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Biochemistry

使用含有微型基因的Alu元素来分析圆形RNA

doi: 10.3791/59760 Published: March 10, 2020

Summary

我们克隆和分析生成圆形RNA的记者基因。这些报告基因大于构造,用于分析线性拼接并包含Alu元素。为了研究圆形RNA,构造被转染到细胞中,在去除线性RNA后使用RT-PCR分析产生的RNA。

Abstract

除了线性 mRNA 之外,许多真核基因产生圆形 RNA。大多数圆形RNA是通过将5'拼接位点与上游3'拼接位点在mRNA前结合而生成的,这个过程称为回拼接。这种循环可能得益于mRNA前的二级结构,这些结构使拼接点非常接近。在人类基因中,Alu元素被认为能促进这些二次RNA结构,因为Alu元素非常丰富,并且在mRNA前以相反方向存在时,表现出彼此的基础互补性。在这里,我们描述了大型Alu元素的生成和分析,该元素包含构成圆形RNA的记者基因。通过优化克隆协议,可以生成插入长度高达20kb的分子基因。他们在联合转染实验中的分析可以识别监管因素。因此,该方法可以识别与循环RNA形成有关的RNA序列和细胞成分。

Introduction

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循环 RNA
圆形RNA(环RNA)是同价关闭的单滞留RNA,在大多数生物体中表达。它们通过将下游5'拼接站点连接到上游3'拼接站点生成,这个过程称为反拼接(图1A)1在mRNA前序列,显示基础互补短为30-40nt,使回拼接位点在适当的对齐循环RNA形成2。在人类中,Alu元素1,约占基因组3的11%,由于自身互补4、5,在mRNA前形成广泛的双链RNA结构,从而促进RNA1的形成。

目前,已经描述了环环境的三大功能。一些环RNA结合微RNA(miRNA),并通过封存行为像miRNA海绵6。循环RNA已涉及转录和后转录调节,通过竞争与线性拼接7或修改转录因子活动8。最后,循环RNA包含短的开放阅读框架和原理证明研究表明,他们可以翻译9,10。然而,大多数环苯A的功能仍然是神秘的。大多数循环RNA已经使用下一代测序方法11检测到。使用有针对性的RT-PCR方法对单个基因进行详细分析后发现,仍有大量圆形RNA有待发现。

使用记者基因分析mRNA前处理
从DNA报告器中提取的mRNA分析构造转染成细胞是研究替代预mRNA拼接的成熟方法,可应用于圆形RNA。一般来说,替代外子、其周围突长和构成外子被放大并克隆成真核表达向量。通常,缩内缩器会缩短。这些结构被转染成真核细胞,通常由RT-PCR13,14进行分析。该方法已被广泛用于绘制监管拼接站点和转效因子在联合转染实验13,15,16,17,18。此外,蛋白质表达微型基因的产生允许筛选改变替代拼接19,20的物质。

该方法已应用于圆形RNA。目前,至少有12个微型基因骨干在文献中进行了描述,并被汇总在表1中。除了基于tRNA的表达系统21,22,他们都依赖于聚合酶II启动子。在这里,我们描述了一种生成人类报告器微基因的方法,以确定循环RNA生成所涉及的cis和跨作用因子。图1显示了使用已发布报告基因23序列的方法的概述。

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Protocol

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1. 结构设计

  1. 使用UCSC基因组浏览器24来识别循环RNA形成所需的重复元素,并将其纳入结构。重要的是,扩增的引素需要超出重复元素。
  2. 将圆形RNA序列(补充图1是测试序列)粘贴到https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start并选择正确的有机体。提交序列并转到浏览器视图,缩小 1.5 倍或根据需要(图2A)。
    注: 搜索序列显示在上一行(图 2A,1)。根据圆形RNA中外子的顺序,BLAT 不会连接所有外子。在此示例中,exon 12(图2A,4)未连接到 11(图 2A,2,3),因为 exon 12 是圆 RNA 序列中 exon 11 的上游(补充图 1)。重复元素位于"重复遮罩"轨道中,由框表示,其中黑色到灰色表示进化保护(图 2A,5)。
  3. 鼠标悬停重复元素,以在浮动窗口中标识其子类型。Alu元件位于 SINE(短穿插核元件)线中。如果获取了与图 2不同的图片,请使用窗口下方的"默认轨道"按钮重置浏览器。
    注:在基因显示中对外子进行修剪会生成一个窗口,其中有计算机生成的外显数字。这些数字与文献中确立的外音编号不对应,并且也在等同之间变化。

2. 选择要在表达式矢量中克隆的序列

  1. 下载窗口中显示的DNA序列,前往UCSC基因组浏览器顶端的"查看 + DNA"。"排序格式"选项中,选择"扩展案例/颜色选项"。
  2. 选择默认大小写为"下部",然后选择NCBI refseq的切换大小写。为"重复遮罩"选择下划线和粗体和斜体。单击"提交"。将外名作为大写字母,顶号作为小写字母。检查 exon/intron 边框。
  3. 在此示例中,有一个"ccctttacCTTT"序列,指示浏览器显示反向补数。如果是这种情况,请返回并选择反向补补框,直到看到正确的前子 intron 边框 (agEXONgt),在此示例中为 AAAAAAgaagg。
  4. 以正确的方向复制文件(内部外显子被 intronic ag...gt) 到文字处理文档中,并突出显示外显子(补充图 2)。
    注:在此示例中,包含外子 9-12 的基因组片段约为 24 kb,因此太大,无法从基因组 DNA 中放大。因此,每个被大约 1 kb 的内电子区域包围的外子被单独放大,这四个片段被组装在克隆载体中。
  5. 选择要放大的片段(exon = 500 nt intron)。确保 intron 不会在重复区域中开始或结束,因为这些区域的引素不会放大特定序列。所选区域如图 2 B所示,其序列显示在补充图 3中。
    注: 通常,构造越大,克隆的难度就越大。片段可以进行分步组装(即,exon 9 与矢量结合,在下一步中,exon 10 通过克隆引入此构造,直到所有外子都到位),或者,所有片段同时组装。循序渐进的方法始终有效,但需要更多时间。同时组装并不总是工作,取决于从基因组DNA放大单个片段的多少以及结构的总体大小。因此,我们通常同时从这两种方法开始。

3. 设计克隆入门

  1. 使用 Web 工具(https://nebuilder.neb.com/#!/) 设计用于克隆的引素。例如,将片段 9、10、11 和 12 以及矢量序列(补充图 3)输入到此工具。
  2. 对于矢量序列,将插入位点添加为最后一个核苷酸,然后添加片段。由于矢量编号不以给定的插入站点开头,因此位于矢量中的插入位点,并将下游部分置于上游序列的前面。在此示例中,插入直接在 HindIII [AAGCTT] 站点之后开始,并在 pcDNA3.1 的 PmeI [GTTTAAAC] 站点之后直接结束。从cccgctgatcag的顺序...ccgtaaaaaggccgc 粘贴在 pcDNA3.1 序列(gttgctggggttttcc )的位置 1 前面。
  3. 如果熔点相距超过 4°C,则调整底漆,因为它们在放大时不起作用。设计的碎片和引漆序列的组装显示在补充图 4中。克隆的引素也可以手动设计25。

4. PCR 和放大酚检测

  1. 标准 PCR 反应:使反应组合,每次反应的总体积为 50 μL。以下是使用聚合酶 1 进行一次反应的配方:
    10 μL 5x 反应缓冲器
    1 μL 10 mM dNTP
    2.5 μL 10 μM 正向引漆
    2.5 μL 10 μM 反向引底剂
    0.5 μL 聚合酶 1
    32.5 μL 无核酸核酸 H2O
    1. 如果产品 GC 含量高,则选择添加 10 μL 的 5x GC 增强剂;制作一个包含GC增强剂的单独组合,以测试PCR反应。
  2. 每个反应样品的混合物的阿利quot 49 μL到PCR管中。
  3. 将1 μL的DNA添加到PCR中,其量范围从10皮克到1纳克。
  4. 向下旋转样品以去除侧面的残留物,并将其放入 PCR 机器中。优化 PCR 条件时,请使用与机器中的相同点相同的机器。

5. 优化用于不同聚合器的较长DNA片段

  1. 温度
    1. 优化远程聚合酶 2。
      1. 使用较低的变性温度(聚合物酶 1:98 °C,聚合酶 2:94 °C)。
      2. 使用较长的变性时间(聚合物酶 1:10 s,聚合酶 2:30 s)。
      3. 使用较长的退火时间(聚合物酶 1:30 s,聚合酶 2:60 s)。
      4. 使用更长的延长时间(聚合物酶 1:30 s/kb,聚合酶 2:50 s/kb)。
      5. 使用较低的延长温度(聚合物酶 1:72 °C,聚合酶 2:65 °C)。
      6. 使用低于底漆 Tm 的 5 °C 的退火温度。
    2. 优化引底器浓度(比原始底漆浓度低 5 倍到 5 倍)。优化DNA浓度从10 pg到50pg,100 pg,1ng,5 ng,10 ng。
    3. 作为PCR程序的例子,使用聚合酶2放大15 kb的产品尺寸,在94°C下进行30秒的初始变性,在94°C下进行DNA变性,30秒,随后在58°C下退火30秒,DNA在65°C下延长12分钟30秒。在 65 °C 下执行最终延长 10 分钟,最后保持 4 °C。
      注:根据基于网络的温度计算确定的引物的退火温度 (Ta), 这些温度是每个聚合酶所特有的。如果片段大于 10 kb,扩展时间可能会有所不同,需要优化。
  2. 延长时间和DNA浓度
    1. 对于超过 6 kb 的 DNA 片段,使用更长的扩展时间:每 1 kb 1 分钟。较长的片段应该使用更少的DNA。
    2. 执行DNA稀释,以找到扩增的最佳DNA浓度,通常1 pg至1 ng的质粒或1ng至1μg的基因组DNA。
      注:对于大多数克隆使用聚合酶1,通过将Sso7dDNA结合域与专有的热稳定DNA聚合酶26熔化。聚合酶具有低误差率,由于Sso7d域具有高处理性,需要放大大型(10-15 kb)基因组片段。由于这个较大的片段大小,DNA分子27的酶组装用于插入载体,因为这种方法不需要限制性酶。聚合酶1使超过15kb的片段的扩增变得越来越困难。对于大型片段扩增,使用聚合酶2由锥虫球菌制成的,类似隔板的校对聚合酶融合到Sso7d或长距离PCR套件,然而,提供更高的错误率。

6. 用于克隆的PCR产品净化

  1. 在含有交位核酸染色的1%琼脂糖凝胶上运行一半的PCR产品(例如,1x GelGreen)。在深色读取器转照器上可视化染色凝胶。这种染色的DNA不能照大小运行。
    注:GelGreen异化成DNA,类似于溴化铀,但它被大约500nm(青色)的光所激发,这种波长不会损害DNA,这极大地改善了克隆。
  2. 同时,在1%的凝胶上运行一半的PCR产品,这种凝胶在运行后沾染了溴化乙酸乙酰胺(图3A,B)。
  3. 从染色凝胶(步骤 6.1)中去除适当尺寸的带,并使用凝胶和 PCR 清理套件分离 DNA。与标准协议不同,在双蒸馏水中仅20μL的DNA,通常DNA浓度较低。
  4. 在克隆之前,检查琼脂糖凝胶上的分离DNA的浓度和完整性(图3B)。瞄准 2:1 摩尔插入到矢量比。使用多个插入时,比率为 2:2:2:1。

7. DNA组装和克隆检测

注:克隆使用酶DNA组装试剂盒完成,稍作修改。组装在50°C下执行60分钟,通常较低的DNA范围用于组装(20-100 fmol/20 μL反应)。整个反应混合物被添加到化学能力细胞中,整个细胞在6厘米的加盘上镀出。

  1. 将矢量结合,在 10 μL 的水中插入 1:2 摩尔比(每个 20-500 fmol)。
  2. 加入10μL的DNA组装主混合。
  3. 在50°C下孵育样品60分钟。
  4. 接下来,使用总装配反应转换主管细胞。在这里,使用大肠杆菌菌株1细胞进行较短的构造,或将大肠杆菌菌株2细胞用于更长或不稳定的构造。细胞应为 50 μL 体积。
  5. 在冰上解冻细胞,将2μL的冷冻组装产品添加到合格细胞中。轻轻轻拂管 4-5 次混合。不要涡流。
  6. 让混合物在冰上坐30分钟。
  7. 在 42 °C 下加热冲击 30 s。不要混合。
  8. 将管子移回冰中 2 分钟。
  9. 将 950 μL 的室温 SOC 介质添加到管中。
  10. 在37°C下孵育反应管60分钟。大力摇动(300 rpm)。
  11. 在37°C孵育期间,使用适当的抗生素加热选择板。
  12. 通过离心(10,000 x g,30s)将细胞进行颗粒,并在两个选择板上将 1/4 和 3/4 的细胞板挖出,并在 37°C 下孵育过夜。

8. 克隆的验证

  1. 使用聚落 PCR,使用跨越装配场的 PCR 引漆 (图 1C) 进行检测。
  2. 取无菌牙签,触摸单个细菌菌群。
  3. 用有菌落的牙签触摸 PCR 管的底部,然后将牙签条纹在抗生素加盘上,在 37°C 或室温下孵育条纹板,以便一夜之间进行敏感构造。
  4. 用含有检测底漆的PCR混合物覆盖PCR管与菌群接触。这些是使用引底器3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计的。该程序可以选择使用"[ccc]"符号强制跨定义序列进行引漆设计,以在整个装配结中选择引漆。正菌株的DNA通过测序进行分离和验证。

9. 循环RNA表达报告基因分析

  1. 为了进行分析,将分源基因转体到真核细胞中。在这里,使用HEK293细胞(ATTC#CRL-1573),因为它们具有高转染效率。为了节省成本,请使用爱德华王子岛(聚乙烯胺)解决方案。
  2. 对于爱德华王子岛溶液,在低pH2的水中溶解1毫克/m升的线性聚氯二甲胺盐酸(PEI)。将 pH1 与 NaOH 一起提起到 7。带 0.22 μm 过滤器的无菌过滤器,储存在 4 °C。
  3. 将细胞分成六口(每口约15万个细胞),让细胞在DMEM介质中10%的FBS中过夜生长。
  4. 在无菌管中对记者基因的1 μg添加200μL的无菌过滤150 mM NaCl。通过涡旋与DNA混合。
  5. 将 PEI 溶液添加到此混合和涡流中,短暂离心以收集管底的样品。每3μL的爱德华王子岛使用1μg的DNA比。
  6. 在室温下孵育10分钟,然后直接添加到HEK 293细胞中。
  7. 在37°C,5%CO2下孵育HEK293细胞,过夜。
  8. 通过RNA分离试剂盒分离RT-PCR的RNA。

10. RNase R 处理,去除线性 RNA

  1. 在无Nase管中使用10μg的总RNA。
  2. 将10 μL的10xRNase R缓冲液(0.2 M三聚三酯-HCl(pH 8.0)、1 M KCl、1 mM MgCl2)添加到RNA中。
  3. 将RNase R添加到RNA(1μl = 20U)。
  4. 在RNA中加入1μL乙二醇蓝色,用无菌水使体积高达100μL。
  5. 在37°C孵育样品30分钟。
  6. 加入100μL的酚/氯仿和涡旋1分钟。
  7. 在 21,000 x g下离心 1 分钟,以分离相位。
  8. 取上清液(水相),加入1体积(约80μL的氯仿)。
  9. 涡旋1分钟,然后离心1分钟,以分离相。
  10. 以超清剂为例,加入1:10伏KAc和2.5伏乙醇,并在-20°C沉淀1-4小时。在4°C下全速离心机30分钟(21,000 x g)。底部会有一个小的蓝色颗粒。
  11. 取出上清液,用80%乙醇清洗。让空气在室温下干燥5分钟,溶解在10μL水中。

11. RT-PCR分析

  1. 每次RT反应使用1 μg的RNA。
  2. 使反应混合,每次反应的最终总体积为20μL。对于一次反应,使用 1 μL 的 10 mM dNTP、1 μL 0.1 M 二硫硫醇 (DTT)、4 μL 的 5 x 第一链缓冲液和 0.5 μL 的反向转录酶。
  3. 将反应混合物的 6.5 μL 注入新的 PCR 管。
  4. 混合多达 5 个底漆。但是,某些引素可能与 PCR 中的其他引素不匹配(图5)。引漆序列在表2中。我们经常使用基因特异性外子结引质,但使用随机hexamers也是可能的。
  5. 将 1 μL 的 10 μM 反向引底剂添加到所需的 RT 反应管中。
  6. 在PCR反应管中加入1μg的RNA。
  7. 加入无R纳塞H2O,总体积为20μL。
  8. 向下旋转管,以去除管侧的残留物,并放置在热循环器中。
  9. 在50°C下在热循环器中运行RT反应50分钟。
  10. 将 RT cDNA 储存在 -20°C 或继续 PCR 反应。

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Representative Results

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报告基因允许确定影响循环RNA形成的调节因子。然而,这些报告基因很大,并且含有经常使DNA构造不稳定等重复性元素。由于其大尺寸,通常需要删除部分的内科,这是通过放大基因组片包含外子和较小的侧翼在电子部分。这些DNA片段是酶组装的,允许结构不受限制的酶。

从微管相关蛋白tau (MAPT) 生成的圆形RNA示例显示了微基因方法分析圆形RNA的应用。本例中使用的tau 9_12微型基因与不同的拼接因子共同转染,RT-PCR检测出这些拼接因子的影响(图6)。不同的转效因子影响循环RNA和线性预mRNA的形成。实验还表明,循环RNA形成所需的所有序列元素在克隆片段中是局部的。

Figure 1
图 1:技术概述。A) 显示一个假设基因。英特龙是线条,外子是盒子,Alu元素是较小的条纹框。从外子 C 到 A 的背裂会产生一个圆形 RNA。这种圆形RNA的结构显示在面板(E) 中。(B) 为了创建一个报告基因,外子和周围的内特罗(每侧至少 500 nt)被放大。构造应包含重复元素,这些元素通常是人类中的Alu元素。包括exon A的外子,以提供额外的Alu元素。基因组碎片将与其侧翼25个t.重叠。(C) 片段被克隆成表达式向量,由 CMV 分子驱动。成功的重组通过检测引物检测,并通过测序进行验证。(D) 单元格通过此构造进行转染。(E) 圆形RNA是分离的,并且 (F) 使用循环RNA特异性引素,更可取的外子结底漆进行扩增.在PCR扩增期间,线性RNA也可以被放大(G)。G) 用于检测圆形 RNA 的引素方向。正向引底器处于感觉方向(即,与RNA具有相同的序列),反向引底器处于反感觉方向(即RNA的反向补品)。请注意,与线性 mRNA 的 RT-PCR 不同,反向引底器是正向引底器的上游。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图 2:选择微基因构造序列。A补充图 1中显示的序列使用 BLAT 对人类基因组数据库运行后,浏览器显示。文献外文数字36在基因显示中显示,它们与浏览器给出的数字不同。
1. 对齐的序列显示在"YourSeq"下
2-4. 请注意,由于RNA的圆度,BLAT 不会像线性 RNA 那样将所有外子与线连接。Exons 10 和 11(对应于 2 和 3)已连接,但 exon 12(对应于 4)未连接到 exon 11。
5. Alu元素显示在重复元素轨道中。
B) 计划构造与基因组DNA之间的序列对齐。
6. 计划构造使用 BLAT 针对数据库运行。
7. 请注意,在构造中包含了几个Alu元素。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图 3:克隆前安培的实例。A) 优化的 PCR 产品分离在含有 1x 凝胶绿的 1% 琼脂糖凝胶上。各个波段表示将用于酶DNA组装的 PCR 产品。(B) 从 (A) 的带子从凝胶中切出并纯化。纯化PCR产品在1%的琼脂胶上分离,随后沾上了溴化二苯。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4:对报告人基因的限制分析。tau 9-12 微型基因用作示例,用指示排除主要重组的限制性酶进行切割。车道 1: 切割与 NcoI 预期尺寸 735 bp, 3345 bp, 6266 bp, 车道 2 切割与 XbaI 预期大小 10346 bp, 车道 3 切割与 HindIII 预期尺寸 3951 bp, 6395 bp, 车道 4 切割与 SmaI 预期尺寸 1168 bp, 1688 bp, 2708 bp, 4782 bp.

Figure 5
图5:引素多路复用和R酶R处理对循环RNA检测的影响。A) 从人类脑组织中提取的样本A和B的cDNA被放大与圆形RNA底漆环Tauexon12_10反向和环陶exon10_11前进。cDNA 的反向转录是使用线性和圆形 tau RNA 的底漆进行的。与 tau 圆形 RNA 对应的预期带由三角形显示。其他强带是与人类基因组不匹配的工件。(B) 实验在相同的PCR条件下重复进行,但反向转录只使用环Tauexon12_10反向引漆进行。只有预期波段被放大和验证通过测序。(C) RNA 与去除线性RNA的 RNase R 进行处理。循环RNA在治疗后可检测到(左图),而线性RNA不再发出可检测信号(右),请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 6
图6:循环RNA报告基因分析实例。1 μg的tau 9_1237报告基因被转染1μg的拼接因子指示。RNA在转染后分离24小时,并通过RT-PCR进行分析。(A) 线性 tau mRNA 的放大。由于外子的另类拼接 10 两个波段被观察到。由于拼接因子的表达过度,它们的比例发生了变化38,39。B) 扩增圆 12~10 tau RNA23。注意tau环RNA表达对一些拼接因子的表达的依赖性,尤其是激酶clk2和SR蛋白9G8等cdc2。(C) HIPK3 的圆形RNA用作指示载荷相等的正控制。请点击此处查看此图形的较大版本。

表1:表示循环RNA的当前微型基因列表。请点击此处下载此文件。

圆形 HIPK3 控制引漆
HIPK3 反向
HIPK3 前进
TGCTTGTACTTTTTTC
TCGGCCAGTATATAAA
线性引素
陶埃森 12 反向
陶埃森 9 前锋
CCCATCTTACTGACTC
TGTCAAGTCCAAGCGGCT
圆形引素
环exon12_10反向
circTau exon10_11 前进
卡奇塔塔塔塔茨特茨
加格格格格加格特格茨加阿

表2:引素列表。

Supplemental Figure 1
补充图1:Tau圆形RNA测试序列。MAPT位点的圆形RNA对应的测试序列。不同的外线用下划线、小帽和大写字母表示。请点击此处查看此图形的较大版本。

Supplemental Figure 2
补充图2:包含计划微基因的基因组序列。Exon 以颜色突出显示,重复元素以下划线、斜体和粗体显示。灰色底化表示可用于生成引物的低复杂性的侧翼区域。请点击此处下载此文件。

Supplemental Figure 3
补充图3:计划报告人基因的序列。显示了载体序列和计划基因组片段。请点击此处下载此文件。

Supplemental Figure 4
补充图 4:装配的引版设计。补充图 3 中的序列已输入生成器工具。请点击此处查看此图形的较大版本。

Supplemental Figure 5
补充图 5:tau 9->12 报告器基因的序列作为示例。请点击此处下载此文件。

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Discussion

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一般来说,圆形RNA是低丰1,这使得研究其功能和形成复杂化。与线性RNA13类似,使用报告器微基因可以识别调节圆形RNA形成的cis和跨作用因子。因此,这种方法产生假设,可以使用内源基因进一步测试。

最关键的步骤是记者基因的设计。DNA片段的酶组装("吉布森克隆"27)有助于这种设计,因为它允许构建独立于限制位点的大型报告基因。

后拼接位点通过侧翼反转重复结合在一起,在记者基因构造时应考虑这一点。重复在基因组浏览器"重复轨道"中进行了说明,选择它们显示它们的方向。请记住,蛋白质还可以强制背拼接位点进入圆形RNA表达28所需的二次结构,并应研究无偏不倚分析1-2 kb的侧翼在电子区域。

为了确保结构的稳定性,一个重要的考虑因素是细菌菌株的类型及其生长条件。对于较短、简单的构造,使用标准克隆细菌,它几乎与 DH5-α (huA2 +(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 _80 μ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 相同。对于包含 6 个以上Alu元素的较长片段, 使用"稳定"能力细胞,缺乏重组酶 (recA) 和内核酶 (endA1) (F' proA_B+ lacIq _(lacZ)M15 zzf:Tn10 (TetR)[(ara-leu) 7697 araD 139 fhuA _lacX74 galK16 galE15 e14- #80dlacZ _M15 recA1 relA1 nupG rpsL (StrR)rph spoT1 (mrr-hsdRMS-mcrBC)。如果重组出现问题(由低转化计数指示),将转化的细菌盘在两个板上,并分别使其生长在30 oC和37 oC。由于微型基因中存在许多重复元素,因此需要使用下一代测序进行完全测序,按 2019 年速率,每粒质大约 150 美元。示例的顺序显示在补充图 5中。此外,常规执行限制片段长度多态性分析,以进行新的较大构造准备。例如,使用切割 1-4 次的站点会产生一个排除重新组合的特征带模式(图 4)。应选择酶,提供可在琼脂胶凝胶上分离的片段的特征带模式。

使用与背注事件重叠的外子结引底器使用 RT-PCR 分析圆形 RNA(图 1F)。由于RNA的循环性质,反向(即反义)底漆是正向(即感觉)引素的上游(1G)。检测大量表达的正域相互作用蛋白激酶3(HIPK3)循环RNA1的引底剂被用作正控制。HIPK3和微型基因特异性反向引底器反向转录在同一管中,从而允许它们进行比较。PCR 反应使用底漆进行,放大线性 mRNA,以比较圆形和线性前 mRNA 的处理模式。当线性和圆形RNA的引素混合时,我们经常观察到异常带(图5),从而将这些样本的反向转录分开。

圆形RNA的RT-PCR分析具有挑战性,需要仔细控制。虽然敏感和方便,它可以产生独特的圆形RNA29的工件。反向转录酶可以在RNA圆周围移动几次,从而产生串联。大多数循环RNA报告基因产生圆形和线性RNA,可以交叉杂交,导致更多的PCR工体21,30,31。因此,有必要对PCR产品进行测序,并使用使用北印布32或RNase保护23使用不同的技术验证发现。

不明原因的带也可以源于线性RNA的异常扩增。线性RNA可以使用外泌酶RNase R去除,它丰富了圆形RNAAs33(5C)。RNase R 处理有助于检测引素的初始优化,通常在优化引素后通常可以省略。

替代的背拼接也有助于不明原因的带,因为多个圆形RNA可以从基因组位点34形成。这种替代反拼接通常是由两个以上倒重复元件形成的相互竞争的mRNA前结构的结果。此外,神秘的后拼接场可能发生32,35。根据实验目标,Alu元素可以重复或添加到构造中。反拼接位点的互补区域可短至30-40 nt35,以较短的互补区域替换Alu元素可增加循环RNA形成2,经测试可改善循环RNA形成。一旦确定了导致反拼接的mRNA前序列,就可以缩短循环RNA表达构造,从而在某些情况下提高转染效率。

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Disclosures

没什么可透露的

Acknowledgments

这项工作得到了国防部国防部授予AZ180075的支持。斯特凡·斯塔姆感谢杰奎琳·努南捐赠。安娜·帕卢钦得到了德国学术交流项目DAAD的支持,贾斯汀·韦尔登是肯塔基大学马克斯·斯特克勒奖的获得者。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main

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References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19, (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159, (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12, (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42, (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22, (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427, (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27, (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9, (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47, (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42, (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41, (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32, (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160, (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32, (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66, (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29, (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10, (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15, (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26, (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28, (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17, (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs. Nature. 457, (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74, (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18, (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21, (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68, (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66, (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67, (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15, (3), 611-624 (2016).
使用含有微型基因的<em>Alu</em>元素来分析圆形RNA
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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).More

Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).

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