हम परिपत्र आरएनए पैदा करने वाले रिपोर्टर जीन का क्लोन और विश्लेषण करते हैं। ये रिपोर्टर जीन रैखिक स्प्लिसिंग का विश्लेषण करने और अलु तत्वों को नियंत्रित करने के लिए निर्माण से बड़े होते हैं। परिपत्र आरएनए की जांच करने के लिए, निर्माण कोशिकाओं में ट्रांस्फ होते हैं और जिसके परिणामस्वरूप आरएनए का विश्लेषण रैखिक आरएनए को हटाने के बाद आरटी-पीसीआर का उपयोग करके किया जाता है।
रैखिक mRNAs के अलावा, कई यूकेरियोटिक जीन परिपत्र आरएनए उत्पन्न करते हैं। अधिकांश परिपत्र आरएनए एक प्री-एमआरएनए के भीतर एक अपस्ट्रीम 3 ‘ स्प्लिस साइट के साथ 5 ‘ स्प्लिस साइट में शामिल होने से उत्पन्न होते हैं, जो बैक-स्प्लिसिंग नामक प्रक्रिया है। यह परिपत्रीकरण पूर्व-एमआरएनए में माध्यमिक संरचनाओं द्वारा सहायता प्राप्त है जो स्प्लिस साइटों को निकट निकटता में लाते हैं। मानव जीन में, Alu तत्वों को इन माध्यमिक आरएनए संरचनाओं को बढ़ावा देने के लिए सोचा जाता है, क्योंकि Alu तत्व प्रचुर मात्रा में होते हैं और पूर्व-एमआरएनए में विपरीत दिशाओं में मौजूद होने पर एक दूसरे के साथ आधार पूरकता प्रदर्शित करते हैं। यहां, हम बड़े, Alu तत्व है कि परिपत्र RNAs फार्म युक्त की पीढ़ी और विश्लेषण का वर्णन । क्लोनिंग प्रोटोकॉल के अनुकूलन के माध्यम से, 20 केबी डालने की लंबाई के साथ रिपोर्टर जीन उत्पन्न किया जा सकता है। सह-ट्रांसफेक्शन प्रयोगों में उनका विश्लेषण नियामक कारकों की पहचान की अनुमति देता है। इस प्रकार, यह विधि परिपत्र आरएनए गठन में शामिल आरएनए दृश्यों और सेलुलर घटकों की पहचान कर सकती है।
सर्कुलर आरएनए
परिपत्र आरएनए (सीआईआरसीआरएनए) को सहसंयोजक रूप से बंद कर दिया जाता है जो अधिकांश जीवों में व्यक्त किए जाते हैं। वे एक अपस्ट्रीम 5 ‘ स्प्लिस साइट में शामिल होने से उत्पन्न होते हैं, जो बैक-स्प्लिसिंग(चित्रा 1ए)1नामक प्रक्रिया है। पूर्व-एमआरएनए में दृश्य जो 30-40 एनटी के रूप में आधार पूरक प्रदर्शन करते हैं, सिरआरएनए गठन2के लिए उचित संरेखण में वापस आते हैं। मनुष्यों में, एलू तत्व1,जीनोम3के लगभग 11% का प्रतिनिधित्व करते हैं, अपने स्वयं-पूरकता4,5 के कारण प्री-एमआरएनए में व्यापक डबल फंसे आरएनए संरचनाएं बनाते हैं और इस प्रकार सर्क्रैना1के गठन को बढ़ावा देते हैं।
वर्तमान में, सर्करना के तीन प्रमुख कार्यों का वर्णन किया गया है। कुछ सर्करनास माइक्रोआरएनए (मिरना) को बांधते हैं और मिआरएनए स्पंज6की तरह ज़ब्ती अधिनियम के माध्यम से। सर्क्रोनास को ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन में फंसाया गया है, जो रैखिक स्प्लिसिंग7 या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एक्टिविटी8के मॉड्यूलेशन के साथ प्रतिस्पर्धा के माध्यम से है । अंत में, सर्कर्न में कम खुले पढ़ने के फ्रेम होते हैं और सिद्धांत अध्ययनों का प्रमाण बताता है कि उनका अनुवाद9,10किया जा सकता है। हालांकि, सबसे सर्करों का कार्य रहस्यपूर्ण बना हुआ है। परिपत्र RNAs के बहुमत अगली पीढ़ी अनुक्रमण तरीकों11का उपयोग कर पता लगाया गया है । लक्षित आरटी-पीसीआर दृष्टिकोणों का उपयोग करके व्यक्तिगत जीन के विस्तृत विश्लेषण से पता चलता है कि बड़ी संख्या में परिपत्र आरएनए की खोजकीजानी बाकी है ।
पूर्व-एमआरएनए प्रसंस्करण का विश्लेषण करने के लिए रिपोर्टर जीन का उपयोग
डीएनए रिपोर्टर से प्राप्त एमआरएनए का विश्लेषण कोशिकाओं में ट्रांससंक्रमित निर्माण वैकल्पिक पूर्व-एमआरएनए स्प्लिसिंग का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, जिसे परिपत्र आरएनए पर लागू किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, वैकल्पिक एक्सोन, इसके आसपास के इंट्रोन, और संविलियन एक्सोन को परिलक्षित किया जाता है और एक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया जाता है। अक्सर, इंट्रोन छोटा हो जाता है। निर्माण यूकेरियोटिक कोशिकाओं में ट्रांस्पर होते हैं और आमतौर पर आरटी-पीसीआर13,14द्वारा विश्लेषण किया जाता है । इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर उपयोग नियामक स्थलों और सह -ट्रांसफेक्शन प्रयोगों 13,15,16,17,18में ट्रांस-एक्टिंग कारकों को मैप करने के लिए किया गया है । इसके अलावा, प्रोटीन व्यक्त करने वाले मिनीजीन की पीढ़ी को उन पदार्थों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दी गई जो वैकल्पिक स्प्लिसिंग19,20को बदलते हैं।
विधि परिपत्र आरएनए पर लागू किया गया है। वर्तमान में, साहित्य में कम से कम 12 मिनीजीन बैकबोन का वर्णन किया गया है और तालिका 1में संक्षेप में शामिल किया गया है। टीआरएनए आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली21,22के अपवाद के साथ, वे सभी बहुलक द्वितीय प्रमोटरों पर निर्भर हैं। यहां, हम परिपत्र आरएनए की पीढ़ी में शामिल सीआईएस और ट्रांस-एक्टिंग कारकों को निर्धारित करने के लिए मानव रिपोर्टर मिनीजीन उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। प्रकाशित रिपोर्टर जीन23 के दृश्यों का उपयोग करने वाली विधि का अवलोकन चित्रा 1में दिखाया गया है ।
सामान्य तौर पर, परिपत्र आरएनए कम प्रचुर मात्रा मेंहोतेहैं, जो उनके कार्य और गठन के अध्ययन को जटिल बनाता है। रैखिक आरएनए13के समान, रिपोर्टर मिनीजीन का उपयोग सीआईएस और ट्रांस-एक्टिंग का?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को रक्षा विभाग डीओडी ग्रांट AZ180075 द्वारा समर्थित किया गया था। स्टीफन पुंटम धन्यवाद जैकलिन नोआन एंडोमेंट । अन्ना Pawluchin DAAD, जर्मन अकादमिक विनिमय कार्यक्रम द्वारा समर्थित था, जस्टिन आर वेल्डन केंटकी मैक्स स्टेकलर पुरस्कार के विश्वविद्यालय के एक प्राप्तकर्ता था ।
(PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |