekanismen av konkurransen, samt forslag for å tilpasse protokollen for bruk med andre bakteriearter. Videre beskriver denne metoden flere tilnærminger for å analysere og presentere data for å svare på ulike spørsmål om arten av konkurrerende interaksjoner. Selv om teknikkene som beskrives her ble brukt tidligere til å identifisere interbacterial drap mekanismen underliggende intraspesifikk konkurranse mellom symbiotisk stammer av coisolated Vibrio fischeri bakterier19, de er egnet for mange bakterielle arter, inkludert miljømessige isolerer og menneskelige patogener, og kan utnyttes til å evaluere både kontakt-avhengige og ekstremt konkurransedyktige mekanismer. Trinn i protokollen kan kreve optimalisering for andre bakterielle arter. Gitt at flere modellsystemer utvider sine studier utover bruk av isogenic organismer å inkludere ulike genotyper10,16,20,21, vil denne metoden være en verdifull ressurs for forskere som søker å forstå hvordan konkurransen påvirker multi-stamme eller multi-arter systemer.
Den coincubation analysen beskrevet ovenfor gir en kraftig metode for å oppdage interbacterial konkurranse. Denne tilnærmingen er tillatt for identifisering av intraspesifikk konkurranse mellom V. fischeri isolerer og karakterisering av konkurranse mekanismen19. Selv om metoden beskrevet var optimalisert for den marine bakterien V. fischeri, kan det enkelt endres for å imøtekomme andre bakterielle arter, inkludert klinisk og miljømessige isolerer. Det er viktig å merke seg …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke anmeldere for deres hjelpsomme tilbakemeldinger. A.N.S. ble støttet av Gordon og Betty Moore Foundation gjennom Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |